未分化型鼻咽癌中MMP-9表达与淋巴结转移及预后的关系 基金项目
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基金项目:本课题受深圳市龙岗区科技计划项目资助(NO:200160)
【摘要】 目的 探讨未分化型鼻咽癌(UCNT)组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达与肿瘤淋巴结转移及预后的关系。方法 应用免疫组织化学检测46例鼻咽未分化癌病例标本MMP-9表达情况。结果 淋巴结转移组MMP-9的阳性率为82.4%(28/34)，无淋巴结转移组MMP-9的阳性率为41.7%(5/12)。统计分析表明，MMP-9的表达与淋巴结转移呈正相关(P<0.01)。MMP-9高表达患者的生存时间低于MMP-9低表达患者(P<0.05)。结论 检测UCNT的MMP-9的表达有助于鼻咽癌的辅助诊断和预后判断。
关键词 鼻咽癌 基质金属蛋白酶 免疫组织化学
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)10-0876-02
, http://www.100md.com Relationship between the expression of matrix metalloproteinase-9
and lymphnodes metastasis and prognosis in undifferentiated
carcinoma of nasopharyngeal type
Zhao Yong，Xiong Danning，Zeng Qingfu
Department of Pathology，Shenzhen Longgang Center Hospital，Shenzhen518116.
【Abstract】 Objective To study the relationship between the expression ofmatrix metalloproteinase-9(MMP-9)and lymph nodes metastasis and prognosis in undifferentiated carcinoma of nasopharyngeal type.Methods The immunohistochemicalmethod was used to detect the expression ofMMP-9in46pathological specimen of nasopharynˉgeal carcinoma.Results Positive rate of MMP-9with lymph nodes metastasis was82.4%(28/34)，the other withˉout lymph nodes metastasis was41.7(5/12).Statistical analysis demonstrsted that the expression ofMMP-9had posˉitive correlation with lymph nodes metastasis(P<0.01).Survival time in patients with high expression of MMP-9was longer than that in patients with low expression.Conclusion The expression of MMP-9may be used to assist diagnosis and predict prognosis.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal carcinoma matrix metalloproteinase immunohistochemistry
鼻咽癌是我国华南地区常见的恶性肿瘤之一，鼻咽癌患者的预后与肿瘤细胞的生物学行为密切相关。目前认为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)在肿瘤的发生发展及侵袭转移过程中起着重要作用。有关基质金属蛋白酶在鼻咽癌中的表达及其与淋巴结转移和预后的关系尚未见报道。本文应用免疫组化方法观察基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在鼻咽未分化癌组织的表达情况，探讨其与鼻咽癌淋巴结转移及预后的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集我院及外院鼻咽病理活检标本，经三位病理学家确诊为鼻咽癌未分化型，共46例。男29例，女17例，平均年龄42岁。随访日期从患者手术日期计算，以患者死亡时间终止。对照组为鼻炎慢性炎症28例。石蜡块行4μm厚连续切片3张，1张行HE染色复查诊断，另2张行免疫组化检测。
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1.2 免疫组织化学染色 采用SP法，DAB染色。即用型鼠抗人MMP-9单克隆抗体、超敏SP(鼠)免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物公司。具体染色步骤参照说明书进行，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。按着色范围及强度判断结果。主要步骤简述如下:常规脱蜡、水化，3%双氧水去除内源性过氧化物酶，枸橼酸盐缓冲液行微波抗原修复，正常羊血清封闭，滴加MMP-9单克隆抗体后4℃过夜;滴加生物素标记的二抗IgG，室温10min，滴加链霉亲和素-过氧化物酶10min，DAB染色，苏木精对比染色，中性树胶封固。
1.3 结果判断标准 以细胞浆和(或)细胞膜出现棕黄色颗粒、染色强度高于背景非特异性染色者为阳性。每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，观察阳性细胞染色强度，计数阳性细胞百分数。按着色细胞百分数记分:着色细胞<10%为0分;10%～40%为1分;40%～70%为2分;≥70%为3分。按着色强度积分:无着色为0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分。将着色细胞百分数记分与着色强度记分相乘，总记分0分为阴性(-);1～3分为弱阳性(+);4分以上为强阳性(++)。
, 百拇医药
1.4 统计学方法 采用t检验。
2 结果
2.1 鼻咽癌组织中MMP-9的表达 MMP-9在癌旁正常鼻咽粘膜上皮低水平表达，MMP-9阳性表达定位于癌细胞胞质和(或)胞膜。46例UCNT中MMP-9总阳性率71.7%(33/46)，其中弱阳性28.3%(13/46)，强阳性43.5%(20/46)。
2.2 鼻咽癌组织中MMP-9的表达与淋巴结转移的关系 见表1。淋巴结转移组MMP-9的阳性率为82.4%(28/34)，无淋巴结转移组MMP-9的阳性率为41.7%(5/12)。统计分析表明MMP-9的表达强度与淋巴结转移显著相关(P<0.01)，即表达越强，越易发生淋巴结转移。
2.3 MMP-9表达与患者预后的关系 见表2。MMP-9低表达(阴性和弱阳性)患者术后平均生存期为81.2个月，MMP-9高表达(强阳性)患者术后平均生存期为48.4个月，二者相比较差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
表1 未分化型鼻咽癌组织MMP-9表达与淋巴结转移的关系
3 讨论
恶性肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞、宿主细胞及细胞外基质(Extractcellular matrix ECM)间系列复杂、多步骤相互作用的结果。癌的侵润转移过程极为复杂，大致为:(1)血管生成。(2)癌细胞从原发灶脱落。(3)与细胞外基质(包括基膜)发生粘附并使之降解。(4)穿越血管壁进入循环并到达远处部位。(5)在继发部位不断增殖形成转移灶。研究表明，肿瘤细胞的浸润与转移首先需发生基膜的降解。癌细胞与基膜的相互作用可分为三个阶段，即吸附、基质溶解和移动。第一步即癌细胞与基膜表面的整合素受体及各种非整合素受体结合;吸附后肿瘤细胞即直接或诱导宿主细胞分泌酶类，降解基膜和细胞外基质，而ECM降解主要集中在靠近肿瘤细胞表面。最后肿瘤细胞沿着缺损的基膜向周围浸润。癌细胞与正常细胞、细胞外基质间的粘附及细胞外基、基膜的降解被认为是恶性肿瘤侵袭的先决条件。肿瘤与ECM的相互作用存在于癌浸润的各个阶段，在这个过程中基质金属蛋白酶(MMPs)发挥了重要作用 [1] 。基质金属蛋白酶是一个依赖锌离子的肽链内切酶基因家族，目前已发现17种，几乎可以降解ECM的所有成分。依其底物特异性和结构，MMPs基因家族可分为胶原酶类、明胶酶类、基质分解素类、膜性MMPs类及其他MMPs。MMP-9也称明胶酶或IV型胶原酶，分子量为92kD。MMP-9可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、明胶等多种底物，而Ⅳ型胶原构成基膜的主要支架。因此其在肿瘤发生发展及侵袭过程中起着非常重要的作用。
, 百拇医药
有文献报道，前列腺癌组织MMP-9的表达水平显著 高于良性前列腺增生，且MMP-9的表达与前列腺癌的临床分期密切相关，有局部浸润和转移的前列腺癌MMP-9表达水平明显高于无局部浸润转移的前列腺癌 [2] 。外阴癌组织MMP-9呈阳性表达 [3] 。乳腺癌组织亦有较高MMP-9表达 [4] ，而癌旁组织及良性纤维腺瘤增生的导管上皮大部分不表达，提示MMP-9与肿瘤的发生相关。本实验免疫组化结果表明MMP-9在癌周正常鼻咽粘膜上皮轻微表达，而癌细胞胞质和胞膜呈阳性和强阳性表达，提示MMP-9与鼻咽癌的发生发展相关联。本实验46例鼻咽癌中，34例淋巴结转移。淋巴结转移组MMP-9的阳性率为82.4%;无淋巴结转移组MMP-9的阳性率为41.7%(5/12)。统计学分析表明MMP-9的表达强度与淋巴结转移显著相关;MMP-9的表达与淋巴结转移呈正相关。
深入研究发现 [5] ，乳腺癌MMP-9的表达，与临床病理分级，淋巴结转移及预后复发无明显相关性。淋巴结转移的胃癌患者胃癌组织和血浆总MMP-9及活性MMP-9水平与无淋巴结转移者相比均无差异 [6] 。而本实验表明，MMP-9高表达的鼻咽癌患者术后平均生存期明显少于低表达着，差异存在显著性，且MMP-9蛋白表达与淋巴结转移密切相关，实验结果与文献报道有矛盾。Remacle等认为MMP-9在不同肿瘤间的表达差异，可能与检测方法与试验材料的不同有关。也有研究认为 [7～9] ，MMPs的表达状况与基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的活性调节密切相关，恶性肿瘤组织MMPs的表达受TIMPs表达调控，单一MMPs表达水平的高低并不能预测恶性程度和评估预后，需同时检测TIMPs的表达。因此，MMP-9的表达能否被用来准确评价恶性肿瘤病人的预后，尚有待于进一步研究和探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 Maeta H，Ohgi S，Terada T.Protein expression of matrix metalloproˉteinase2and9tissue inhibitors of metalloproteinase1and2in papillary thyroid carcinoma.Virchows Arch，2001，438(2):121-128.
2 WoodM，Fudge K，Mohler J L，et al.In situ hybridization studies of metˉalloproteinases2and9and TIMP-1and TIMP-2expression in huˉman prostate cancer.ClinExp Metastasis，1997，15:246-258.
, 百拇医药
3 Johansson N，Vaalamo M，Grenman S，et al.Collagenase-3(MMP-13)is expressed by tumor cells in invasive vulvar squamous cell carciˉnoma.Am J Pathol，1999，154(2):469.
4 Remacle AG，Noel A，Duggan C.Assay of matrix metalloproteinases type1，2，3and9in breast cancer.Br J Cancer，1998，77:926.
5 袁莲香，何伟民，张斌，等.乳腺癌组织MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白表达与肿瘤的转移及预后.肿瘤，2002，22(4):294-296.
6 陈美芳，季峰，厉有名.胃癌患者基质金属蛋白酶-9检测及其意义.浙江医学，2002，24(9)515-516.
, 百拇医药
7 Ogata Y，Miura K，Ohakita A，et al.Imblance between matrix metalloˉproteinase9and tissue inhabitor of metalloproteinases1expression by tumor cells implicated in liver metastasis from colorectal carcinom.Kuˉrume Med J，2001，48(3):211.
8 Zeng Z，Sun Y，Shu w，et al.Tissue inhabitor of metalloproteinase-3is a basement membrane-associated protein that is significantly decreased in human colorectal cancer.Dis Colon Rectum M，2001，44(9):1290.
9 Groft LL，Muzik H，Rewcastle NB.Differential expression and localizaˉtion of TIMP-4in human gliomas.Br JCancer，2001，85(1):55.
作者单位:518116广东省深圳市龙岗中心医院(病理科，五官科)
410078湖南长沙中南大学湘雅医学院病理学教研室
(编辑曲 全), 百拇医药
【摘要】 目的 探讨未分化型鼻咽癌(UCNT)组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达与肿瘤淋巴结转移及预后的关系。方法 应用免疫组织化学检测46例鼻咽未分化癌病例标本MMP-9表达情况。结果 淋巴结转移组MMP-9的阳性率为82.4%(28/34)，无淋巴结转移组MMP-9的阳性率为41.7%(5/12)。统计分析表明，MMP-9的表达与淋巴结转移呈正相关(P<0.01)。MMP-9高表达患者的生存时间低于MMP-9低表达患者(P<0.05)。结论 检测UCNT的MMP-9的表达有助于鼻咽癌的辅助诊断和预后判断。
关键词 鼻咽癌 基质金属蛋白酶 免疫组织化学
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)10-0876-02
, http://www.100md.com Relationship between the expression of matrix metalloproteinase-9
and lymphnodes metastasis and prognosis in undifferentiated
carcinoma of nasopharyngeal type
Zhao Yong，Xiong Danning，Zeng Qingfu
Department of Pathology，Shenzhen Longgang Center Hospital，Shenzhen518116.
【Abstract】 Objective To study the relationship between the expression ofmatrix metalloproteinase-9(MMP-9)and lymph nodes metastasis and prognosis in undifferentiated carcinoma of nasopharyngeal type.Methods The immunohistochemicalmethod was used to detect the expression ofMMP-9in46pathological specimen of nasopharynˉgeal carcinoma.Results Positive rate of MMP-9with lymph nodes metastasis was82.4%(28/34)，the other withˉout lymph nodes metastasis was41.7(5/12).Statistical analysis demonstrsted that the expression ofMMP-9had posˉitive correlation with lymph nodes metastasis(P<0.01).Survival time in patients with high expression of MMP-9was longer than that in patients with low expression.Conclusion The expression of MMP-9may be used to assist diagnosis and predict prognosis.
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Key words nasopharyngeal carcinoma matrix metalloproteinase immunohistochemistry
鼻咽癌是我国华南地区常见的恶性肿瘤之一，鼻咽癌患者的预后与肿瘤细胞的生物学行为密切相关。目前认为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)在肿瘤的发生发展及侵袭转移过程中起着重要作用。有关基质金属蛋白酶在鼻咽癌中的表达及其与淋巴结转移和预后的关系尚未见报道。本文应用免疫组化方法观察基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在鼻咽未分化癌组织的表达情况，探讨其与鼻咽癌淋巴结转移及预后的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集我院及外院鼻咽病理活检标本，经三位病理学家确诊为鼻咽癌未分化型，共46例。男29例，女17例，平均年龄42岁。随访日期从患者手术日期计算，以患者死亡时间终止。对照组为鼻炎慢性炎症28例。石蜡块行4μm厚连续切片3张，1张行HE染色复查诊断，另2张行免疫组化检测。
, http://www.100md.com
1.2 免疫组织化学染色 采用SP法，DAB染色。即用型鼠抗人MMP-9单克隆抗体、超敏SP(鼠)免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物公司。具体染色步骤参照说明书进行，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。按着色范围及强度判断结果。主要步骤简述如下:常规脱蜡、水化，3%双氧水去除内源性过氧化物酶，枸橼酸盐缓冲液行微波抗原修复，正常羊血清封闭，滴加MMP-9单克隆抗体后4℃过夜;滴加生物素标记的二抗IgG，室温10min，滴加链霉亲和素-过氧化物酶10min，DAB染色，苏木精对比染色，中性树胶封固。
1.3 结果判断标准 以细胞浆和(或)细胞膜出现棕黄色颗粒、染色强度高于背景非特异性染色者为阳性。每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，观察阳性细胞染色强度，计数阳性细胞百分数。按着色细胞百分数记分:着色细胞<10%为0分;10%～40%为1分;40%～70%为2分;≥70%为3分。按着色强度积分:无着色为0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分。将着色细胞百分数记分与着色强度记分相乘，总记分0分为阴性(-);1～3分为弱阳性(+);4分以上为强阳性(++)。
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1.4 统计学方法 采用t检验。
2 结果
2.1 鼻咽癌组织中MMP-9的表达 MMP-9在癌旁正常鼻咽粘膜上皮低水平表达，MMP-9阳性表达定位于癌细胞胞质和(或)胞膜。46例UCNT中MMP-9总阳性率71.7%(33/46)，其中弱阳性28.3%(13/46)，强阳性43.5%(20/46)。
2.2 鼻咽癌组织中MMP-9的表达与淋巴结转移的关系 见表1。淋巴结转移组MMP-9的阳性率为82.4%(28/34)，无淋巴结转移组MMP-9的阳性率为41.7%(5/12)。统计分析表明MMP-9的表达强度与淋巴结转移显著相关(P<0.01)，即表达越强，越易发生淋巴结转移。
2.3 MMP-9表达与患者预后的关系 见表2。MMP-9低表达(阴性和弱阳性)患者术后平均生存期为81.2个月，MMP-9高表达(强阳性)患者术后平均生存期为48.4个月，二者相比较差异有显著性(P<0.05)。
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表1 未分化型鼻咽癌组织MMP-9表达与淋巴结转移的关系
3 讨论
恶性肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞、宿主细胞及细胞外基质(Extractcellular matrix ECM)间系列复杂、多步骤相互作用的结果。癌的侵润转移过程极为复杂，大致为:(1)血管生成。(2)癌细胞从原发灶脱落。(3)与细胞外基质(包括基膜)发生粘附并使之降解。(4)穿越血管壁进入循环并到达远处部位。(5)在继发部位不断增殖形成转移灶。研究表明，肿瘤细胞的浸润与转移首先需发生基膜的降解。癌细胞与基膜的相互作用可分为三个阶段，即吸附、基质溶解和移动。第一步即癌细胞与基膜表面的整合素受体及各种非整合素受体结合;吸附后肿瘤细胞即直接或诱导宿主细胞分泌酶类，降解基膜和细胞外基质，而ECM降解主要集中在靠近肿瘤细胞表面。最后肿瘤细胞沿着缺损的基膜向周围浸润。癌细胞与正常细胞、细胞外基质间的粘附及细胞外基、基膜的降解被认为是恶性肿瘤侵袭的先决条件。肿瘤与ECM的相互作用存在于癌浸润的各个阶段，在这个过程中基质金属蛋白酶(MMPs)发挥了重要作用 [1] 。基质金属蛋白酶是一个依赖锌离子的肽链内切酶基因家族，目前已发现17种，几乎可以降解ECM的所有成分。依其底物特异性和结构，MMPs基因家族可分为胶原酶类、明胶酶类、基质分解素类、膜性MMPs类及其他MMPs。MMP-9也称明胶酶或IV型胶原酶，分子量为92kD。MMP-9可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、明胶等多种底物，而Ⅳ型胶原构成基膜的主要支架。因此其在肿瘤发生发展及侵袭过程中起着非常重要的作用。
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有文献报道，前列腺癌组织MMP-9的表达水平显著 高于良性前列腺增生，且MMP-9的表达与前列腺癌的临床分期密切相关，有局部浸润和转移的前列腺癌MMP-9表达水平明显高于无局部浸润转移的前列腺癌 [2] 。外阴癌组织MMP-9呈阳性表达 [3] 。乳腺癌组织亦有较高MMP-9表达 [4] ，而癌旁组织及良性纤维腺瘤增生的导管上皮大部分不表达，提示MMP-9与肿瘤的发生相关。本实验免疫组化结果表明MMP-9在癌周正常鼻咽粘膜上皮轻微表达，而癌细胞胞质和胞膜呈阳性和强阳性表达，提示MMP-9与鼻咽癌的发生发展相关联。本实验46例鼻咽癌中，34例淋巴结转移。淋巴结转移组MMP-9的阳性率为82.4%;无淋巴结转移组MMP-9的阳性率为41.7%(5/12)。统计学分析表明MMP-9的表达强度与淋巴结转移显著相关;MMP-9的表达与淋巴结转移呈正相关。
深入研究发现 [5] ，乳腺癌MMP-9的表达，与临床病理分级，淋巴结转移及预后复发无明显相关性。淋巴结转移的胃癌患者胃癌组织和血浆总MMP-9及活性MMP-9水平与无淋巴结转移者相比均无差异 [6] 。而本实验表明，MMP-9高表达的鼻咽癌患者术后平均生存期明显少于低表达着，差异存在显著性，且MMP-9蛋白表达与淋巴结转移密切相关，实验结果与文献报道有矛盾。Remacle等认为MMP-9在不同肿瘤间的表达差异，可能与检测方法与试验材料的不同有关。也有研究认为 [7～9] ，MMPs的表达状况与基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的活性调节密切相关，恶性肿瘤组织MMPs的表达受TIMPs表达调控，单一MMPs表达水平的高低并不能预测恶性程度和评估预后，需同时检测TIMPs的表达。因此，MMP-9的表达能否被用来准确评价恶性肿瘤病人的预后，尚有待于进一步研究和探讨。
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参考文献
1 Maeta H，Ohgi S，Terada T.Protein expression of matrix metalloproˉteinase2and9tissue inhibitors of metalloproteinase1and2in papillary thyroid carcinoma.Virchows Arch，2001，438(2):121-128.
2 WoodM，Fudge K，Mohler J L，et al.In situ hybridization studies of metˉalloproteinases2and9and TIMP-1and TIMP-2expression in huˉman prostate cancer.ClinExp Metastasis，1997，15:246-258.
, 百拇医药
3 Johansson N，Vaalamo M，Grenman S，et al.Collagenase-3(MMP-13)is expressed by tumor cells in invasive vulvar squamous cell carciˉnoma.Am J Pathol，1999，154(2):469.
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5 袁莲香，何伟民，张斌，等.乳腺癌组织MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白表达与肿瘤的转移及预后.肿瘤，2002，22(4):294-296.
6 陈美芳，季峰，厉有名.胃癌患者基质金属蛋白酶-9检测及其意义.浙江医学，2002，24(9)515-516.
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7 Ogata Y，Miura K，Ohakita A，et al.Imblance between matrix metalloˉproteinase9and tissue inhabitor of metalloproteinases1expression by tumor cells implicated in liver metastasis from colorectal carcinom.Kuˉrume Med J，2001，48(3):211.
8 Zeng Z，Sun Y，Shu w，et al.Tissue inhabitor of metalloproteinase-3is a basement membrane-associated protein that is significantly decreased in human colorectal cancer.Dis Colon Rectum M，2001，44(9):1290.
9 Groft LL，Muzik H，Rewcastle NB.Differential expression and localizaˉtion of TIMP-4in human gliomas.Br JCancer，2001，85(1):55.
作者单位:518116广东省深圳市龙岗中心医院(病理科，五官科)
410078湖南长沙中南大学湘雅医学院病理学教研室
(编辑曲 全), 百拇医药