脊髓损伤基因治疗的研究现状及应用前景
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2004年8月20日
基因治疗 脊髓损伤(SCI) 2004-8-2 15:54:59 中国脊柱脊髓杂志1999年第9卷第6期
基因治疗(gene therapy)是当前生物医学发展较快的领域。基因治疗在脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后轴突再生中亦可望成为有效的手段之一〔1～4〕。利用外源基因在靶细胞(包括神经元)中的表达来改变神经元某些内在特性，从而进一步探索SCI后神经元的存活能力、再生特性和功能恢复的分子机理，最终为SCI的治疗探讨新途径，是目前治疗SCI的研究方向。它有助于把SCI治疗提到一个新的水平，值得我们进一步研究。
1 SCI基因治疗的有关分子生物学基础
基因转移(gene transfer)是实现基因治疗的关键技术。因此，基因治疗的首要步骤是转导基因的分子构建。一般转导基因由目的基因cDNA、启动子/增强子和载体三部分组成。目的基因重组时除本身特有的(cDNA)序列外，通常还需进行必要的修饰，如转录起始修饰、翻译起始、内含子和聚腺苷酸化信号等的修饰。用于重组的启动子/增强子一般有三种：强组成型(strong constitative)、管家型(house keeping)及组织特异型(tissure sepeifid)，其中最常用的为第一型。理想的体内基因转移载体要求转移具有细胞靶向性，导入基因的表达可调控，而且转移的方法简便易行。用于SCI的基因转移载体主要是逆转录病毒载体(retroviral vector)，即乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒和劳斯肉瘤病毒等。构建转录病毒载体的基本原理是：病毒的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)可以对插入的外源基因进行有效转录，先在体外构建反转录病毒前病毒DNA载体，即酶切去除基因组中的反式作用区域(如含gag、pol、env基因区域)，产生缺陷型的反转录病毒，这种病毒只具有控制感染和整合的序列(即顺式作用区域)。缺陷型病毒载体必须依赖包装细胞提供的蛋白质才能完成包装，产生带有外源基因的伪病毒。它能感染受体细胞、载体DNA将依靠其LTR整合入受体细胞染色体基因组，这样外源基因被带入宿主细胞并得以表达〔1、2、5〕。逆转录病毒载体感染率高，最常用于体外间接基因治疗，其缺点是要求靶细胞必须有增殖和分裂特性〔6〕。此外，Cao等〔7〕研究用阳离子脂质体直接注入CNS作基因转移获得成功。但因阳离子脂质体对CNS有毒性，故目前致力于发展非病毒技术，一种阳离子多聚体——聚乙烯亚胺(polyethyl-enimine)已用于基因转移〔8〕。
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在SCI治疗中，由于受体细胞要植入脊髓内，因此所用受体细胞应当符合一定的标准〔3〕：①容易获取和繁殖；②移植后能长期存活且能继续分裂和具有活力；③无免疫源性及形成肿瘤的危险。目前已用于SCI试验的有雪旺氏细胞(Schwann cell,SC)和成纤维细胞〔1、2、9〕。此外，肌母细胞也是具有应用前景的较好受体细胞，研究表明肌母细胞转移至CNS至少可活6个月，且无肿瘤源性〔10〕。
基因治疗的实施有赖于将目的基因准确、高效地转入靶细胞，并使之安全、高效和可控地表达。基因治疗中基因转移的策略主要有两种，即活体外法(exvivo approach)和在体法(invivo approach)。活体外法就是在体外先对适当细胞进行遗传修饰，使其表达和分泌特定的重组蛋白，然后将修饰细胞移植入活体神经组织，通过神经递质替代或神经营养因子(neurotrophic factor,NTF)和/或其它治疗因子的引入恢复正常的神经功能。这种方法尤其适于因缺乏NTF或神经递质前体分子等可扩散物质所致的CNS疾病,如帕金森氏病(Parkinson′s disease,PD)及CNS损伤。此外，活体外法可采用自体的工程细胞移植，在体外可对高表达细胞克隆进行筛选，有效地控制移植细胞的数量和质量，应用立体定位和成像技术可以将工程细胞十分准确地移植到CNS特定的区域内，以保证在局部产生高浓度的治疗因子。由于在体法是利用适当的重组病毒或化学基因转移载体，将目的基因及有治疗作用的重组蛋白直接转移的效率较低，故较少采用。
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2 基因治疗SCI的现状和展望
基因治疗SCI尚处于实验探索阶段。目前，主要是采用NTF基因修饰SC或成纤维细胞后再将其植入鼠的脊髓损伤区，观察其轴突再生的情况〔1、2、9〕。Tuszysnki〔9〕将神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因导入培养的SC内，再将SC移植到损伤的脊髓，发现其在体内能稳定地表达NGF并促进轴突的再生。同年Tuszynski等利用来源于莫洛氏鼠白血病的逆转录病毒载体，将人的NGF基因导入鼠成纤维细胞中，再将成纤维细胞移植到半横贯损伤的鼠脊髓中(T7平面)。1年后成纤维细胞仍能表达NGF，电镜及免疫组化(CGRP)检查，发现有大量的脊髓轴突再生(感觉纤维)。1996年，Tuszynski等〔2〕采用同样方法，又将NGF基因导入成纤维细胞中，并将其移植到半横断损伤的鼠脊髓中(T7平面)，14个月后，通过RT-PCR技术鉴定成纤维细胞仍表达NGF。电镜、免疫组化(GFAP、CHAT、TH、5-HT，CGRP)检查发现有大量的(感觉和运动)轴突再生。Blesch等〔11〕又将这种方法用于慢性脊髓损伤的试验。于伤后1～3个月才植入转NGF基因的细胞，发现直到移植后3～5个月移植区都有明显的基因表达和轴索再生。笔者(1997～1998年)在国际上首次构建Po-5′-flanking介导的21.5KD髓鞘碱性蛋白微基因(暂命名为pSVPoMcat)的基础上，通过阳离子脂质体导入SC中，然后再将基因修饰的SC移植入成鼠半横断损伤脊髓，观察其对SCI的再生修复作用，现已发现pSVPoMcat微基因修饰SC对SCI后细胞凋亡有抑制作用，并促进损伤脊髓的再生〔12、13〕。
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当然利用基因转移技术治疗SCI，目前还存在一些尚待解决的问题，一是免疫排斥反应，即宿主对移植细胞的免疫排斥。因为尽管CNS的免疫应答能力微弱，但对抗原较强的或种属相关较远的受体细胞仍具有免疫排斥反应。因此，在细胞移植时应给予免疫抑制剂，最好使用自体工程细胞移植，亦可采用免疫隔离(immuno isolation)法即使用微囊包膜(mincroencapsulat)的工程细胞〔14〕。第二是移植细胞的长时程存活问题。因为在细胞移植部位，宿主内源性细胞系统对局部组织损伤的病理生理反应过程可能使部分移植细胞死亡。如果移植入外来组织细胞的体积较大，还可能对宿主组织及细胞产生机械性挤压，从而影响其结构与功能的完整性，因此，在移植方式上应该使用微移植(microtransplantation,Mit)技术。Nikknak〔15〕曾采用外径50～70μm微管的点移植，量为0.2μl，而细胞密度很大(每微升达125.0个)，达到以尽可能小的量移植尽可能多的细胞,对宿主造成的创伤亦小。第三是遗传修饰细胞移植后转移基因的表达可能会随着时间的延长而逐渐下降，以致失去治疗作用。故而利用内源性或外源性调节因子主动调节转移基因的表达极为重要〔5〕。
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综上所述，在SCI的再生修复治疗中，尽管基因转移所取得的结果均来自实验报告，但却具有十分诱人的临床应用前景。随着分子生物学的发展，我们可以把有丝分裂促进剂的基因插入成熟神经元的基因组,成熟神经元便有可能一改不能分裂的状态而变为能够自行繁殖并再生修补损伤所造成的缺损，从而使脊髓组织象外周神经那样具有生长愈合的能力。就目前情况而言，我们完全可以将对神经再生有利的基因(如NGF基因)导入自体工程细胞(如SC)以增强其功能，进一步促进脊髓的再生,进而恢复功能。如此，脊髓横贯损伤截瘫者重新站起来的愿望将有可能成为现实。
作者单位：陈礼刚 成都军区总医院神经外科 610083 四川省成都市
高立达 华西医科大学附一院神经外科
参考文献
1 Tuszynski MH,Peterson DA,Jadodhara Rag,et al.Fibroblastsgenetically modified to produce nerve growth factor induce robust neuritic ingrowth after grafting to the spinal cord.Exp Neurol,1994,126:1.
, 百拇医药
2 Tuszynski MH,Gabriel K,Gage FH,et al.Nerve growth factor delivery by gene transfer induce differential outgrowth of sensory,motor and noradrenergeic neurites after spinal cord injury.Exp Neurol,1996,127:157.
3 Gage FH,Kawaja MD,Fisher LJ.Genetically modified cells:applications for intracerebral grafting.TINS,1991,14(8):328.
4 Tuszynski MH,Gage.Maintaining the neuronal phenotype after injury in the adult CNS neurotrophic factors,axonal growth substraters and gene therapy.Molecular Neurobiology,1995,10:151.
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5 Karpati G,Lochmuler H,Naibantoglu J,et al.The principles of gene tharapy for hte nervous system.TINS,1996,19(2)：49.
6 Karen SC,Fred HG.Somatic gene transfer of NGF to the aged brain behavioural and mophological amelioration.J Neurosci,1995,15:2811.
7 Cao L,Zhengac,Ahao YC,et al.Gene therapy of parkinson disease mode rat by direct injection of plasmid DNA,Lipofection complex.Human Gene Therapy,1995,6:1497.
, 百拇医药
8 Boussif O,lezoualch F,Zanta MA,et al.Versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo polyethyenimine.Proc Nate Acad Sci USA,1995,92:7277.
9 Tuszynski MH,Meyers,Nakahara Y,et al.Fibroblasts and schwann cells genetically modified to produce neurotrophic factors induce robust neuritic growth after transplantation to the spinal cord.Soc Neurosci Abstr,1994,20:10.
10 徐群渊，田竟生，张进禄,等.体外转基因肌细胞植入帕金森病模型大鼠的研究.中华外科杂志，1997,20:10.
, 百拇医药
11 Blesch A,Tuszynski MH,Robust growth of chronically injured spinal cord axon induced by grafts of genatically.Modifed NGF-secreting cells.Exp Neurol,1997;148.
12 陈礼刚，高立达，毛伯镛，等.pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞脊髓内移植对损伤脊髓再生的影响.中国修复重建外科杂志，1998,12(5):257.
13 陈礼刚，高立达，曾凡俊，等.移植pSVPoMcat微基因修饰SC对脊髓损伤后细胞凋亡的作用.中华创伤杂志，1998，14(3)：165.
14 陈忠平.微囊包膜神经系统细胞移植.国外医学神经病神经外科学分册，1995,22(3):143.
15 Nikknak G,Cunningham MG,Jodicke A,et al.Improved grafted survival and striated reinneration by microtransplantation of fetal nigral cell suspension in the rat parkinson model.Brain Res,1994,633:133., http://www.100md.com
基因治疗(gene therapy)是当前生物医学发展较快的领域。基因治疗在脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后轴突再生中亦可望成为有效的手段之一〔1～4〕。利用外源基因在靶细胞(包括神经元)中的表达来改变神经元某些内在特性，从而进一步探索SCI后神经元的存活能力、再生特性和功能恢复的分子机理，最终为SCI的治疗探讨新途径，是目前治疗SCI的研究方向。它有助于把SCI治疗提到一个新的水平，值得我们进一步研究。
1 SCI基因治疗的有关分子生物学基础
基因转移(gene transfer)是实现基因治疗的关键技术。因此，基因治疗的首要步骤是转导基因的分子构建。一般转导基因由目的基因cDNA、启动子/增强子和载体三部分组成。目的基因重组时除本身特有的(cDNA)序列外，通常还需进行必要的修饰，如转录起始修饰、翻译起始、内含子和聚腺苷酸化信号等的修饰。用于重组的启动子/增强子一般有三种：强组成型(strong constitative)、管家型(house keeping)及组织特异型(tissure sepeifid)，其中最常用的为第一型。理想的体内基因转移载体要求转移具有细胞靶向性，导入基因的表达可调控，而且转移的方法简便易行。用于SCI的基因转移载体主要是逆转录病毒载体(retroviral vector)，即乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒和劳斯肉瘤病毒等。构建转录病毒载体的基本原理是：病毒的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)可以对插入的外源基因进行有效转录，先在体外构建反转录病毒前病毒DNA载体，即酶切去除基因组中的反式作用区域(如含gag、pol、env基因区域)，产生缺陷型的反转录病毒，这种病毒只具有控制感染和整合的序列(即顺式作用区域)。缺陷型病毒载体必须依赖包装细胞提供的蛋白质才能完成包装，产生带有外源基因的伪病毒。它能感染受体细胞、载体DNA将依靠其LTR整合入受体细胞染色体基因组，这样外源基因被带入宿主细胞并得以表达〔1、2、5〕。逆转录病毒载体感染率高，最常用于体外间接基因治疗，其缺点是要求靶细胞必须有增殖和分裂特性〔6〕。此外，Cao等〔7〕研究用阳离子脂质体直接注入CNS作基因转移获得成功。但因阳离子脂质体对CNS有毒性，故目前致力于发展非病毒技术，一种阳离子多聚体——聚乙烯亚胺(polyethyl-enimine)已用于基因转移〔8〕。
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在SCI治疗中，由于受体细胞要植入脊髓内，因此所用受体细胞应当符合一定的标准〔3〕：①容易获取和繁殖；②移植后能长期存活且能继续分裂和具有活力；③无免疫源性及形成肿瘤的危险。目前已用于SCI试验的有雪旺氏细胞(Schwann cell,SC)和成纤维细胞〔1、2、9〕。此外，肌母细胞也是具有应用前景的较好受体细胞，研究表明肌母细胞转移至CNS至少可活6个月，且无肿瘤源性〔10〕。
基因治疗的实施有赖于将目的基因准确、高效地转入靶细胞，并使之安全、高效和可控地表达。基因治疗中基因转移的策略主要有两种，即活体外法(exvivo approach)和在体法(invivo approach)。活体外法就是在体外先对适当细胞进行遗传修饰，使其表达和分泌特定的重组蛋白，然后将修饰细胞移植入活体神经组织，通过神经递质替代或神经营养因子(neurotrophic factor,NTF)和/或其它治疗因子的引入恢复正常的神经功能。这种方法尤其适于因缺乏NTF或神经递质前体分子等可扩散物质所致的CNS疾病,如帕金森氏病(Parkinson′s disease,PD)及CNS损伤。此外，活体外法可采用自体的工程细胞移植，在体外可对高表达细胞克隆进行筛选，有效地控制移植细胞的数量和质量，应用立体定位和成像技术可以将工程细胞十分准确地移植到CNS特定的区域内，以保证在局部产生高浓度的治疗因子。由于在体法是利用适当的重组病毒或化学基因转移载体，将目的基因及有治疗作用的重组蛋白直接转移的效率较低，故较少采用。
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2 基因治疗SCI的现状和展望
基因治疗SCI尚处于实验探索阶段。目前，主要是采用NTF基因修饰SC或成纤维细胞后再将其植入鼠的脊髓损伤区，观察其轴突再生的情况〔1、2、9〕。Tuszysnki〔9〕将神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因导入培养的SC内，再将SC移植到损伤的脊髓，发现其在体内能稳定地表达NGF并促进轴突的再生。同年Tuszynski等利用来源于莫洛氏鼠白血病的逆转录病毒载体，将人的NGF基因导入鼠成纤维细胞中，再将成纤维细胞移植到半横贯损伤的鼠脊髓中(T7平面)。1年后成纤维细胞仍能表达NGF，电镜及免疫组化(CGRP)检查，发现有大量的脊髓轴突再生(感觉纤维)。1996年，Tuszynski等〔2〕采用同样方法，又将NGF基因导入成纤维细胞中，并将其移植到半横断损伤的鼠脊髓中(T7平面)，14个月后，通过RT-PCR技术鉴定成纤维细胞仍表达NGF。电镜、免疫组化(GFAP、CHAT、TH、5-HT，CGRP)检查发现有大量的(感觉和运动)轴突再生。Blesch等〔11〕又将这种方法用于慢性脊髓损伤的试验。于伤后1～3个月才植入转NGF基因的细胞，发现直到移植后3～5个月移植区都有明显的基因表达和轴索再生。笔者(1997～1998年)在国际上首次构建Po-5′-flanking介导的21.5KD髓鞘碱性蛋白微基因(暂命名为pSVPoMcat)的基础上，通过阳离子脂质体导入SC中，然后再将基因修饰的SC移植入成鼠半横断损伤脊髓，观察其对SCI的再生修复作用，现已发现pSVPoMcat微基因修饰SC对SCI后细胞凋亡有抑制作用，并促进损伤脊髓的再生〔12、13〕。
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当然利用基因转移技术治疗SCI，目前还存在一些尚待解决的问题，一是免疫排斥反应，即宿主对移植细胞的免疫排斥。因为尽管CNS的免疫应答能力微弱，但对抗原较强的或种属相关较远的受体细胞仍具有免疫排斥反应。因此，在细胞移植时应给予免疫抑制剂，最好使用自体工程细胞移植，亦可采用免疫隔离(immuno isolation)法即使用微囊包膜(mincroencapsulat)的工程细胞〔14〕。第二是移植细胞的长时程存活问题。因为在细胞移植部位，宿主内源性细胞系统对局部组织损伤的病理生理反应过程可能使部分移植细胞死亡。如果移植入外来组织细胞的体积较大，还可能对宿主组织及细胞产生机械性挤压，从而影响其结构与功能的完整性，因此，在移植方式上应该使用微移植(microtransplantation,Mit)技术。Nikknak〔15〕曾采用外径50～70μm微管的点移植，量为0.2μl，而细胞密度很大(每微升达125.0个)，达到以尽可能小的量移植尽可能多的细胞,对宿主造成的创伤亦小。第三是遗传修饰细胞移植后转移基因的表达可能会随着时间的延长而逐渐下降，以致失去治疗作用。故而利用内源性或外源性调节因子主动调节转移基因的表达极为重要〔5〕。
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综上所述，在SCI的再生修复治疗中，尽管基因转移所取得的结果均来自实验报告，但却具有十分诱人的临床应用前景。随着分子生物学的发展，我们可以把有丝分裂促进剂的基因插入成熟神经元的基因组,成熟神经元便有可能一改不能分裂的状态而变为能够自行繁殖并再生修补损伤所造成的缺损，从而使脊髓组织象外周神经那样具有生长愈合的能力。就目前情况而言，我们完全可以将对神经再生有利的基因(如NGF基因)导入自体工程细胞(如SC)以增强其功能，进一步促进脊髓的再生,进而恢复功能。如此，脊髓横贯损伤截瘫者重新站起来的愿望将有可能成为现实。
作者单位：陈礼刚 成都军区总医院神经外科 610083 四川省成都市
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参考文献
1 Tuszynski MH,Peterson DA,Jadodhara Rag,et al.Fibroblastsgenetically modified to produce nerve growth factor induce robust neuritic ingrowth after grafting to the spinal cord.Exp Neurol,1994,126:1.
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5 Karpati G,Lochmuler H,Naibantoglu J,et al.The principles of gene tharapy for hte nervous system.TINS,1996,19(2)：49.
6 Karen SC,Fred HG.Somatic gene transfer of NGF to the aged brain behavioural and mophological amelioration.J Neurosci,1995,15:2811.
7 Cao L,Zhengac,Ahao YC,et al.Gene therapy of parkinson disease mode rat by direct injection of plasmid DNA,Lipofection complex.Human Gene Therapy,1995,6:1497.
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8 Boussif O,lezoualch F,Zanta MA,et al.Versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo polyethyenimine.Proc Nate Acad Sci USA,1995,92:7277.
9 Tuszynski MH,Meyers,Nakahara Y,et al.Fibroblasts and schwann cells genetically modified to produce neurotrophic factors induce robust neuritic growth after transplantation to the spinal cord.Soc Neurosci Abstr,1994,20:10.
10 徐群渊，田竟生，张进禄,等.体外转基因肌细胞植入帕金森病模型大鼠的研究.中华外科杂志，1997,20:10.
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11 Blesch A,Tuszynski MH,Robust growth of chronically injured spinal cord axon induced by grafts of genatically.Modifed NGF-secreting cells.Exp Neurol,1997;148.
12 陈礼刚，高立达，毛伯镛，等.pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞脊髓内移植对损伤脊髓再生的影响.中国修复重建外科杂志，1998,12(5):257.
13 陈礼刚，高立达，曾凡俊，等.移植pSVPoMcat微基因修饰SC对脊髓损伤后细胞凋亡的作用.中华创伤杂志，1998，14(3)：165.
14 陈忠平.微囊包膜神经系统细胞移植.国外医学神经病神经外科学分册，1995,22(3):143.
15 Nikknak G,Cunningham MG,Jodicke A,et al.Improved grafted survival and striated reinneration by microtransplantation of fetal nigral cell suspension in the rat parkinson model.Brain Res,1994,633:133., http://www.100md.com