SARS冠状病毒E蛋白基因克隆和分析
【摘要】 目的 克隆SARS冠状病毒的E蛋白基因，并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析。方法 通过RT-PCR，从SARS冠状病毒基因组中扩增得到特异性片段，利用TA克隆将PCR产物克隆入pUCm-T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析。结果 RT-PCR扩增出一特异产物与预期长度234bp相符，序列分析表明，其核苷酸序列所编码的氨基酸与已发表的44株SARS病毒(除一株外)的E蛋白基因同源性为100%。结论 成功克隆SARS冠状病毒E蛋白基因，为该基因的表达及功能研究奠定了基础。
关键词 SARS冠状病毒 E蛋白 基因克隆
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)11-0965-02
Cloning and sequence analysis the envelope protein gene of
, http://www.100md.com
the SARS coronavirus
Zhang Hongqin，Wu Shuzhen，Bi Yuntian，et al.
Molecular Biology Research Centre of Wenzhou Medical College，Zhejiang325027.
【Abstract】 Objective To clone and analysize the envelope protein gene of the SARS coronavirus.Methods The envelope protein gene was obtained by PT-PCR from the SARS coronavirus genome.RT-PCR product was ligated into pUCm-T vevtor and sequenced. Results The cloned segment was234bp in length identical(except one)inamino acids level with the sequence of the envelope protein of44SARS genomes ingenebank data. Concluˉsion We cloned the envelope protein gene of the SARS coronavirus using RT-PCR which could be used for expresˉsion and function researches.
, 百拇医药
Key words SARS coronavirus envelope protein gene gene cloning
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)于2002年11月首先在我国广东省出现，可通过呼吸道等途径在人群间传播。引起症状为高热、干咳、呼吸窘迫综合征等，严重可致呼吸衰竭、死亡 [1] 。至2003年8月，该病已在32个国家和地区发生8422例，死亡916例，给人类的健康和安全带来严重威胁 [2] 。病原学研究表明，SARS病原为一种新型冠状病毒，2003年4月13日，加拿大首先完成该病毒全基因组测序并公开于GenBank数据库(AY274119)。本文利用DNA重组技术，对E蛋白基因进行克隆和序列分析，为进一步开展该基因的结构和功能研究奠定了基础。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 SARS病毒RNA基因组 SARS病毒株序号为21170，由香港中文大学提供。
1.2 逆转录反应 按逆转录试剂盒(Promeag公司)中的步骤将SARS病毒RNA基因组逆转录成cDNA。
1.3 PCR扩增 引物序列:5′-CGAATTCATGTACTˉCATTCGTTTCGGAAG-3′，5′-GTTGTCGACCGTT ˉTAGACCAGAAGATCAGGA-3′;反应体系50μl，内含0.2μmol/L引物，200μmol/L dNTPs，lxTaq缓冲液，1.5mmo/L MgCl 2 ，1U Taq聚合酶(MBI公司)，2μl cDNA。用UNOⅡ型扩增仪(Biometra公司)按下述条件进行PCR反应:95℃ 10min，然后9℃40s，55℃40s，72℃40s，30个循环，最后一个循环72℃延伸10min。用6%PAG凝胶电泳检测PCR产物。
, 百拇医药 1.4 目的基因的克隆及筛选 PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒(Biobasic公司)纯化后与pUCm-T(Biobasic公司)连接并转化E。coli JM109感受态细胞，蓝白筛选阳性克隆，重组质粒用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后经6%PAG凝胶电泳鉴定。
1.5 序列的测定及蛋白质结构分析 将酶切鉴定的阳性克隆委托上海三博生物技术有限公司进行测序。所得序列通过Genbank的Blast程序进行同源性分析。用predict proˉtein软件进行蛋白质二级结构分析。
2 结果
2.1 PCR产物和克隆结果 PCR产物经6%PAG凝胶电泳检测见一特异扩增条带，其分子量大小与预期结果相符。重组质粒经酶切鉴定，与插入片段长度相符，见图1。
2.2 目的基因序列测定与同源性分析 测序结果见图2。Blast结果表明，我们克隆的SARS病毒E蛋白基因和已公布的44株SARS病毒E蛋白基因中的36株完全相同:TWY(AP006561.1)、TWS(AP006560.1)、TWK(AP006559.1)、TWJ(AP006558.1)、Taiwan TC2(AY338175.1)、Taiwan TC3(AY348314.1)这6株台湾的SARS病毒E蛋白基因的148bp处由G突变成A，这是一个同义突变;GZ01(AY278489.2)株的222bp处由C突变成T，氨基酸由Val变成Met;Shanghai QXC(AY322199.1)株的33bp处由A突变成G，169bp处由A突变成G，都是同义突变。
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2.3 SARS病毒E蛋白结构预测 见图3。
3 讨论
SARS冠状病毒是一种单链(+)RNA病毒，基因组序列全长约29.7kb，带有5′端CAP和3′端PolyA，包括S蛋白(spike glycoprotein)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(enveˉlope protein)和N蛋白(uncleocapsid protein)四个基本结构蛋白基因，一个RNA聚合酶基因(orflab)，及orf3、orf4、orf7、orf8、orf9、orf10、orf11、orf13和orf14九种未知功能的开放阅读框架(SARS-CoVTOR2，AY274119)，其中orf4与E蛋白基因重叠 [3] 。
SARS病毒E蛋白是包膜蛋白，存在于SARS病毒的包膜上，参与SARS病毒包膜的形成，但是否是病毒复制所必需，还有待于进一步的研究。本文根据SARS-CoV TOR2株(AY274119)的E蛋白基因序列设计引物，从SARS病毒21170株的RNA基因组中用RT-PCR技术获得E蛋白的DNA片段，将其连接到pUCm-T vector并测序。测序结果进行基因序列同源性分析表明:E蛋白基因与GENBANK中的绝大部分SARS病毒株的E蛋白完全同源，少数发生同义突变，一个有义突变(GZ01，AY278489.2)发生在跨膜区，但都是非极性氨基酸，不影响跨膜区的构象和性质;blast结果还表明，SARS病毒E蛋白与其他冠状病毒的E蛋白同源性很差，说明其进化过程与其他冠状病毒的E蛋白不同。 陈蕴佳等比较已公布的12个完整的SARS病毒基因组，共发现42处发生了突变，即平均0.7kb碱基有一个突变 [4] ;E蛋白的二级结构分析表明，有11～46、55～63两个螺旋区，49～51一个折叠区;跨膜区在13～40，位于一个螺旋区内;有NVSL(48)和NSSE(66)两个N糖基化位点，位于膜外。本研究的完成为进一步开展E蛋白的表达、纯化提供了可能，通过基因在体外表达的蛋白质，我们可进一步研究E蛋白的结构、功能，并制备单克隆抗体。
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(本文图片略)
参考文献
1 中国卫生部疾病控制司.非典型肺炎病例的临床诊断标准(执行).北京:2003.
2 世界卫生组织.世界卫生组织关于严重急性呼吸综合征的累计报告病例数[D/OL].[20030815]http://www.who.int/csr/sars/country/2003-08-15/en/
3 Marra MA，Jones SJ，Astell CR，et al.The genome sequence of the SARS-associated coronavirus.Science，2003，30，300(5624):1399-404.
4 陈蕴佳，高歌，鲍一明，等.SARS冠状病毒全基因组序列初步分析.遗传学报，2003，30(6):494-500.
作者单位:325027浙江温州医学院分子生物学研究中心
(编辑 守中), 百拇医药
关键词 SARS冠状病毒 E蛋白 基因克隆
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)11-0965-02
Cloning and sequence analysis the envelope protein gene of
, http://www.100md.com
the SARS coronavirus
Zhang Hongqin，Wu Shuzhen，Bi Yuntian，et al.
Molecular Biology Research Centre of Wenzhou Medical College，Zhejiang325027.
【Abstract】 Objective To clone and analysize the envelope protein gene of the SARS coronavirus.Methods The envelope protein gene was obtained by PT-PCR from the SARS coronavirus genome.RT-PCR product was ligated into pUCm-T vevtor and sequenced. Results The cloned segment was234bp in length identical(except one)inamino acids level with the sequence of the envelope protein of44SARS genomes ingenebank data. Concluˉsion We cloned the envelope protein gene of the SARS coronavirus using RT-PCR which could be used for expresˉsion and function researches.
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Key words SARS coronavirus envelope protein gene gene cloning
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)于2002年11月首先在我国广东省出现，可通过呼吸道等途径在人群间传播。引起症状为高热、干咳、呼吸窘迫综合征等，严重可致呼吸衰竭、死亡 [1] 。至2003年8月，该病已在32个国家和地区发生8422例，死亡916例，给人类的健康和安全带来严重威胁 [2] 。病原学研究表明，SARS病原为一种新型冠状病毒，2003年4月13日，加拿大首先完成该病毒全基因组测序并公开于GenBank数据库(AY274119)。本文利用DNA重组技术，对E蛋白基因进行克隆和序列分析，为进一步开展该基因的结构和功能研究奠定了基础。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 SARS病毒RNA基因组 SARS病毒株序号为21170，由香港中文大学提供。
1.2 逆转录反应 按逆转录试剂盒(Promeag公司)中的步骤将SARS病毒RNA基因组逆转录成cDNA。
1.3 PCR扩增 引物序列:5′-CGAATTCATGTACTˉCATTCGTTTCGGAAG-3′，5′-GTTGTCGACCGTT ˉTAGACCAGAAGATCAGGA-3′;反应体系50μl，内含0.2μmol/L引物，200μmol/L dNTPs，lxTaq缓冲液，1.5mmo/L MgCl 2 ，1U Taq聚合酶(MBI公司)，2μl cDNA。用UNOⅡ型扩增仪(Biometra公司)按下述条件进行PCR反应:95℃ 10min，然后9℃40s，55℃40s，72℃40s，30个循环，最后一个循环72℃延伸10min。用6%PAG凝胶电泳检测PCR产物。
, 百拇医药 1.4 目的基因的克隆及筛选 PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒(Biobasic公司)纯化后与pUCm-T(Biobasic公司)连接并转化E。coli JM109感受态细胞，蓝白筛选阳性克隆，重组质粒用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后经6%PAG凝胶电泳鉴定。
1.5 序列的测定及蛋白质结构分析 将酶切鉴定的阳性克隆委托上海三博生物技术有限公司进行测序。所得序列通过Genbank的Blast程序进行同源性分析。用predict proˉtein软件进行蛋白质二级结构分析。
2 结果
2.1 PCR产物和克隆结果 PCR产物经6%PAG凝胶电泳检测见一特异扩增条带，其分子量大小与预期结果相符。重组质粒经酶切鉴定，与插入片段长度相符，见图1。
2.2 目的基因序列测定与同源性分析 测序结果见图2。Blast结果表明，我们克隆的SARS病毒E蛋白基因和已公布的44株SARS病毒E蛋白基因中的36株完全相同:TWY(AP006561.1)、TWS(AP006560.1)、TWK(AP006559.1)、TWJ(AP006558.1)、Taiwan TC2(AY338175.1)、Taiwan TC3(AY348314.1)这6株台湾的SARS病毒E蛋白基因的148bp处由G突变成A，这是一个同义突变;GZ01(AY278489.2)株的222bp处由C突变成T，氨基酸由Val变成Met;Shanghai QXC(AY322199.1)株的33bp处由A突变成G，169bp处由A突变成G，都是同义突变。
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2.3 SARS病毒E蛋白结构预测 见图3。
3 讨论
SARS冠状病毒是一种单链(+)RNA病毒，基因组序列全长约29.7kb，带有5′端CAP和3′端PolyA，包括S蛋白(spike glycoprotein)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(enveˉlope protein)和N蛋白(uncleocapsid protein)四个基本结构蛋白基因，一个RNA聚合酶基因(orflab)，及orf3、orf4、orf7、orf8、orf9、orf10、orf11、orf13和orf14九种未知功能的开放阅读框架(SARS-CoVTOR2，AY274119)，其中orf4与E蛋白基因重叠 [3] 。
SARS病毒E蛋白是包膜蛋白，存在于SARS病毒的包膜上，参与SARS病毒包膜的形成，但是否是病毒复制所必需，还有待于进一步的研究。本文根据SARS-CoV TOR2株(AY274119)的E蛋白基因序列设计引物，从SARS病毒21170株的RNA基因组中用RT-PCR技术获得E蛋白的DNA片段，将其连接到pUCm-T vector并测序。测序结果进行基因序列同源性分析表明:E蛋白基因与GENBANK中的绝大部分SARS病毒株的E蛋白完全同源，少数发生同义突变，一个有义突变(GZ01，AY278489.2)发生在跨膜区，但都是非极性氨基酸，不影响跨膜区的构象和性质;blast结果还表明，SARS病毒E蛋白与其他冠状病毒的E蛋白同源性很差，说明其进化过程与其他冠状病毒的E蛋白不同。 陈蕴佳等比较已公布的12个完整的SARS病毒基因组，共发现42处发生了突变，即平均0.7kb碱基有一个突变 [4] ;E蛋白的二级结构分析表明，有11～46、55～63两个螺旋区，49～51一个折叠区;跨膜区在13～40，位于一个螺旋区内;有NVSL(48)和NSSE(66)两个N糖基化位点，位于膜外。本研究的完成为进一步开展E蛋白的表达、纯化提供了可能，通过基因在体外表达的蛋白质，我们可进一步研究E蛋白的结构、功能，并制备单克隆抗体。
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(本文图片略)
参考文献
1 中国卫生部疾病控制司.非典型肺炎病例的临床诊断标准(执行).北京:2003.
2 世界卫生组织.世界卫生组织关于严重急性呼吸综合征的累计报告病例数[D/OL].[20030815]http://www.who.int/csr/sars/country/2003-08-15/en/
3 Marra MA，Jones SJ，Astell CR，et al.The genome sequence of the SARS-associated coronavirus.Science，2003，30，300(5624):1399-404.
4 陈蕴佳，高歌，鲍一明，等.SARS冠状病毒全基因组序列初步分析.遗传学报，2003，30(6):494-500.
作者单位:325027浙江温州医学院分子生物学研究中心
(编辑 守中), 百拇医药