丙型肝炎病毒感染与肝细胞癌的相关性研究
【摘要】 目的 研究肝细胞癌(HCC)的发生与丙肝病毒(HCV)感染的关系。方法应用聚合酶链式反应(PCR)对肝细胞癌(30例)和肝内胆管结石的肝组织(19例)的石蜡包埋标本中的HCV-RNA和HBV-DNA进行检测。结果 肝癌组和结石组的HCV-RNA阳性例数分别为10例(33.3%)和1例(5.3%)，OR=9(P<0.05)。结论 HCV感染是HCC的重要致病因素;用PCR技术检测石蜡包埋肝组织中的HCV-RNA是一种简便、特异、灵敏的方法。
关键词 肝细胞癌(HCC) 丙型肝炎病毒(HCV) 聚合酶链式反应(PCR)
【文献标识码】 A 【文章编号】1680-6115(2004)06-0494-02
The relativity study of hepatictis c virus and hepatocellular
, 百拇医药
carcinoma by PCR technique
Xiao Pei，Liu Zhengrong，Guo Renxuan
The Tumor Hospital of Liaoning Province，Shenyang110042.
【Abstract】 Objective To investigate the contribution of HCV infection to the onset of hepatocellular carcinoˉma in China.Methods HCV-RNA and HBV-DNA weredetected by polymerase chain reaction(PCR)technique in formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)liver tissue specimens from30Chinese patients with HCC and21with hepatolithiasis serving as controls.Meanwhile，we reviewd the ELISA results testing immunological markers of HBV and HCV in the patients and controls.ResultsHCV-RNA was present in10(33.3%)samples in HCC group and1(5.3%)in controls.The OR(odd ratio)value for HCC associated with positive HCV-RNA was9(P<0.05).Furˉthermore，in liver tissues of HCC the positive incidence of HBV-DNA was56.7%and there is no significant relativiˉty between HCV-RNA positive and HBV-DNA positive in HCC patients(P>0.05).Conclusion HCV infection is an important pathogenic factor of HCC.Using RT-PCR technique in the detection of HCV-RNA in FFPE liver tissue is a simple，specific and sensitive method.
, 百拇医药
Key words hepatocellular carcinoma hepatitis C virus polymerase chain reaction
近些年，肝细胞癌(HCC)的发病率在世界范围内有所上升，其主要原因可能是病人长期患有慢性肝炎和肝硬化所致 [1] 。乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC发病的重要原因，已为医学界公认 [2，3] ;而更易转为慢性和发展成肝硬化的丙型肝炎病毒(HCV)感染与HCC的关系也逐渐开始受到研究人员的重视。本研究利用聚合酶链式反应(PCR)对30例HCC及19例肝内胆管结石的手术标本的石蜡包埋组织，进行HCV-RNA和HBV-DNA的检测，探讨HCV感染与HCC发生的关系。
1 材料和方法
1.1 研究对象 收集1998～1999年HCC手术切除病例30例，其中男26例，女4例，年龄范围在33～70岁之间。另取19例肝内胆管结石部分肝手术切除病例作为对照组，其中男13例，女6例，年龄范围在45～67岁之间。均取其福尔马林固定、石蜡包埋的肝组织标本。标本来源于辽宁省肿瘤医院、辽宁省人民医院和中国医科大学附属第一医院。
, 百拇医药
1.2 试剂 采用北京医科大学肝病研究所生产的检测HCV的RT-PCR试剂盒，限制扩增长度为240bp;HBV-DNA检测采用华美生物工程公司生产的HBV试剂盒，限制扩增长度为270bp。
1.3 方法
1.3.1 核酸提取 取3～5张10μm石蜡切片放入离心管内，用二甲苯脱蜡两次，无水乙醇脱苯两次，加入消化液100μl，再加蛋白酶K至终浓度300μg/ml，55℃3h，95℃10min，从中取出60μl加入离心管，加裂解液300μl，，60℃10min，加200μl水饱和酚，再加100μl氯仿/异戊醇混合液(49:1)，离心5min，只取水相，加入0.5ml无水乙醇，置-20℃过夜。15000r/min离心10min，弃上清液，再用-20℃70%乙醇洗一次，沉淀物加含5U/μl RNasin的无菌水30μl反复吸打，使核酸溶解。
1.3.2 HCV-RNA逆转录及PCR扩增 反应液8μl(10×Taq酶缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，外引物各1.5μl，AMV逆转录酶与TaqDNA聚合酶各1U)加入核酸提取液17μl，石蜡封顶，42℃30min逆转录后，进行参数为94℃30s，55℃30s，72℃30s的PCR循环30轮。取第一次PCR产物3μl加反应液22μl(10×Taq酶缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，内引物各1.5μl，TaqDNA聚合酶0.5U，无菌水15μl)，石蜡封顶后进行第二次PCR扩增，参数同前。
, 百拇医药
1.3.3 HBV-DNA的PCR扩增 取核酸提取液2μl，加HBV PCR混合物，石蜡封顶后进行PCR扩增，参数同前。
1.3.4 电泳 取RT-PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)中电泳30min，置紫外灯下观察。同样方法，取PCR扩增产物进行电泳。
1.4 统计学方法 采用χ 2 检验对实验结果进行统计学处理。
2 结果
2.1 血清HBV标志物检测结果 见表1。在30例HCC病例中，有26例附有血清学ELISA法检测HBV标志物和HCV标志物的结果，其中HBV标志物至少1项阳性者达80.8%(21/26)。而HCV标志物阳性率近3.8%(1/26)。对照组中，19例病人只有2例HBV标志物阳性，HCV标志物均为阴性。
, 百拇医药
表1 26例HCC患者血清HBV标志物检测结果项目
2.2 肝组织中HCV-RNA的检测结果 HCV-RNA阳性对照及阳性标本均在240bp处可见清晰的荧光条带，阴性对照及阴性标本则无特异性扩增条带。HCC组与对照组RT-PCR检测HCV-RNA的结果比较，见表2。
表2 HCC组和对照组RT-PCR检测结果比较
注:OR=9，χ 2 =5.26，P<0.05
2.3 HCC病人中HCV感染与HBV感染的相关性 HBV-DNA阳性对照及阳性标本均在270bp处可见清晰的荧光条带，阴性对照及阴性标本则无特异性扩增条带。HCC组患者HCV-RNA阳性与HBV-DNA阳性的关联性检验，见表3。
表3 HCC患者中HCV感染与HBV感染的交互表
, 百拇医药
由此表可以看出，HCC病人中HCV-RNA阳性与HBV-DNA阳性之间不存在相关性。
2.4 HCC患者RT-PCR法检出结果与ELISA法检出结果
表4 26例HCC患者中HCV的RT-PCR法与ELISA法检测结果
由表3可以看出，RT-PCR法HCV-RNA阳性率为33.3%，ELISA法抗-HCV阳性率仅为3.8%，RT-PCR法优于ELISA法，P<0.05。
3 讨论
欧美各国的HCC患者中HCV感染率一般在50%以上，远高于其HBV的感染率，本研究的阳性率为33.3%，这与其他远东和非洲国家和地区的报道接近 [4] ，但较国内其它研究所得出的阳性率为低 [5，6] 。本实验还以未发生癌变的肝组织作为对照组，与HCC组相比较，进行对照研究，发现HCV-RNA阳性病人患HCC的概率是HCV-RNA阴性者的9倍(OR=9)，两者差异有显著性(P<0.05)，这为证明HCV感染是HCC的重要致病因素之一提供了证据。由于HBV和HCV具有共同的危险因素，感染了HCV的病人常同时伴有HBV的感染，本实验中的HCC病人中HBV标志物至少一项阳性者高达80.8%;所以HCV是否具有独立的致癌作用尚不能确定。本研究利用所测得的HCV-RNA和HBV-DNA的结果，对HCC组的HCV感染和HBV感染的相关性进行检验见表2，结果发现HCC病人中HCV-RNA阳性与HBV-DNA阳性之间不存在相关性(P>0.05)，提示HCV感染和HBV感染是各自独立的HCC致癌因素，但两者对HCC的发生是否还具有协同作用，尚有待进一步研究。
, 百拇医药
文献表明，医院常规存档多年的福尔马林固定、石蜡包埋组织中RNA保存完好，可用于PCR检测。由表4可知RT-PCR法优于ELISA法(P<0.05)，说明使用RT-PCR法从石蜡包埋组织中提取RNA进行检测是一种特异而灵敏的可靠方法，可用于系统的回顾性研究，这为进一步深入系统的研究HCV感染与HCC的关系提供了一个新途径。
参考文献
1 Edamato Y，Tani M，Kurata，et al.Hepatitis C and B virus infections in hepatocellular carcnoma.Analysis of direct detection of viral genome in paraffin embedded tissuese.Cancer，1996，77(9):1787.
2 Ivanf loncarevic，Pepter schranz.Replication of hepatictis B virus in a hepatocellular carcinoma.Virolohy，1990，174:158.
, 百拇医药
3 Wang J，Chenivesse X.Hepatitis B virus integration in a cyclin A gene in ahepatocellular carcinoma.Nature，1990，343:555.
4 Park BCM，Han BH，Ahn sy，et al.Prevalence of hepatictis C antibody in patients with chronic liver disease and hepatocellular carcinoma in Korea.J Viral Hepat，1995，2(4):195.
5 苏英豪，朱世能，陆世伦，等.用套式RT-PCR法检测肝细胞癌中丙型肝炎病毒基因型.复旦学报(医学科学版)，2000，1:20.
6 李江，王文亮，于欣欣，等.肝细胞肝癌组织中丙型肝炎病毒核心区基因及其表达产物的检测.中华临床和实验病毒学杂志，2000，1:38.
作者单位:110042沈阳辽宁省肿瘤医院
辽宁省人民医院
中国医科大学附属第一医院
(收稿日期:2004-01-08)
(编辑李 木), 百拇医药
关键词 肝细胞癌(HCC) 丙型肝炎病毒(HCV) 聚合酶链式反应(PCR)
【文献标识码】 A 【文章编号】1680-6115(2004)06-0494-02
The relativity study of hepatictis c virus and hepatocellular
, 百拇医药
carcinoma by PCR technique
Xiao Pei，Liu Zhengrong，Guo Renxuan
The Tumor Hospital of Liaoning Province，Shenyang110042.
【Abstract】 Objective To investigate the contribution of HCV infection to the onset of hepatocellular carcinoˉma in China.Methods HCV-RNA and HBV-DNA weredetected by polymerase chain reaction(PCR)technique in formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)liver tissue specimens from30Chinese patients with HCC and21with hepatolithiasis serving as controls.Meanwhile，we reviewd the ELISA results testing immunological markers of HBV and HCV in the patients and controls.ResultsHCV-RNA was present in10(33.3%)samples in HCC group and1(5.3%)in controls.The OR(odd ratio)value for HCC associated with positive HCV-RNA was9(P<0.05).Furˉthermore，in liver tissues of HCC the positive incidence of HBV-DNA was56.7%and there is no significant relativiˉty between HCV-RNA positive and HBV-DNA positive in HCC patients(P>0.05).Conclusion HCV infection is an important pathogenic factor of HCC.Using RT-PCR technique in the detection of HCV-RNA in FFPE liver tissue is a simple，specific and sensitive method.
, 百拇医药
Key words hepatocellular carcinoma hepatitis C virus polymerase chain reaction
近些年，肝细胞癌(HCC)的发病率在世界范围内有所上升，其主要原因可能是病人长期患有慢性肝炎和肝硬化所致 [1] 。乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC发病的重要原因，已为医学界公认 [2，3] ;而更易转为慢性和发展成肝硬化的丙型肝炎病毒(HCV)感染与HCC的关系也逐渐开始受到研究人员的重视。本研究利用聚合酶链式反应(PCR)对30例HCC及19例肝内胆管结石的手术标本的石蜡包埋组织，进行HCV-RNA和HBV-DNA的检测，探讨HCV感染与HCC发生的关系。
1 材料和方法
1.1 研究对象 收集1998～1999年HCC手术切除病例30例，其中男26例，女4例，年龄范围在33～70岁之间。另取19例肝内胆管结石部分肝手术切除病例作为对照组，其中男13例，女6例，年龄范围在45～67岁之间。均取其福尔马林固定、石蜡包埋的肝组织标本。标本来源于辽宁省肿瘤医院、辽宁省人民医院和中国医科大学附属第一医院。
, 百拇医药
1.2 试剂 采用北京医科大学肝病研究所生产的检测HCV的RT-PCR试剂盒，限制扩增长度为240bp;HBV-DNA检测采用华美生物工程公司生产的HBV试剂盒，限制扩增长度为270bp。
1.3 方法
1.3.1 核酸提取 取3～5张10μm石蜡切片放入离心管内，用二甲苯脱蜡两次，无水乙醇脱苯两次，加入消化液100μl，再加蛋白酶K至终浓度300μg/ml，55℃3h，95℃10min，从中取出60μl加入离心管，加裂解液300μl，，60℃10min，加200μl水饱和酚，再加100μl氯仿/异戊醇混合液(49:1)，离心5min，只取水相，加入0.5ml无水乙醇，置-20℃过夜。15000r/min离心10min，弃上清液，再用-20℃70%乙醇洗一次，沉淀物加含5U/μl RNasin的无菌水30μl反复吸打，使核酸溶解。
1.3.2 HCV-RNA逆转录及PCR扩增 反应液8μl(10×Taq酶缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，外引物各1.5μl，AMV逆转录酶与TaqDNA聚合酶各1U)加入核酸提取液17μl，石蜡封顶，42℃30min逆转录后，进行参数为94℃30s，55℃30s，72℃30s的PCR循环30轮。取第一次PCR产物3μl加反应液22μl(10×Taq酶缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，内引物各1.5μl，TaqDNA聚合酶0.5U，无菌水15μl)，石蜡封顶后进行第二次PCR扩增，参数同前。
, 百拇医药
1.3.3 HBV-DNA的PCR扩增 取核酸提取液2μl，加HBV PCR混合物，石蜡封顶后进行PCR扩增，参数同前。
1.3.4 电泳 取RT-PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)中电泳30min，置紫外灯下观察。同样方法，取PCR扩增产物进行电泳。
1.4 统计学方法 采用χ 2 检验对实验结果进行统计学处理。
2 结果
2.1 血清HBV标志物检测结果 见表1。在30例HCC病例中，有26例附有血清学ELISA法检测HBV标志物和HCV标志物的结果，其中HBV标志物至少1项阳性者达80.8%(21/26)。而HCV标志物阳性率近3.8%(1/26)。对照组中，19例病人只有2例HBV标志物阳性，HCV标志物均为阴性。
, 百拇医药
表1 26例HCC患者血清HBV标志物检测结果项目
2.2 肝组织中HCV-RNA的检测结果 HCV-RNA阳性对照及阳性标本均在240bp处可见清晰的荧光条带，阴性对照及阴性标本则无特异性扩增条带。HCC组与对照组RT-PCR检测HCV-RNA的结果比较，见表2。
表2 HCC组和对照组RT-PCR检测结果比较
注:OR=9，χ 2 =5.26，P<0.05
2.3 HCC病人中HCV感染与HBV感染的相关性 HBV-DNA阳性对照及阳性标本均在270bp处可见清晰的荧光条带，阴性对照及阴性标本则无特异性扩增条带。HCC组患者HCV-RNA阳性与HBV-DNA阳性的关联性检验，见表3。
表3 HCC患者中HCV感染与HBV感染的交互表
, 百拇医药
由此表可以看出，HCC病人中HCV-RNA阳性与HBV-DNA阳性之间不存在相关性。
2.4 HCC患者RT-PCR法检出结果与ELISA法检出结果
表4 26例HCC患者中HCV的RT-PCR法与ELISA法检测结果
由表3可以看出，RT-PCR法HCV-RNA阳性率为33.3%，ELISA法抗-HCV阳性率仅为3.8%，RT-PCR法优于ELISA法，P<0.05。
3 讨论
欧美各国的HCC患者中HCV感染率一般在50%以上，远高于其HBV的感染率，本研究的阳性率为33.3%，这与其他远东和非洲国家和地区的报道接近 [4] ，但较国内其它研究所得出的阳性率为低 [5，6] 。本实验还以未发生癌变的肝组织作为对照组，与HCC组相比较，进行对照研究，发现HCV-RNA阳性病人患HCC的概率是HCV-RNA阴性者的9倍(OR=9)，两者差异有显著性(P<0.05)，这为证明HCV感染是HCC的重要致病因素之一提供了证据。由于HBV和HCV具有共同的危险因素，感染了HCV的病人常同时伴有HBV的感染，本实验中的HCC病人中HBV标志物至少一项阳性者高达80.8%;所以HCV是否具有独立的致癌作用尚不能确定。本研究利用所测得的HCV-RNA和HBV-DNA的结果，对HCC组的HCV感染和HBV感染的相关性进行检验见表2，结果发现HCC病人中HCV-RNA阳性与HBV-DNA阳性之间不存在相关性(P>0.05)，提示HCV感染和HBV感染是各自独立的HCC致癌因素，但两者对HCC的发生是否还具有协同作用，尚有待进一步研究。
, 百拇医药
文献表明，医院常规存档多年的福尔马林固定、石蜡包埋组织中RNA保存完好，可用于PCR检测。由表4可知RT-PCR法优于ELISA法(P<0.05)，说明使用RT-PCR法从石蜡包埋组织中提取RNA进行检测是一种特异而灵敏的可靠方法，可用于系统的回顾性研究，这为进一步深入系统的研究HCV感染与HCC的关系提供了一个新途径。
参考文献
1 Edamato Y，Tani M，Kurata，et al.Hepatitis C and B virus infections in hepatocellular carcnoma.Analysis of direct detection of viral genome in paraffin embedded tissuese.Cancer，1996，77(9):1787.
2 Ivanf loncarevic，Pepter schranz.Replication of hepatictis B virus in a hepatocellular carcinoma.Virolohy，1990，174:158.
, 百拇医药
3 Wang J，Chenivesse X.Hepatitis B virus integration in a cyclin A gene in ahepatocellular carcinoma.Nature，1990，343:555.
4 Park BCM，Han BH，Ahn sy，et al.Prevalence of hepatictis C antibody in patients with chronic liver disease and hepatocellular carcinoma in Korea.J Viral Hepat，1995，2(4):195.
5 苏英豪，朱世能，陆世伦，等.用套式RT-PCR法检测肝细胞癌中丙型肝炎病毒基因型.复旦学报(医学科学版)，2000，1:20.
6 李江，王文亮，于欣欣，等.肝细胞肝癌组织中丙型肝炎病毒核心区基因及其表达产物的检测.中华临床和实验病毒学杂志，2000，1:38.
作者单位:110042沈阳辽宁省肿瘤医院
辽宁省人民医院
中国医科大学附属第一医院
(收稿日期:2004-01-08)
(编辑李 木), 百拇医药