高浓度阿托品对培养的人眼睫状肌细胞形态的影响
【摘要】 目的 观察较高浓度阿托品对培养人眼睫状肌细胞形态的可能影响。方法培养的第4代人眼睫状肌细胞分别加入10 -4 M、3×10 -4 M、10 -3 M阿托品，光镜下分别观察1h、24h后细胞形态的变化及去药后的恢复。结果 1h加药组及10 -4 M阿托品24h组与对照组相比细胞形态没有明显的变化;3×10 -4 M阿托品24h组的细胞部分脱落，去药24h后恢复;10 -3 M阿托品24h组细胞大量脱落死亡，去药24h后无法恢复。结论 较高浓度阿托品较长时间的作用对人眼睫状肌细胞会有损害。
关键词 阿托品 睫状肌 细胞
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)06-0484-02
Morphological change of cultured human ciliary muscle
, 百拇医药
cells by high concentration atropine
Liu Ping，Wang Xiaobing，Zhang Haiyan，et al.
College of Basic Medical Sciences，Capital University of Medical Sciences，Beijing100005.
【Abstract】 Objective To observe morphological change of cultured human ciliary muscle cells by high conˉcentration atropine.Methods Morphological change of cultured4passage human ciliary muscle cells was observed1and24hours after10-4 M、3×10 -4 M、10 -3 M atropine was added respectiveyly and another24hours after atropine was removed.Results No obvious change was found under microscope1hour after three concentration added and24hours after10 -4 M atropine added.Part of cells fell off24hours after3×10 -4 M atropine added and recovered24hours after atropine removed.Most of cells fell off24hours after10 -3 M atropine added and did not recover24hours after atropine removed.Conclusion 24hours influence of high concentration atropine could induced damage to huˉman ciliary musclecell.
, 百拇医药
Key words atropine ciliary muscle cell
阿托品是临床常用的眼科药物，对低龄屈光不正儿童需要应用阿托品进行散瞳验光 [1] ，在必要时每年要验光1～2次，具体用药时需要用阿托品药膏每日2次，连续3天，药物效果可持续约3周。这样用药的目的是为了充分放松睫状肌的调节作用，但同时这样会使阿托品较长时间在人眼内存留。考虑到药膏的局部存留、眼部的小容积、房水的小容量，眼局部组织有可能含有较高的药物浓度。而较高浓度的阿托品对细胞包括眼部组织细胞具有毒性作用 [2] 。验光时阿托品的作用通过松弛睫状肌来实现，由于活体测量的不便，目前尚未见到阿托品用药后睫状肌周围房水中浓度的文献报道，因此无法直接评估阿托品对活体睫状肌组织是否可能损害，睫状肌细胞的培养成功已可以为从细胞水平研究人眼睫状肌的生理提供实验材料 [3～5] ，因此本文初步观察了较高浓度阿托品对培养的人眼睫状肌细胞形态的可能影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 培养的第4代人眼睫状肌细胞。取材来自北京同仁医院眼库，本研究供体年龄为22岁，无眼部疾患，眼球取材后冰壶保存，取回后抗菌处理，角膜取材后选择分离睫状肌组织，睫状肌组织的分离在死亡后8h内进行，分离后立即接种，培养与鉴定方法见已有文献[3～5] 。
1.2 方法 观察较高浓度阿托品对培养的人眼睫状肌细胞形态的影响:在培养皿中分别加入阿托品(中国药品生物制品检定所标准品室)使培养液中浓度达到10 -4 M、3×10 -4 M、10 -3 M，在对照的培养皿中加入等量的赋形剂，在光镜下分别观察1h与24h后细胞形态的变化。然后将含有阿托品的培养液换为不含药物的培养液，再过24h后观察细胞形态的恢复。共重复3次。
2 结果
, 百拇医药
1h后加药组与对照组相比细胞形态与贴壁能力没有明显的变化。加入10 -4 M阿托品24h后的培养皿中的细胞与正常对照组相比也没有明显的改变，如图1(A)。加入3×10-4 M阿托品的培养皿中的细胞部分脱落，出现局部的间隙，间隙残留的细胞贴壁能力减弱，细胞与培养皿之间出现松动，如图1(B)，呈现出与经特定的酶处理使培养细胞部分脱离时相似的形态 [6] 。加入10 -3 M阿托品的培养皿中的细胞大量脱落、漂浮，如图1(C)。将含有阿托品的培养液换为不含药物的培养液24h后曾加入3×10 -4 阿品的培养皿中的细胞贴壁能力有所恢复，周围新生儿细胞逐渐填充了脱落细胞造成的间隙，如图1(D)。而曾加入10 -3 M阿托品的细胞更换为不含药物的培养液24h后因大量脱落、漂浮而无法恢复正常，呈现出与图1(C)类似的形态。
3 讨论
, http://www.100md.com 以上的观察结果提示在较长时间很高浓度(10 -3 M)的阿托品作用下，培养的人眼睫状肌细胞的贴壁能力下降，部分细胞脱落、死亡，而且损伤不可恢复。但在较高浓度药物时(3×10 -4 M)这种损伤是可逆恢复的。这种损伤最大可能来源于阿托品对细胞的毒性作用。阿托品作为胆碱能受体拮抗剂在浓度较高时对许多细胞都具有毒性作用，包括对眼部组织如巩膜细胞 [2] 。以上观察的结果与阿托品的其他药理结果是相吻合的。但也有一些研究显示胆碱能受体比常规认识的要复杂，它与细胞的贴壁能力、细胞外基质的结构都有密切联系，如胆碱能受体拮抗剂可以抑制巩膜细胞的增生与细胞外基质的合成 [5] ，胆碱能受体激动剂可以增加小细胞肺癌细胞的贴壁能力与细胞外基质合成从而影响细胞的增殖与转移 [7] 。进一步的研究还发现胆碱能受体与细胞外基质可能共同连接在同一细胞膜骨架上，因此细胞外基质的分布密度与胆碱能受体分布密度呈现对应性 [8] ，而且培养细胞的胆碱能受体分布部位的贴壁能力增强，细胞最后脱落的贴壁部位往往都是胆碱能受体分布部位 [9] 。以上观察结果与这些最新的研究结果也是相吻合的。
, 百拇医药
总之，不论基于哪种作用机制，以上的观察提示很高浓度与较长时间的阿托品作用对睫状肌细胞会有损害。如前所述，临床阿托品药膏的应用会使药物在眼部局部较长时间存留，并且长期发挥作用。尽管目前尚未见阿托品用药后在睫状肌局部存留浓度与时间的报道，但考虑到药膏的局部存留、眼部的小容积、房水的小容量，在用药后会在局部具有相对较高的浓度与较长的作用时间。那么这种相对较高的浓度与较长的作用时间是否可能会对人眼睫状肌产生损害，进而是否可能会影响到以后的调节能力。考虑到我国大量儿童应用阿托品散瞳验光，对这一问题的研究应该是具有较大的社会意义的。由于本观察采用离体的培养细胞，与活体情况会有较大差异， 因此我们的观察结果并不提示临床用药必然损害睫状肌。相信随着研究技术的进步，这一问题会得到更为完善的回答。 (本文图片见封三)。
参考文献
1 李凤鸣.眼科全书，北京:人民卫生出版社，1996，2700-2701.
, 百拇医药 2 Lind GJ，Chew SJ，Marzani D，et al.Muscarinic acetylcholine receptor antagonists inhibit chick scleral chondrocytes.Invest Ophthalmol Vis Sci，1998，39:2217-2231.
3 王小兵，李卫红，张海燕，等.人眼睫状肌细胞的培养与鉴定.首都医科大学学报，2003，24:329-332.
4 Tamm E，Flugel C，Baur A，et al.Cell cultures of human ciliary muscle:growth，ultrastructural and immunocytochemical characteristics.Expe Eye Res，1991，53:375-387.
5 Woldemussie E，Feldmann BJ，Chen J.Characterization of muscarinic reˉceptors in cultured human iris sphincter and ciliary smooth muscle cells.Exp Eye Res，1993，56:385-392.
, 百拇医药
6 Pang IH，Shade DL，Tamn E，et al.Single-cell contraction assay for human ciliary muscle cells.Invest Ophthal Vis Sci，1993，34:1876-1879.
7 Quigley RL，Shafer SH，Williams CL.Regulation of integrin-mediated adhesion by muscarinic acetylcholine receptors and protein kinase C in small cell lung carcinoma.Chest，1998，114:839-846.
8 Dmytrenko GM，Bloch RJ.Evidence for transmembrance anchoring of extracellular matrix at acetylcholine receptor clusters.Exp Cell Res，1993，206:323-334.
, http://www.100md.com
9 Moody-Corbett F，Cohen MW.Increased adhesiveness at sites of high acetylcholine receptor density on embryonic amphibian muscle cells culˉtured without nerve.J Embryol Exp Morphol，1982，72:53-69.
作者单位:100005首都医科大学基础医学院
首都医科大学同仁眼科中心
(收稿日期:2004-03-19)
(编辑海 天), 百拇医药
关键词 阿托品 睫状肌 细胞
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2004)06-0484-02
Morphological change of cultured human ciliary muscle
, 百拇医药
cells by high concentration atropine
Liu Ping，Wang Xiaobing，Zhang Haiyan，et al.
College of Basic Medical Sciences，Capital University of Medical Sciences，Beijing100005.
【Abstract】 Objective To observe morphological change of cultured human ciliary muscle cells by high conˉcentration atropine.Methods Morphological change of cultured4passage human ciliary muscle cells was observed1and24hours after10-4 M、3×10 -4 M、10 -3 M atropine was added respectiveyly and another24hours after atropine was removed.Results No obvious change was found under microscope1hour after three concentration added and24hours after10 -4 M atropine added.Part of cells fell off24hours after3×10 -4 M atropine added and recovered24hours after atropine removed.Most of cells fell off24hours after10 -3 M atropine added and did not recover24hours after atropine removed.Conclusion 24hours influence of high concentration atropine could induced damage to huˉman ciliary musclecell.
, 百拇医药
Key words atropine ciliary muscle cell
阿托品是临床常用的眼科药物，对低龄屈光不正儿童需要应用阿托品进行散瞳验光 [1] ，在必要时每年要验光1～2次，具体用药时需要用阿托品药膏每日2次，连续3天，药物效果可持续约3周。这样用药的目的是为了充分放松睫状肌的调节作用，但同时这样会使阿托品较长时间在人眼内存留。考虑到药膏的局部存留、眼部的小容积、房水的小容量，眼局部组织有可能含有较高的药物浓度。而较高浓度的阿托品对细胞包括眼部组织细胞具有毒性作用 [2] 。验光时阿托品的作用通过松弛睫状肌来实现，由于活体测量的不便，目前尚未见到阿托品用药后睫状肌周围房水中浓度的文献报道，因此无法直接评估阿托品对活体睫状肌组织是否可能损害，睫状肌细胞的培养成功已可以为从细胞水平研究人眼睫状肌的生理提供实验材料 [3～5] ，因此本文初步观察了较高浓度阿托品对培养的人眼睫状肌细胞形态的可能影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 培养的第4代人眼睫状肌细胞。取材来自北京同仁医院眼库，本研究供体年龄为22岁，无眼部疾患，眼球取材后冰壶保存，取回后抗菌处理，角膜取材后选择分离睫状肌组织，睫状肌组织的分离在死亡后8h内进行，分离后立即接种，培养与鉴定方法见已有文献[3～5] 。
1.2 方法 观察较高浓度阿托品对培养的人眼睫状肌细胞形态的影响:在培养皿中分别加入阿托品(中国药品生物制品检定所标准品室)使培养液中浓度达到10 -4 M、3×10 -4 M、10 -3 M，在对照的培养皿中加入等量的赋形剂，在光镜下分别观察1h与24h后细胞形态的变化。然后将含有阿托品的培养液换为不含药物的培养液，再过24h后观察细胞形态的恢复。共重复3次。
2 结果
, 百拇医药
1h后加药组与对照组相比细胞形态与贴壁能力没有明显的变化。加入10 -4 M阿托品24h后的培养皿中的细胞与正常对照组相比也没有明显的改变，如图1(A)。加入3×10-4 M阿托品的培养皿中的细胞部分脱落，出现局部的间隙，间隙残留的细胞贴壁能力减弱，细胞与培养皿之间出现松动，如图1(B)，呈现出与经特定的酶处理使培养细胞部分脱离时相似的形态 [6] 。加入10 -3 M阿托品的培养皿中的细胞大量脱落、漂浮，如图1(C)。将含有阿托品的培养液换为不含药物的培养液24h后曾加入3×10 -4 阿品的培养皿中的细胞贴壁能力有所恢复，周围新生儿细胞逐渐填充了脱落细胞造成的间隙，如图1(D)。而曾加入10 -3 M阿托品的细胞更换为不含药物的培养液24h后因大量脱落、漂浮而无法恢复正常，呈现出与图1(C)类似的形态。
3 讨论
, http://www.100md.com 以上的观察结果提示在较长时间很高浓度(10 -3 M)的阿托品作用下，培养的人眼睫状肌细胞的贴壁能力下降，部分细胞脱落、死亡，而且损伤不可恢复。但在较高浓度药物时(3×10 -4 M)这种损伤是可逆恢复的。这种损伤最大可能来源于阿托品对细胞的毒性作用。阿托品作为胆碱能受体拮抗剂在浓度较高时对许多细胞都具有毒性作用，包括对眼部组织如巩膜细胞 [2] 。以上观察的结果与阿托品的其他药理结果是相吻合的。但也有一些研究显示胆碱能受体比常规认识的要复杂，它与细胞的贴壁能力、细胞外基质的结构都有密切联系，如胆碱能受体拮抗剂可以抑制巩膜细胞的增生与细胞外基质的合成 [5] ，胆碱能受体激动剂可以增加小细胞肺癌细胞的贴壁能力与细胞外基质合成从而影响细胞的增殖与转移 [7] 。进一步的研究还发现胆碱能受体与细胞外基质可能共同连接在同一细胞膜骨架上，因此细胞外基质的分布密度与胆碱能受体分布密度呈现对应性 [8] ，而且培养细胞的胆碱能受体分布部位的贴壁能力增强，细胞最后脱落的贴壁部位往往都是胆碱能受体分布部位 [9] 。以上观察结果与这些最新的研究结果也是相吻合的。
, 百拇医药
总之，不论基于哪种作用机制，以上的观察提示很高浓度与较长时间的阿托品作用对睫状肌细胞会有损害。如前所述，临床阿托品药膏的应用会使药物在眼部局部较长时间存留，并且长期发挥作用。尽管目前尚未见阿托品用药后在睫状肌局部存留浓度与时间的报道，但考虑到药膏的局部存留、眼部的小容积、房水的小容量，在用药后会在局部具有相对较高的浓度与较长的作用时间。那么这种相对较高的浓度与较长的作用时间是否可能会对人眼睫状肌产生损害，进而是否可能会影响到以后的调节能力。考虑到我国大量儿童应用阿托品散瞳验光，对这一问题的研究应该是具有较大的社会意义的。由于本观察采用离体的培养细胞，与活体情况会有较大差异， 因此我们的观察结果并不提示临床用药必然损害睫状肌。相信随着研究技术的进步，这一问题会得到更为完善的回答。 (本文图片见封三)。
参考文献
1 李凤鸣.眼科全书，北京:人民卫生出版社，1996，2700-2701.
, 百拇医药 2 Lind GJ，Chew SJ，Marzani D，et al.Muscarinic acetylcholine receptor antagonists inhibit chick scleral chondrocytes.Invest Ophthalmol Vis Sci，1998，39:2217-2231.
3 王小兵，李卫红，张海燕，等.人眼睫状肌细胞的培养与鉴定.首都医科大学学报，2003，24:329-332.
4 Tamm E，Flugel C，Baur A，et al.Cell cultures of human ciliary muscle:growth，ultrastructural and immunocytochemical characteristics.Expe Eye Res，1991，53:375-387.
5 Woldemussie E，Feldmann BJ，Chen J.Characterization of muscarinic reˉceptors in cultured human iris sphincter and ciliary smooth muscle cells.Exp Eye Res，1993，56:385-392.
, 百拇医药
6 Pang IH，Shade DL，Tamn E，et al.Single-cell contraction assay for human ciliary muscle cells.Invest Ophthal Vis Sci，1993，34:1876-1879.
7 Quigley RL，Shafer SH，Williams CL.Regulation of integrin-mediated adhesion by muscarinic acetylcholine receptors and protein kinase C in small cell lung carcinoma.Chest，1998，114:839-846.
8 Dmytrenko GM，Bloch RJ.Evidence for transmembrance anchoring of extracellular matrix at acetylcholine receptor clusters.Exp Cell Res，1993，206:323-334.
, http://www.100md.com
9 Moody-Corbett F，Cohen MW.Increased adhesiveness at sites of high acetylcholine receptor density on embryonic amphibian muscle cells culˉtured without nerve.J Embryol Exp Morphol，1982，72:53-69.
作者单位:100005首都医科大学基础医学院
首都医科大学同仁眼科中心
(收稿日期:2004-03-19)
(编辑海 天), 百拇医药