消积饮联合华蟾素对小鼠Lewis肺癌细胞周期的影响
【摘要】 目的 揭示消积饮联合华蟾素对小鼠Lewis肺癌细胞周期的作用机制。方法将Lewis肺癌细胞接种在50只C 57 BL/6小鼠皮下，把小鼠随机分成消积饮组、华蟾素组、消积饮联合华蟾素组、环磷酰胺组和生理盐水组，每组10只，分别给予消积饮灌胃，华蟾素、环磷酰胺和生理盐水腹腔灌注，给药7天后处死，测定各组小鼠的皮下瘤重，计算抑瘤率，并运用流式细胞仪分析各组小鼠肿瘤细胞周期各时相分布的状况。结果 消积饮组、华蟾P素组、消积饮联合华蟾素组的皮下瘤重较生理盐水组低(P<0.01)，抑瘤率分别是32.28%、42.86%、47.32%。消积饮组的肿瘤细胞G 0 /G 1 期细胞比例增高，华蟾素组的肿瘤细胞S期细胞比例增高，两药联合组的肿瘤细胞G 0 /G 1 期、S期细胞比例较生理盐水组均有所增高。结论 消积饮、华蟾素对小鼠Lewis肺癌均具有抑瘤作用，两药联合可进一步抑制瘤体生长。
关键词 消积饮 华蟾素 Lewis肺癌 抑瘤率 细胞周期 流式细胞术
, http://www.100md.com
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)06-0481-03
Synergistic anti-cancer effects and mechanisms of Xiaoji Decoction
plus Huachansu on Lewis lung cancer cell in mice
Chai Xiaoshu，Wu Wanyin，Xu Kai，et al.
Department of Cancer，Second Clinical Medical Hospital，
Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangdong510120.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To explore the inhibitory effects and mechanisms of Xiaoji Decoction plus Huachansu on the growth of cell in mices bearing Lewis lungcancer.Methods Fifty duplicated mices bearing Lewis lung cancer were randomly broken into control gruop，cyclophosphamide group，Xiaoji Decoction group，Huachansu group，Xiaoji Decoction plus Huachansu group and normal saline group.Each group included ten mices.Normal saline(0.2ml)，cyclophosphamide group(30mg/kg)and Huachansu group(5ml/kg)were infused into paunch respectively in three groups，Xiaoji Decoction group(0.2ml)were infused from esophagus into stomach in one group，and Xiaoji-decocˉtion plus Huachansu group were conducted with XiaojiDecoction(0.2ml)and Huachansu(5ml/kg)meanwhile.The weights of tumor tissueswere measured，the tumor inhibitory rates were calculated and compared among five groups of mices.The growth cycles of Lewis lung cancer cell line of every group were analyzed with flow cytometry.Results The tumor inhibitory rates of Xiaoji Decoction，Huachansu and combination groups were32.28%，42.86%，47.32%，respectively.Compared with normal saline group，the differences of the tumor inhibitory rates were statistically(P<0.01).The percentage of G 0 /G 1 phase of cell cycle increased in Xiaoji Decoction group and the percentage of S phase increased in Huachansu group，and the combination group increased both in G 0 /G 1 and S phases.Conclusion Xiaoji Decoction and Huachansu both have inhibitory effect on lung cancer and it demonstrate that a Xiaoji Decocˉtion plus Huachansu combination would be more effective.
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Key words Xiaoji Decoction Huachansu Lewis lung cancer tumor inhibitory rates cell cycle flow cyˉtometry
“消积饮”口服液是广东省名老中医刘伟胜教授针对肺癌的病因病机，总结其30多年的肺癌临床诊疗经验所创建的中药方剂，具有补肺益肾、解毒消瘀、化痰散结的作用，已经在临床应用治疗肺癌十余年，显示了较好的疗效。已有实验表明，消积饮可通过阻滞肺癌细胞周期的G 0 /G 1 期起到抗癌作用。华蟾素是中药蟾蜍皮制剂的抗肿瘤中药，具有驱除癌毒、消积定痛、软坚散结功效。华蟾素能够有效地阻止肿瘤细胞周期于S期，使其不能进入S期进行DNA复制，从而抑制小鼠Lewis肺癌的生长。针对两药对肺癌细胞周期不同阻滞点作用的机制，在本实验中，我们使用消积饮联合华蟾素抑制小鼠Lewis肺癌的生长，并对两药作用于肿瘤细胞不同周期的协同抗癌机制进行了研究。
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1 材料与方法
1.1 动物与瘤株 体重20±2g、雌雄各半，6～8周龄的C 57 BL/6小鼠50只由第一军医大学动物中心提供;Lewis肺癌瘤株由广州中医药大学肿瘤研究所提供。
1.2 药物 CTX由上海华联制药有限公司生产。消积饮:主要成分含黄芪、补骨脂、云芝、大黄、白花蛇舌草、莪术、全蝎、蜈蚣等，由广州中医药大学第二附属医院药剂科提供。华蟾素:淮北生化制药厂生产。
1.3 实验方法 于广州中医药大学肿瘤研究所实验室中，无菌操作，取小鼠Lewis肺癌单细胞悬液，用生理盐水调制细胞悬液浓度至1×10 7 /ml，每鼠右腋窝下接种0.2ml。接种次日将小鼠随机分成5组按以下给药:阴性对照组:0.2ml NS，I.P，qd×7d;CTX治疗组:CTX，30mg/kg体重，I.P，qd×7d;消积饮治疗组:消积饮，0.2ml，P.O，qd×7d;华蟾素治疗组:华蟾素，5ml/kg体重，I.P，qd×7d;消积饮+华蟾素治疗组:消积饮，0.2ml，P.O+华蟾素，5ml/kg体重，I.P，qd×7d。
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1.4 计算瘤重及抑瘤率 停药次日使用颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离腋窝皮下肿瘤，去除血污、脂肪等，用电子天平称量体重及瘤重，根据以下公式计算抑瘤率:抑瘤率%=(1-治疗组瘤重/阴性对照组瘤重)×100%。
1.5 细胞周期的观察 剥取部分新鲜肿瘤组织，PBS漂洗，浸泡，剪碎，混合，过滤，离心，再过滤，离心，75%的乙醇固定，Coulter-DNA-Prep Reagents Kit进行碘化丙啶(PI)染色，Coulter Co.Ltd.的EPS型流式细胞仪进行分析。
1.6 统计分析方法 采用SPSS10.0统计软件分析，全部均数用ˉx±s表示，各组小鼠之间瘤重、细胞周期各时相分布采用单因素方差分析。
2 结果
实验结束时各组小鼠肿瘤生长情况见图1，各组肿瘤 瘤重及抑瘤率见表1，各组肿瘤细胞各时相分别见表2。图1及表1结果提示:阴性对照组小鼠肿瘤生长良好，CTX治疗组肿瘤生长得到明显抑制。表2结果提示:消积饮阻滞肿瘤细胞于G 0 /G 1 期，华蟾素阻滞肿瘤细胞于S期。消积饮联合华蟾素同时作用于细胞周期的G 0 /G 1 期及S期。
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图1 各组小鼠剥离肿瘤对比
表1 各组小鼠肿瘤组织称重及抑瘤率
注:方差分析:与阴性对照组比较 ˇ P<0.01，两药联合组与相应单药治疗组比较 ▲ P<0.01。
表2 各组小鼠肿瘤细胞的周期比例
注:方差分析:与阴性对照组比较 ˇ P<0.01。
3 讨论
非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的75%～80%，其中大部分在临床确诊时属于中晚期。在ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者中，70岁以上的患者约占1/3，而60岁以上的患者约占1/2～2/3。由于这类患者对铂类药物的肾毒性及多药联合化疗方案的骨髓造血毒性的耐受性较差，因此，中医药治疗对老年非小细胞肺癌有着重要意义。
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肺癌在中医古代文献的论述中多属于“肺积”、“息积”、“息贲”、“肺痈”等范畴。究其病因病机，综合多家之说主要责之于“虚”(气阴虚损)、“毒”、“痰”、“瘀”。对于晚期肺癌，每以虚实夹杂多见，虚以气虚、气阴两虚为主，实则包括痰 凝、血瘀、毒聚、气滞。老年非小细胞肺癌患者，多伴肾气虚损。因此，临床治疗肺癌应以补虚(肺、脾、肾)、解毒、祛痰、化瘀为治法。
广东省名老中医刘伟胜教授，针对以上病因病机，总结其30多年的肺癌临床诊疗经验，创建了具补肺益肾、解毒消瘀、化痰散结的中药“消积饮口服液”，取得了较好的临床疗效。方中黄芪、补骨脂和云芝补益脾肺、益肾扶正为君;白花蛇舌草清热解毒抗癌，全蝎、蜈蚣解毒散结共为臣;肺与大肠相表里，老年肺癌患者每有便秘热结肠中，为使热毒痰瘀有出路，方中稍用大黄为佐。该药作为院内制剂，已经在临床应用近十年，在治疗中晚期肺癌方面显示了较好的疗效。临床预试验表明 [1] ，消积饮能够缓解中晚期肺癌患者临床症状、提高患者细胞免疫功能、防止肺癌发展和转移、改善患者生存质量、延长生存期，同时，对化疗药物起到增效减毒作用。
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“华蟾素”是中药蟾蜍皮制剂的上市抗肿瘤中药，具有驱除癌毒、消积定痛、软坚散结功效。体内外实验研究证实，华蟾素对多种癌细胞有杀灭作用。具抗癌、升白、提高免疫功能等作用。已有较多文献 [2] 报道其对晚期肺癌有较好的治疗作用和对化疗药物的增效减毒作用。吴万垠等 [3] 曾用华蟾素治疗晚期肺癌，并与华蟾素配合联合化疗进行对照，结果在对瘤体的缩小方面，作用不如联合化疗组，但在总体生存时间方面，两组差异无显著性(P>0.05)，且华蟾素组患者的生活质量较化疗组高。
在细胞周期作用方面，最近的实验研究提示，消积饮能够降低小鼠Lewis肺癌细胞cyclinD1的表达，影响其细胞周期G 1 /S调控点，有效地阻止肿瘤细胞周期于G 0 、G 1 期，使其不能进入S期进行DNA复制有关 [4] 。华蟾素也属于细胞周期特异性药物，主要作用于S期[5] 。本实验中，根据两药对肿瘤细胞不同周期的阻滞作用，两药联合使用以期增强对肿瘤细胞的增殖起抑制杀灭作用。
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本实验联合使用消积饮、华蟾素治疗小鼠Lewis肺癌， 研究结果提示，从肿瘤的生长以及皮下瘤重的减小提示了消积饮、华蟾素两药单独使用均有抑瘤作用。运用流式细胞仪对细胞周期各时相分布的观察可见，与对照组相比，消积饮组的肿瘤细胞G 0 /G 1 期细胞比例增高，华蟾素组的肿瘤细胞S期细胞比例增高，两药联合组的肿瘤细胞G 0 /G 1 期、S期细胞比例较生理盐水组均有所增高。结果提示，消积饮联合华蟾素使用可进一步阻滞肿瘤细胞于G 0/G 1 与S期，加强了抑瘤作用。该结果提示临床治疗晚期肺癌时，可同时使用中药消积饮及华蟾素，以提高临床疗效，相关临床试验正在研究之中。
参考文献
1 卢君仁，刘伟胜，徐凯，等.消积饮治疗中晚期肺癌的临床观察.广州中医药大学学报，2001，18(3):195-200.
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2 张玲，刘城林，金学军，等.华蟾素联合NP方案治疗非小细胞肺癌生存质量评价分析.现代康复，2001，5:113.
3 吴万垠，徐凯，陈春永，等.华蟾素治疗晚期肺癌的临床观察.美国中华现代医学杂志，2000，1(12):26-27.
4 卢君仁，刘宇龙.消积饮对Lewis肺癌细胞周期影响的实验研究.中医研究，2001，17(3):38-39.
5 左小东.中药蟾蜍抗肿瘤文献及实验研究.南京中医药大学95级硕士研究生学位论文，1998，4.
作者单位:510120广州中医药大学第二临床医学院肿瘤科
(收稿日期:2003-12-30)
(编辑子 萱), 百拇医药
关键词 消积饮 华蟾素 Lewis肺癌 抑瘤率 细胞周期 流式细胞术
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)06-0481-03
Synergistic anti-cancer effects and mechanisms of Xiaoji Decoction
plus Huachansu on Lewis lung cancer cell in mice
Chai Xiaoshu，Wu Wanyin，Xu Kai，et al.
Department of Cancer，Second Clinical Medical Hospital，
Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangdong510120.
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【Abstract】 Objective To explore the inhibitory effects and mechanisms of Xiaoji Decoction plus Huachansu on the growth of cell in mices bearing Lewis lungcancer.Methods Fifty duplicated mices bearing Lewis lung cancer were randomly broken into control gruop，cyclophosphamide group，Xiaoji Decoction group，Huachansu group，Xiaoji Decoction plus Huachansu group and normal saline group.Each group included ten mices.Normal saline(0.2ml)，cyclophosphamide group(30mg/kg)and Huachansu group(5ml/kg)were infused into paunch respectively in three groups，Xiaoji Decoction group(0.2ml)were infused from esophagus into stomach in one group，and Xiaoji-decocˉtion plus Huachansu group were conducted with XiaojiDecoction(0.2ml)and Huachansu(5ml/kg)meanwhile.The weights of tumor tissueswere measured，the tumor inhibitory rates were calculated and compared among five groups of mices.The growth cycles of Lewis lung cancer cell line of every group were analyzed with flow cytometry.Results The tumor inhibitory rates of Xiaoji Decoction，Huachansu and combination groups were32.28%，42.86%，47.32%，respectively.Compared with normal saline group，the differences of the tumor inhibitory rates were statistically(P<0.01).The percentage of G 0 /G 1 phase of cell cycle increased in Xiaoji Decoction group and the percentage of S phase increased in Huachansu group，and the combination group increased both in G 0 /G 1 and S phases.Conclusion Xiaoji Decoction and Huachansu both have inhibitory effect on lung cancer and it demonstrate that a Xiaoji Decocˉtion plus Huachansu combination would be more effective.
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Key words Xiaoji Decoction Huachansu Lewis lung cancer tumor inhibitory rates cell cycle flow cyˉtometry
“消积饮”口服液是广东省名老中医刘伟胜教授针对肺癌的病因病机，总结其30多年的肺癌临床诊疗经验所创建的中药方剂，具有补肺益肾、解毒消瘀、化痰散结的作用，已经在临床应用治疗肺癌十余年，显示了较好的疗效。已有实验表明，消积饮可通过阻滞肺癌细胞周期的G 0 /G 1 期起到抗癌作用。华蟾素是中药蟾蜍皮制剂的抗肿瘤中药，具有驱除癌毒、消积定痛、软坚散结功效。华蟾素能够有效地阻止肿瘤细胞周期于S期，使其不能进入S期进行DNA复制，从而抑制小鼠Lewis肺癌的生长。针对两药对肺癌细胞周期不同阻滞点作用的机制，在本实验中，我们使用消积饮联合华蟾素抑制小鼠Lewis肺癌的生长，并对两药作用于肿瘤细胞不同周期的协同抗癌机制进行了研究。
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1 材料与方法
1.1 动物与瘤株 体重20±2g、雌雄各半，6～8周龄的C 57 BL/6小鼠50只由第一军医大学动物中心提供;Lewis肺癌瘤株由广州中医药大学肿瘤研究所提供。
1.2 药物 CTX由上海华联制药有限公司生产。消积饮:主要成分含黄芪、补骨脂、云芝、大黄、白花蛇舌草、莪术、全蝎、蜈蚣等，由广州中医药大学第二附属医院药剂科提供。华蟾素:淮北生化制药厂生产。
1.3 实验方法 于广州中医药大学肿瘤研究所实验室中，无菌操作，取小鼠Lewis肺癌单细胞悬液，用生理盐水调制细胞悬液浓度至1×10 7 /ml，每鼠右腋窝下接种0.2ml。接种次日将小鼠随机分成5组按以下给药:阴性对照组:0.2ml NS，I.P，qd×7d;CTX治疗组:CTX，30mg/kg体重，I.P，qd×7d;消积饮治疗组:消积饮，0.2ml，P.O，qd×7d;华蟾素治疗组:华蟾素，5ml/kg体重，I.P，qd×7d;消积饮+华蟾素治疗组:消积饮，0.2ml，P.O+华蟾素，5ml/kg体重，I.P，qd×7d。
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1.4 计算瘤重及抑瘤率 停药次日使用颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离腋窝皮下肿瘤，去除血污、脂肪等，用电子天平称量体重及瘤重，根据以下公式计算抑瘤率:抑瘤率%=(1-治疗组瘤重/阴性对照组瘤重)×100%。
1.5 细胞周期的观察 剥取部分新鲜肿瘤组织，PBS漂洗，浸泡，剪碎，混合，过滤，离心，再过滤，离心，75%的乙醇固定，Coulter-DNA-Prep Reagents Kit进行碘化丙啶(PI)染色，Coulter Co.Ltd.的EPS型流式细胞仪进行分析。
1.6 统计分析方法 采用SPSS10.0统计软件分析，全部均数用ˉx±s表示，各组小鼠之间瘤重、细胞周期各时相分布采用单因素方差分析。
2 结果
实验结束时各组小鼠肿瘤生长情况见图1，各组肿瘤 瘤重及抑瘤率见表1，各组肿瘤细胞各时相分别见表2。图1及表1结果提示:阴性对照组小鼠肿瘤生长良好，CTX治疗组肿瘤生长得到明显抑制。表2结果提示:消积饮阻滞肿瘤细胞于G 0 /G 1 期，华蟾素阻滞肿瘤细胞于S期。消积饮联合华蟾素同时作用于细胞周期的G 0 /G 1 期及S期。
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图1 各组小鼠剥离肿瘤对比
表1 各组小鼠肿瘤组织称重及抑瘤率
注:方差分析:与阴性对照组比较 ˇ P<0.01，两药联合组与相应单药治疗组比较 ▲ P<0.01。
表2 各组小鼠肿瘤细胞的周期比例
注:方差分析:与阴性对照组比较 ˇ P<0.01。
3 讨论
非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的75%～80%，其中大部分在临床确诊时属于中晚期。在ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者中，70岁以上的患者约占1/3，而60岁以上的患者约占1/2～2/3。由于这类患者对铂类药物的肾毒性及多药联合化疗方案的骨髓造血毒性的耐受性较差，因此，中医药治疗对老年非小细胞肺癌有着重要意义。
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肺癌在中医古代文献的论述中多属于“肺积”、“息积”、“息贲”、“肺痈”等范畴。究其病因病机，综合多家之说主要责之于“虚”(气阴虚损)、“毒”、“痰”、“瘀”。对于晚期肺癌，每以虚实夹杂多见，虚以气虚、气阴两虚为主，实则包括痰 凝、血瘀、毒聚、气滞。老年非小细胞肺癌患者，多伴肾气虚损。因此，临床治疗肺癌应以补虚(肺、脾、肾)、解毒、祛痰、化瘀为治法。
广东省名老中医刘伟胜教授，针对以上病因病机，总结其30多年的肺癌临床诊疗经验，创建了具补肺益肾、解毒消瘀、化痰散结的中药“消积饮口服液”，取得了较好的临床疗效。方中黄芪、补骨脂和云芝补益脾肺、益肾扶正为君;白花蛇舌草清热解毒抗癌，全蝎、蜈蚣解毒散结共为臣;肺与大肠相表里，老年肺癌患者每有便秘热结肠中，为使热毒痰瘀有出路，方中稍用大黄为佐。该药作为院内制剂，已经在临床应用近十年，在治疗中晚期肺癌方面显示了较好的疗效。临床预试验表明 [1] ，消积饮能够缓解中晚期肺癌患者临床症状、提高患者细胞免疫功能、防止肺癌发展和转移、改善患者生存质量、延长生存期，同时，对化疗药物起到增效减毒作用。
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“华蟾素”是中药蟾蜍皮制剂的上市抗肿瘤中药，具有驱除癌毒、消积定痛、软坚散结功效。体内外实验研究证实，华蟾素对多种癌细胞有杀灭作用。具抗癌、升白、提高免疫功能等作用。已有较多文献 [2] 报道其对晚期肺癌有较好的治疗作用和对化疗药物的增效减毒作用。吴万垠等 [3] 曾用华蟾素治疗晚期肺癌，并与华蟾素配合联合化疗进行对照，结果在对瘤体的缩小方面，作用不如联合化疗组，但在总体生存时间方面，两组差异无显著性(P>0.05)，且华蟾素组患者的生活质量较化疗组高。
在细胞周期作用方面，最近的实验研究提示，消积饮能够降低小鼠Lewis肺癌细胞cyclinD1的表达，影响其细胞周期G 1 /S调控点，有效地阻止肿瘤细胞周期于G 0 、G 1 期，使其不能进入S期进行DNA复制有关 [4] 。华蟾素也属于细胞周期特异性药物，主要作用于S期[5] 。本实验中，根据两药对肿瘤细胞不同周期的阻滞作用，两药联合使用以期增强对肿瘤细胞的增殖起抑制杀灭作用。
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本实验联合使用消积饮、华蟾素治疗小鼠Lewis肺癌， 研究结果提示，从肿瘤的生长以及皮下瘤重的减小提示了消积饮、华蟾素两药单独使用均有抑瘤作用。运用流式细胞仪对细胞周期各时相分布的观察可见，与对照组相比，消积饮组的肿瘤细胞G 0 /G 1 期细胞比例增高，华蟾素组的肿瘤细胞S期细胞比例增高，两药联合组的肿瘤细胞G 0 /G 1 期、S期细胞比例较生理盐水组均有所增高。结果提示，消积饮联合华蟾素使用可进一步阻滞肿瘤细胞于G 0/G 1 与S期，加强了抑瘤作用。该结果提示临床治疗晚期肺癌时，可同时使用中药消积饮及华蟾素，以提高临床疗效，相关临床试验正在研究之中。
参考文献
1 卢君仁，刘伟胜，徐凯，等.消积饮治疗中晚期肺癌的临床观察.广州中医药大学学报，2001，18(3):195-200.
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2 张玲，刘城林，金学军，等.华蟾素联合NP方案治疗非小细胞肺癌生存质量评价分析.现代康复，2001，5:113.
3 吴万垠，徐凯，陈春永，等.华蟾素治疗晚期肺癌的临床观察.美国中华现代医学杂志，2000，1(12):26-27.
4 卢君仁，刘宇龙.消积饮对Lewis肺癌细胞周期影响的实验研究.中医研究，2001，17(3):38-39.
5 左小东.中药蟾蜍抗肿瘤文献及实验研究.南京中医药大学95级硕士研究生学位论文，1998，4.
作者单位:510120广州中医药大学第二临床医学院肿瘤科
(收稿日期:2003-12-30)
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