中国人WD基因启动子区的DNA序列和结构分析(基金项目)
基金项目:卫生部与中山大学共建“211工程”重点建设项目基金;广东省自然科学基金(21894);深圳市科技计划项目(200304246)
【摘要】 目的 研究中国人肝豆状核变性基因启动子区的DNA序列和结构。方法 提取20名正常人的基因组DNA，用PCR方法扩增出WD基因启动子区，进行测序。结果 (1)启动子区长度为1388bp，AT含量为35.4%，GC含量为64.6%;(2)存在2个12bp的正向重复顺序:GGCACGGCAGAG;(3)存在的基因转录调控元件:①顺式作用元件:CAAT box、GC box、E-box;②转录调控因子结合位点:Sp1、AP1、AP2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EBP;③应答元件:(4)个金属应答元件(MRE)和6个类金属应答元件(MLS，MRE-like sequence);(4)在启动子的-190、-78、+260位存在核苷酸多态。结论 启动子区在调控WD基因转录活性中起重要的作用，提示WD基因的转录直接受铜或其它金属的调节。
, 百拇医药
关键词 肝豆状核变性 基因 启动子
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)06-0481-03
The study on the sequence and structure of the promoter
region of WD gene in Chinese
Yang Chunshui，Liang Xiuling，Yan Zhenwen，et al.
Department of Neurology，Nanshan Hospital，Shenzhen，Guangdong518052.
【Abstract】 Objective To study the sequence and structure of the promoterregion in Chinese.Methods DNA from peripheral blood was obtained from20subject enrolled into the study.DNA sequence and structure of the promoter region of WD gene were analyzed by PCR amplification and direct genomic sequencing.Results (1)The promoter is1388bp in length，with AT content35.4%and GC content64.6%.(2)There are two12bp direct repeats:GGCACGGCAGAG.(3)There are some known regulatory elements:Cis-acting elements:CAAT box，GC box，E-box;Binding consensus sequence for transcription regulatory factors:Sp1，Ap1，Ap2，HNF1，HNF3，CTF，NF1，C/EBP;Response elements:4metal response elements，6metal response elements like sequence.(4)There were three polymorˉphisms at positions-190，-78，+260(transcription start site as+1)of the promoter region of WD geneoutside of the transcription regulatory elements in Chinese population.Conclusion It suggested transcription of WD gene may be regulated by copper and other metal ions.This study helps further understanding about Chinese WD gene’s regulaˉtions at the level of transcription.
, 百拇医药
Key words Wilson disease gene promoter
肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson disease，WD)，是我国较常见的常染色体隐性遗传疾病，其病理生理学基础是铜代谢障碍。自1993年Bull等成功克隆WD基因以来，对WD基因研究取得长足的进步 [1] 。到2002年底全世界已发现超过190种的突变。在研究中发现:不管采用的实验技术如何先进，在外显子和外显子/内含子交界区检出的突变率在60%～80%之间，说明部分病人的分子发病机制尚不明确，可能与外显子和外显子/内含子交界区以外的DNA序列如内含子、启动子区发生突变有关。到目前为止，国内尚未见对WD基因启动子区进行系统研究的报道。本研究组在以往WD基因外显子、内含子研究的基础上 [2～4] ，在国内首先开展了启动子的研究。
1 对象与方法
1.1 研究对象 20例中10例为门诊随机抽样的头痛、头昏患者，10例为中山大学一年级大学生，男12例，女8例，无遗传病家族史，相互间无血缘关系。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 制备基因组DNA 取外周静脉血10ml，ACD抗凝，常规酚-氯仿抽提。
1.2.2 PCR扩增 PCR扩增全部由PE9600型PCR仪完成，启动子的PCR扩增反应体积为50μl。反应液含:基因组DNA0.5～1μg，引物各为50pmol，10mmol/L的4种dNTP混合液8μl，TaKaRa LA Taq TM DNA聚合酶1μl(5U/μl)，2×GC缓冲液25μl。PCR扩增条件为:94℃变性1min，然后以下列温度和时间做30个循环:98℃10s，55℃30s，72℃70s，最后72℃延伸7min。设计的PCR扩增上游引物位于WD基因翻译启始密码子ATG前约1400bp，下游引物位于WD基因1号内含子的5′端，扩增产物长度约为1500bp，包括启动子区、1号外显子。PCR扩增引物:上游引物序列为:5′-TGAAGCACGˉGCAGAGTACTC-3′，下游引物序列为:5′-AACGCGGCˉGATAATCCT-3′。
, http://www.100md.com
1.2.3 DNA序列测定 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用基因公司QIAquick Gel Extraction试剂盒回收扩增片段，采用美国PE公司的Bigdye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒及在310、377型自动DNA测序仪上进行测序，具体操作步骤按PE公司介绍的操作指南。因PCR扩增片段长度约为1500bp，用4对测序引物进行分段双向测序，每个相邻引物的测序结果有150～200bp的重叠。
1.2.4 DNA测序结果分析 以DNAtools和DNAclub软件包进行。
2 结果
2.1 PCR扩增出含WD基因启动子区、1号外显子的DNA片段 所设计的上游引物位于WD基因翻译起始密码子ATG前1388bp，下游引物位于WD基因1号内含子的5′端，PCR扩增出含WD基因启动子区、1号外显子的DNA片段，片段长度约为1500bp左右。见图1。
, 百拇医药
图1 启动子区PCR扩增产物凝胶电泳图(泳道1为空白对照)
2.2 PCR扩增片段的DNA序列测定 将经凝胶回收后的PCR产物进行直接DNA测序，测序引物为PCR扩增的上下游引物(1、4)及根据上游引物的测序结果在每400bp左右设计的另2个测序引物。每个测序反应的可读长度为500～600bp，用1和2、2和3、3和4测序引物测定的可读序列有150～200bp的重叠区。
2.3 启动子区的序列分析结果(详见图2) 将所有正常对照全长启动子区的测序结果输入计算机，用DNAtools和DNAclub软件进行分析翻译起始密码子ATG前的序列，得出以下结果:(1)启动子区长度均为1388bp，AT含量为35.4%，GC含量为64.6%;(2)存在2个12bp的正向重复顺序:GGCACGGCAGAG;(3)存在的基因转录调控元件:①顺式作用元件:CAAT box、GC box、E-box;②转录调控因子结合位点:Sp1、AP1、AP2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EBP;③应答元件4个金属应答元件(MRE)和6个类金属应答元件(MLS，MRE-like sequence)。
, 百拇医药
2.4 在启动子的-78、-190、+260位核苷酸存在多态 在启动子的-78、-190和+260位(转录起始点为+1)发现存在单个碱基的不同，是核苷酸的多态。见图3、4、5和表1。
表1 -78、-190、+260位核苷酸多态分布
3 讨论
近年来，本研究组一直致力于WD分子发病机制的研 究。启动子区是调控WD基因表达的主要调控区域，在国内尚未有对启动子区研究的报道，我们认为有必要对其进行系统的研究。启动子(promoter)是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。如将启动子和其上游远处的转录调控蛋白的结合位点包括在一起，叫做启动子区(promoter region)。一个真核基因通常有多个调控序列，主要存在于启动子区域 [5] 。国外有研究报道WD基因启动子区的序列的结构，发现存在多个调控成分(元件) [6，7] 。但对中国人的WD基因启动子区的序列和结构特点尚未有相关的报道。中国人该区域的序列是否与外国人群一样，结构上有无特殊性，是一个有待探讨的问题。本实验对20个正常人基因启动子区DNA序列进行了测序，除在3个位点发现核苷酸有多态外，其它的序列与国外报道一致。DNA序列分析在启动子区发现十余种多个转录调控元件，即能与调控蛋白特异结合、启动基因表达的短DNA序列:包括CAAT box、GC box、E-box，转录调控因子Sp1、AP1、AP2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EB结合位点，及多个金属应答元件和类金属应答元件。上述转录调控元件与转录调控因子及尚未发现的转录调控因子结合，导致WD基因表达的激活。在WD基因启动子区近转录起始点没有发现存在TATA框，可见它属于不典型的启动子。这类启动子的5′上游没有TATA框，但有富含GC的上游序列，常有1个以上的Sp1结合位点(GGGCGG)，Sp1的存在对基因基础转录的活化有重要作用 [8] 。本研究在启动子区发现多个金属应答元件和类金属应答元件，有趣的是这些元件与在金属巯蛋白(MT)基因的启动子区发现的一致，它们在金属巯蛋白基因启动子区的作用已经被研究过 [9] 。在金属调控基因中，对重金属起反应是不依赖与MRE的位置和方向，但至少需要2个以上的拷贝。金属巯蛋白保护细胞对抗过多的重金属，在一般情况下基因以一个基本的水平进行表达，但在重金属离子的诱导下则以高水平表达。金属巯蛋白基因启动子区的多个MRE序列担负对金属的诱导性应答作用[9，10] 。由于在WD基因的启动子区发现了与金属巯蛋白基因一致的MRE和MLS序列，我们认为这些序列可能是金属依赖性转录调控因子的结合位点，在调控WD基因转录活性中起重要的作用，提示WD基因的转录直接受铜或其它金属的调节。
, 百拇医药
本实验发现在启动子区的-190位、-78位、+260位点出现单个碱基的不同，如-190位点为T、C或T(C)杂合，这种现象在正常人出现，是核苷酸多态。经分析发现核苷酸多态位点均位于已知的转录调控元件结构之外。在Loudianos等对撒丁岛人群中WD患者基因启动子区的研究中没有类似的发现 [7] 。由于国内外对WD基因启动子进行系统研究的报道仅1篇，尚不能认定这些多态为在中国人群所特有的。这些多态的存在有何意义，是否影响基因的表达及是否与ATP7B的活性改变即与发病有关，值得进一步的深入研究。对WD分子发病机制的研究仍是WD基因研究的热点，国内外每年均有大量的研究报道。明确中国人WD基因启动子区的序列和结构，通过进一步的实验探讨突变与启动子区活性的关系，是本研究的主要目的。为WD的转基因研究特别是基因治疗打下基础。(图2～图5见附页1和附页2)
参考文献
1 Bull C，Thomas R，Rommens M，et al.The Wilson disease gene is a puˉtative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene.Nat Genet，1993，5:327-336.
, 百拇医药
2 杨春水，梁秀龄，闫振文，等.肝豆状核变性基因8号内含子的研究.中国神经精神科杂志，2001，27(3):89-92.
3 徐评议，梁秀龄，刘焯霖，等.Wilson’s病家系基因突变分析.中华医学遗传学杂志，1999，16(2)88-90.
4 徐评议，梁秀龄，刘焯霖，等.肝豆状核变性基因突变的研究.中国神经精神科杂志，1998，24(1):12-14.
5 Pedersen AG，Baldi P，ChauvinY，et al.The biology of eukaryotic proˉmoterprediction.Comput Chem，1999，23(3-4):191-207.
6 Won Jun Oh，Eun Kyung Kim，Kee Don Park，et al.Cloning and characˉ terization of the promoter region of the Wilson disease gene.Bioch Bioˉphys Res Commun，1999，259，206-211.
, http://www.100md.com
7 Loudianos G，Dessi V，Lovicu M，et al.Molecular characterization of WilsonDsease in the Sardinian population-evidence of a founder efˉfect.Human Mutation，1999，14，294-303.
8 Oeth P，Parry GC，Mackman N.Regulation of the tissue factor gene in human monocytic cells.Role of Ap1，NF-Kappa，B/Rel，and SP1proˉteins in uninduced expression.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17，365-371.
9 Sadhu C，Gedamu L.Regulation of human metallothionein(MT)gene.J Biol Chem，1988，263(6):2679-2684.
10 Bremner I.Involvement of metallothionein in the hepatic metabolism of copper.J Nutr，1987，117:19-29.
作者单位:518052广东省深圳市南山区人民医院神经内科
中山大学附属第一医院神经科
(收稿日期:2004-05-21)
(编辑秋 实), http://www.100md.com
【摘要】 目的 研究中国人肝豆状核变性基因启动子区的DNA序列和结构。方法 提取20名正常人的基因组DNA，用PCR方法扩增出WD基因启动子区，进行测序。结果 (1)启动子区长度为1388bp，AT含量为35.4%，GC含量为64.6%;(2)存在2个12bp的正向重复顺序:GGCACGGCAGAG;(3)存在的基因转录调控元件:①顺式作用元件:CAAT box、GC box、E-box;②转录调控因子结合位点:Sp1、AP1、AP2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EBP;③应答元件:(4)个金属应答元件(MRE)和6个类金属应答元件(MLS，MRE-like sequence);(4)在启动子的-190、-78、+260位存在核苷酸多态。结论 启动子区在调控WD基因转录活性中起重要的作用，提示WD基因的转录直接受铜或其它金属的调节。
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关键词 肝豆状核变性 基因 启动子
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2004)06-0481-03
The study on the sequence and structure of the promoter
region of WD gene in Chinese
Yang Chunshui，Liang Xiuling，Yan Zhenwen，et al.
Department of Neurology，Nanshan Hospital，Shenzhen，Guangdong518052.
【Abstract】 Objective To study the sequence and structure of the promoterregion in Chinese.Methods DNA from peripheral blood was obtained from20subject enrolled into the study.DNA sequence and structure of the promoter region of WD gene were analyzed by PCR amplification and direct genomic sequencing.Results (1)The promoter is1388bp in length，with AT content35.4%and GC content64.6%.(2)There are two12bp direct repeats:GGCACGGCAGAG.(3)There are some known regulatory elements:Cis-acting elements:CAAT box，GC box，E-box;Binding consensus sequence for transcription regulatory factors:Sp1，Ap1，Ap2，HNF1，HNF3，CTF，NF1，C/EBP;Response elements:4metal response elements，6metal response elements like sequence.(4)There were three polymorˉphisms at positions-190，-78，+260(transcription start site as+1)of the promoter region of WD geneoutside of the transcription regulatory elements in Chinese population.Conclusion It suggested transcription of WD gene may be regulated by copper and other metal ions.This study helps further understanding about Chinese WD gene’s regulaˉtions at the level of transcription.
, 百拇医药
Key words Wilson disease gene promoter
肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson disease，WD)，是我国较常见的常染色体隐性遗传疾病，其病理生理学基础是铜代谢障碍。自1993年Bull等成功克隆WD基因以来，对WD基因研究取得长足的进步 [1] 。到2002年底全世界已发现超过190种的突变。在研究中发现:不管采用的实验技术如何先进，在外显子和外显子/内含子交界区检出的突变率在60%～80%之间，说明部分病人的分子发病机制尚不明确，可能与外显子和外显子/内含子交界区以外的DNA序列如内含子、启动子区发生突变有关。到目前为止，国内尚未见对WD基因启动子区进行系统研究的报道。本研究组在以往WD基因外显子、内含子研究的基础上 [2～4] ，在国内首先开展了启动子的研究。
1 对象与方法
1.1 研究对象 20例中10例为门诊随机抽样的头痛、头昏患者，10例为中山大学一年级大学生，男12例，女8例，无遗传病家族史，相互间无血缘关系。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 制备基因组DNA 取外周静脉血10ml，ACD抗凝，常规酚-氯仿抽提。
1.2.2 PCR扩增 PCR扩增全部由PE9600型PCR仪完成，启动子的PCR扩增反应体积为50μl。反应液含:基因组DNA0.5～1μg，引物各为50pmol，10mmol/L的4种dNTP混合液8μl，TaKaRa LA Taq TM DNA聚合酶1μl(5U/μl)，2×GC缓冲液25μl。PCR扩增条件为:94℃变性1min，然后以下列温度和时间做30个循环:98℃10s，55℃30s，72℃70s，最后72℃延伸7min。设计的PCR扩增上游引物位于WD基因翻译启始密码子ATG前约1400bp，下游引物位于WD基因1号内含子的5′端，扩增产物长度约为1500bp，包括启动子区、1号外显子。PCR扩增引物:上游引物序列为:5′-TGAAGCACGˉGCAGAGTACTC-3′，下游引物序列为:5′-AACGCGGCˉGATAATCCT-3′。
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1.2.3 DNA序列测定 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用基因公司QIAquick Gel Extraction试剂盒回收扩增片段，采用美国PE公司的Bigdye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒及在310、377型自动DNA测序仪上进行测序，具体操作步骤按PE公司介绍的操作指南。因PCR扩增片段长度约为1500bp，用4对测序引物进行分段双向测序，每个相邻引物的测序结果有150～200bp的重叠。
1.2.4 DNA测序结果分析 以DNAtools和DNAclub软件包进行。
2 结果
2.1 PCR扩增出含WD基因启动子区、1号外显子的DNA片段 所设计的上游引物位于WD基因翻译起始密码子ATG前1388bp，下游引物位于WD基因1号内含子的5′端，PCR扩增出含WD基因启动子区、1号外显子的DNA片段，片段长度约为1500bp左右。见图1。
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图1 启动子区PCR扩增产物凝胶电泳图(泳道1为空白对照)
2.2 PCR扩增片段的DNA序列测定 将经凝胶回收后的PCR产物进行直接DNA测序，测序引物为PCR扩增的上下游引物(1、4)及根据上游引物的测序结果在每400bp左右设计的另2个测序引物。每个测序反应的可读长度为500～600bp，用1和2、2和3、3和4测序引物测定的可读序列有150～200bp的重叠区。
2.3 启动子区的序列分析结果(详见图2) 将所有正常对照全长启动子区的测序结果输入计算机，用DNAtools和DNAclub软件进行分析翻译起始密码子ATG前的序列，得出以下结果:(1)启动子区长度均为1388bp，AT含量为35.4%，GC含量为64.6%;(2)存在2个12bp的正向重复顺序:GGCACGGCAGAG;(3)存在的基因转录调控元件:①顺式作用元件:CAAT box、GC box、E-box;②转录调控因子结合位点:Sp1、AP1、AP2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EBP;③应答元件4个金属应答元件(MRE)和6个类金属应答元件(MLS，MRE-like sequence)。
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2.4 在启动子的-78、-190、+260位核苷酸存在多态 在启动子的-78、-190和+260位(转录起始点为+1)发现存在单个碱基的不同，是核苷酸的多态。见图3、4、5和表1。
表1 -78、-190、+260位核苷酸多态分布
3 讨论
近年来，本研究组一直致力于WD分子发病机制的研 究。启动子区是调控WD基因表达的主要调控区域，在国内尚未有对启动子区研究的报道，我们认为有必要对其进行系统的研究。启动子(promoter)是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。如将启动子和其上游远处的转录调控蛋白的结合位点包括在一起，叫做启动子区(promoter region)。一个真核基因通常有多个调控序列，主要存在于启动子区域 [5] 。国外有研究报道WD基因启动子区的序列的结构，发现存在多个调控成分(元件) [6，7] 。但对中国人的WD基因启动子区的序列和结构特点尚未有相关的报道。中国人该区域的序列是否与外国人群一样，结构上有无特殊性，是一个有待探讨的问题。本实验对20个正常人基因启动子区DNA序列进行了测序，除在3个位点发现核苷酸有多态外，其它的序列与国外报道一致。DNA序列分析在启动子区发现十余种多个转录调控元件，即能与调控蛋白特异结合、启动基因表达的短DNA序列:包括CAAT box、GC box、E-box，转录调控因子Sp1、AP1、AP2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EB结合位点，及多个金属应答元件和类金属应答元件。上述转录调控元件与转录调控因子及尚未发现的转录调控因子结合，导致WD基因表达的激活。在WD基因启动子区近转录起始点没有发现存在TATA框，可见它属于不典型的启动子。这类启动子的5′上游没有TATA框，但有富含GC的上游序列，常有1个以上的Sp1结合位点(GGGCGG)，Sp1的存在对基因基础转录的活化有重要作用 [8] 。本研究在启动子区发现多个金属应答元件和类金属应答元件，有趣的是这些元件与在金属巯蛋白(MT)基因的启动子区发现的一致，它们在金属巯蛋白基因启动子区的作用已经被研究过 [9] 。在金属调控基因中，对重金属起反应是不依赖与MRE的位置和方向，但至少需要2个以上的拷贝。金属巯蛋白保护细胞对抗过多的重金属，在一般情况下基因以一个基本的水平进行表达，但在重金属离子的诱导下则以高水平表达。金属巯蛋白基因启动子区的多个MRE序列担负对金属的诱导性应答作用[9，10] 。由于在WD基因的启动子区发现了与金属巯蛋白基因一致的MRE和MLS序列，我们认为这些序列可能是金属依赖性转录调控因子的结合位点，在调控WD基因转录活性中起重要的作用，提示WD基因的转录直接受铜或其它金属的调节。
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本实验发现在启动子区的-190位、-78位、+260位点出现单个碱基的不同，如-190位点为T、C或T(C)杂合，这种现象在正常人出现，是核苷酸多态。经分析发现核苷酸多态位点均位于已知的转录调控元件结构之外。在Loudianos等对撒丁岛人群中WD患者基因启动子区的研究中没有类似的发现 [7] 。由于国内外对WD基因启动子进行系统研究的报道仅1篇，尚不能认定这些多态为在中国人群所特有的。这些多态的存在有何意义，是否影响基因的表达及是否与ATP7B的活性改变即与发病有关，值得进一步的深入研究。对WD分子发病机制的研究仍是WD基因研究的热点，国内外每年均有大量的研究报道。明确中国人WD基因启动子区的序列和结构，通过进一步的实验探讨突变与启动子区活性的关系，是本研究的主要目的。为WD的转基因研究特别是基因治疗打下基础。(图2～图5见附页1和附页2)
参考文献
1 Bull C，Thomas R，Rommens M，et al.The Wilson disease gene is a puˉtative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene.Nat Genet，1993，5:327-336.
, 百拇医药
2 杨春水，梁秀龄，闫振文，等.肝豆状核变性基因8号内含子的研究.中国神经精神科杂志，2001，27(3):89-92.
3 徐评议，梁秀龄，刘焯霖，等.Wilson’s病家系基因突变分析.中华医学遗传学杂志，1999，16(2)88-90.
4 徐评议，梁秀龄，刘焯霖，等.肝豆状核变性基因突变的研究.中国神经精神科杂志，1998，24(1):12-14.
5 Pedersen AG，Baldi P，ChauvinY，et al.The biology of eukaryotic proˉmoterprediction.Comput Chem，1999，23(3-4):191-207.
6 Won Jun Oh，Eun Kyung Kim，Kee Don Park，et al.Cloning and characˉ terization of the promoter region of the Wilson disease gene.Bioch Bioˉphys Res Commun，1999，259，206-211.
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7 Loudianos G，Dessi V，Lovicu M，et al.Molecular characterization of WilsonDsease in the Sardinian population-evidence of a founder efˉfect.Human Mutation，1999，14，294-303.
8 Oeth P，Parry GC，Mackman N.Regulation of the tissue factor gene in human monocytic cells.Role of Ap1，NF-Kappa，B/Rel，and SP1proˉteins in uninduced expression.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17，365-371.
9 Sadhu C，Gedamu L.Regulation of human metallothionein(MT)gene.J Biol Chem，1988，263(6):2679-2684.
10 Bremner I.Involvement of metallothionein in the hepatic metabolism of copper.J Nutr，1987，117:19-29.
作者单位:518052广东省深圳市南山区人民医院神经内科
中山大学附属第一医院神经科
(收稿日期:2004-05-21)
(编辑秋 实), http://www.100md.com