反相高效液相色谱法测定人血浆中白藜芦醇甙的浓度
【摘要】 目的 建立反向高效液相色谱法测定人血浆中白藜芦醇甙(Polydatin;PD)浓度，为其临床药理研究提供测定方法。方法 色谱柱采用ZorbaXODS C18(4.6×250mm)柱，以甲醇-水(41:59V/V)为流动相，非那西汀(PH)为内标物，紫外λ/nm235检测。血浆样品用混合有机溶剂(乙酸乙酯:二氧甲烷2:1)提取吹干浓缩后进样，对人血浆中白藜芦醇甙的浓度进行测定。结果 方法的平均回收率为100.05%，日内平均标准偏差为1.63%～5.22%和日间平均标准偏差为2.66%-5.36%，有良好的线性关系。结论 方法能提供白藜芦醇甙血药浓度监测和药理研究的需要。
关键词 白藜芦醇甙 反相高效液相色谱法 人血浆
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)06-0490-02
Reversed-phase high performance liquid chromatography in determination
, 百拇医药
of polydatin concentration in human plasma
Chen Kunping
Xi-jiao People’s Hospital of Fo-shan Guangdong，528211.
【Abstract】 Objective To set up reversed-phase high performance liquid chromatography to detect the conˉcentration of polydatin in human plasma to search a better determinating method to study its clinical pharmacology.Method Zorba XODS(4.6×250mm)was used as chromatographic cylinder，methyl alcohol-aqueous(44:59v/v)as flow phase，phenacetin as a internal standard substance，to carry onviolet light(λ/nm235)detection.The plasma exˉample was extracted by mixtureof orgomic solvent and concentrated by blow-dryes.Then the plasma polydatin level was detected.Result The average rate of recovery of this method was100.05%.Within diurnal，mean standard deviˉation was1.63%～5.22%.The mean standard deviation between diurnals was2.66%～5.36%，there existed a linˉear relationship.Conclusion This method could determine the polydatin level in plasma and meet the need for its pharmacological study.
, 百拇医药
Key words polydatin reversed-pashase high performance liquid chromatographyhuman plasma
白藜芦醇甙(Polydatin;PD)是从蓼属植物虎杖根中提取的一种有效成分，又名虎杖晶Ⅳ号，化学名3，4，5-三羟基芪-3-B-单-D-葡萄糖甙，甙元为白藜芦醇(Resveraˉtrol)，糖部分为单-D-葡萄糖，分子式C 20 H 22 O 8 ·2H 2 O。PD具有改善微循环和明显的抗休克作用 [1] ，并有降压、降血脂、抗血小板聚集和抑制过氧化物引起的肝损害等作用 [2] ，本实验采用反相高效液相色谱法，在ZorbaXODS C18柱上以甲醇-水(41:59V/V)为流动相，非那西汀(PH)为内标物，测定了血浆中白藜芦醇甙的浓度，本实验操作简单、灵敏度高。
, 百拇医药
1 仪器、药品与试剂
岛津LC-6A高效液相色谱仪，SPD-6A紫外检测器，SCL-6A系统控制器，C-R4色谱数据处理机。非那西汀、白藜芦醇甙由佛山市药品检验所提供;水为纯化水、甲醇、二氧甲烷、乙酸乙酯为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:ZorbaXODS C18(4.6×250mm)柱，ODSC18(4.6×30mm)预柱;柱温:35℃;流动相:甲醇-水(41:59V/V);流速:0.9ml/min;检测波长:235nm;灵敏度0.01Aufs;进样量:20μ。样品的色谱图见图1。PD和PH与其他杂峰分离良好。
2.2 样品处理方法 于5ml具塞刻度离心管中加入血浆0.5ml和pH6磷酸缓冲液0.5ml，10%三氯醋酸0.2ml，置旋涡混合器上混旋30S，以转速为4000rpm离心10min，上清液加入混合有机溶剂(乙酸乙酯:二氧甲烷2:1)6ml分次提取，合并提取液，于75℃水浴上氮气流吹干，残留物加100μ流动相溶解，20μ进样。
, 百拇医药
2.3 标准曲线的制备 在一组5ml具塞刻度离心管中加入空白血浆0.5ml，精密加入不同量的白藜芦醇甙标准液，内标物非那西汀0.5g，使血药浓度分别为0.08、0.2、0.5、1.2、3.0、10.0μg/mg，按“样品处理方法”项下操作，按内标峰面积法得到的回归方程为:Y=-0.1564+6.1016X，r=0.9999。
2.4 回收率实验 在0.5ml空白血浆中精密加入不同量的白藜芦醇甙和一定量内标溶液。按“样品处理方法”进行测定，算出峰面积比，由标准曲线回归方程计算浓度和回归率(见表1)。结果测得的平均回收率为100.05%。
2.5 精密度实验 取浓度分别为0.5、3.0、10.0μg/ml的白藜芦醇甙标准液和一定量内标溶液加入空白血浆中，按“样品处理方法”项下操作，测得日内平均标准偏差为1.63%～5.22%和日间平均标准偏差为2.66%～5.36%。
表1 血浆总PD的回收率测定结果 加入量
, 百拇医药
3 讨论
3.1 本实验主要研究人血浆中白藜芦醇甙、内标非那西汀的提取方法及HPLC法的测定条件，实验中用混合有机溶剂(乙酸乙酯:二氧甲烷2:1)作提取溶剂，使分析样品中的待测物及内标物提取完全，若用单溶剂，则提取不完全。
3.2 样品处理方法中加入三氯醋酸作为蛋白沉淀剂，加缓冲液以防酸太强，提高PD的稳定性，混旋时间不宜过长(30S)，避免乳化发生，影响有机溶剂的分层提取。
3.3 研究表明，白藜芦醇甙在心血管、胃肠道、微循环、抗血小板聚集方面具有临床药理作用，并有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤的作用，近年在临床研究上取得了进展，实验证明，白藜芦醇甙静脉注入或直接涂敷均有扩张细动脉的作用，同时又能增加心搏出量和增加脉压差。在脉压差增大的情况下，细动脉口径增加有利于动脉血流传送到毛细血管，促 进毛细血管血流的恢复。脉压差的回升还可促进毛细血管的开放，高毛细血管开放率又提高了生物存活率，这对临床休克的防治有重要意义。
, 百拇医药
3.4 白藜芦醇甙对血小板聚集有明显的影响，白藜芦醇甙浓度为6.7～107.2μmol/L可明显抑制AA和ADP诱导的兔血小板聚集和TXB的产生，血小板聚集的抑制率分别为48%～69%;TXB产生的抑制率分别为50%～87%和43%～68%;血小板聚集的抑制率和血栓素产生的抑制率间呈显著的正相关。白藜芦醇甙对AA诱导的血小板聚集和TXB产生的ID是11.2mg和11.4mg，而对ADP诱导的血小板聚集和TXB产生的是23.3mg和23.0mg。说明白藜芦醇甙抑制AA作用比抑制ADP的作用强，以抑制环氧化酶为主。体内实验表明，白藜芦醇甙5mg/kg可明显地抑制AA、ADP诱导的血小板聚集作用，而对Ca 2+ 诱导的血小板聚集作用也有一定的抑制，以给药后60min时抑制作用更为明显。白藜芦醇甙还可能具有影响ADP和前列腺素复体功能、抑制Ca 2+ 内流、阻断血小板α复体等作用。(本文图片见附页)
参考文献
1 朱佐江，赵克森.虎杖4号对脉压差和微循环的影响.中国药学文摘，1990，7(6):55.
2 周立东，周希辉.虎杖煎剂对艾氏腹水癌的抑瘤作用.中西医结合杂志，1989，9(2):111.
作者单位:528211广东省佛山市南海区西樵人民医院
(收稿日期:2004-04-10)
(编辑黄 杰), 百拇医药
关键词 白藜芦醇甙 反相高效液相色谱法 人血浆
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)06-0490-02
Reversed-phase high performance liquid chromatography in determination
, 百拇医药
of polydatin concentration in human plasma
Chen Kunping
Xi-jiao People’s Hospital of Fo-shan Guangdong，528211.
【Abstract】 Objective To set up reversed-phase high performance liquid chromatography to detect the conˉcentration of polydatin in human plasma to search a better determinating method to study its clinical pharmacology.Method Zorba XODS(4.6×250mm)was used as chromatographic cylinder，methyl alcohol-aqueous(44:59v/v)as flow phase，phenacetin as a internal standard substance，to carry onviolet light(λ/nm235)detection.The plasma exˉample was extracted by mixtureof orgomic solvent and concentrated by blow-dryes.Then the plasma polydatin level was detected.Result The average rate of recovery of this method was100.05%.Within diurnal，mean standard deviˉation was1.63%～5.22%.The mean standard deviation between diurnals was2.66%～5.36%，there existed a linˉear relationship.Conclusion This method could determine the polydatin level in plasma and meet the need for its pharmacological study.
, 百拇医药
Key words polydatin reversed-pashase high performance liquid chromatographyhuman plasma
白藜芦醇甙(Polydatin;PD)是从蓼属植物虎杖根中提取的一种有效成分，又名虎杖晶Ⅳ号，化学名3，4，5-三羟基芪-3-B-单-D-葡萄糖甙，甙元为白藜芦醇(Resveraˉtrol)，糖部分为单-D-葡萄糖，分子式C 20 H 22 O 8 ·2H 2 O。PD具有改善微循环和明显的抗休克作用 [1] ，并有降压、降血脂、抗血小板聚集和抑制过氧化物引起的肝损害等作用 [2] ，本实验采用反相高效液相色谱法，在ZorbaXODS C18柱上以甲醇-水(41:59V/V)为流动相，非那西汀(PH)为内标物，测定了血浆中白藜芦醇甙的浓度，本实验操作简单、灵敏度高。
, 百拇医药
1 仪器、药品与试剂
岛津LC-6A高效液相色谱仪，SPD-6A紫外检测器，SCL-6A系统控制器，C-R4色谱数据处理机。非那西汀、白藜芦醇甙由佛山市药品检验所提供;水为纯化水、甲醇、二氧甲烷、乙酸乙酯为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:ZorbaXODS C18(4.6×250mm)柱，ODSC18(4.6×30mm)预柱;柱温:35℃;流动相:甲醇-水(41:59V/V);流速:0.9ml/min;检测波长:235nm;灵敏度0.01Aufs;进样量:20μ。样品的色谱图见图1。PD和PH与其他杂峰分离良好。
2.2 样品处理方法 于5ml具塞刻度离心管中加入血浆0.5ml和pH6磷酸缓冲液0.5ml，10%三氯醋酸0.2ml，置旋涡混合器上混旋30S，以转速为4000rpm离心10min，上清液加入混合有机溶剂(乙酸乙酯:二氧甲烷2:1)6ml分次提取，合并提取液，于75℃水浴上氮气流吹干，残留物加100μ流动相溶解，20μ进样。
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2.3 标准曲线的制备 在一组5ml具塞刻度离心管中加入空白血浆0.5ml，精密加入不同量的白藜芦醇甙标准液，内标物非那西汀0.5g，使血药浓度分别为0.08、0.2、0.5、1.2、3.0、10.0μg/mg，按“样品处理方法”项下操作，按内标峰面积法得到的回归方程为:Y=-0.1564+6.1016X，r=0.9999。
2.4 回收率实验 在0.5ml空白血浆中精密加入不同量的白藜芦醇甙和一定量内标溶液。按“样品处理方法”进行测定，算出峰面积比，由标准曲线回归方程计算浓度和回归率(见表1)。结果测得的平均回收率为100.05%。
2.5 精密度实验 取浓度分别为0.5、3.0、10.0μg/ml的白藜芦醇甙标准液和一定量内标溶液加入空白血浆中，按“样品处理方法”项下操作，测得日内平均标准偏差为1.63%～5.22%和日间平均标准偏差为2.66%～5.36%。
表1 血浆总PD的回收率测定结果 加入量
, 百拇医药
3 讨论
3.1 本实验主要研究人血浆中白藜芦醇甙、内标非那西汀的提取方法及HPLC法的测定条件，实验中用混合有机溶剂(乙酸乙酯:二氧甲烷2:1)作提取溶剂，使分析样品中的待测物及内标物提取完全，若用单溶剂，则提取不完全。
3.2 样品处理方法中加入三氯醋酸作为蛋白沉淀剂，加缓冲液以防酸太强，提高PD的稳定性，混旋时间不宜过长(30S)，避免乳化发生，影响有机溶剂的分层提取。
3.3 研究表明，白藜芦醇甙在心血管、胃肠道、微循环、抗血小板聚集方面具有临床药理作用，并有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤的作用，近年在临床研究上取得了进展，实验证明，白藜芦醇甙静脉注入或直接涂敷均有扩张细动脉的作用，同时又能增加心搏出量和增加脉压差。在脉压差增大的情况下，细动脉口径增加有利于动脉血流传送到毛细血管，促 进毛细血管血流的恢复。脉压差的回升还可促进毛细血管的开放，高毛细血管开放率又提高了生物存活率，这对临床休克的防治有重要意义。
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3.4 白藜芦醇甙对血小板聚集有明显的影响，白藜芦醇甙浓度为6.7～107.2μmol/L可明显抑制AA和ADP诱导的兔血小板聚集和TXB的产生，血小板聚集的抑制率分别为48%～69%;TXB产生的抑制率分别为50%～87%和43%～68%;血小板聚集的抑制率和血栓素产生的抑制率间呈显著的正相关。白藜芦醇甙对AA诱导的血小板聚集和TXB产生的ID是11.2mg和11.4mg，而对ADP诱导的血小板聚集和TXB产生的是23.3mg和23.0mg。说明白藜芦醇甙抑制AA作用比抑制ADP的作用强，以抑制环氧化酶为主。体内实验表明，白藜芦醇甙5mg/kg可明显地抑制AA、ADP诱导的血小板聚集作用，而对Ca 2+ 诱导的血小板聚集作用也有一定的抑制，以给药后60min时抑制作用更为明显。白藜芦醇甙还可能具有影响ADP和前列腺素复体功能、抑制Ca 2+ 内流、阻断血小板α复体等作用。(本文图片见附页)
参考文献
1 朱佐江，赵克森.虎杖4号对脉压差和微循环的影响.中国药学文摘，1990，7(6):55.
2 周立东，周希辉.虎杖煎剂对艾氏腹水癌的抑瘤作用.中西医结合杂志，1989，9(2):111.
作者单位:528211广东省佛山市南海区西樵人民医院
(收稿日期:2004-04-10)
(编辑黄 杰), 百拇医药