组织型纤溶酶原激活物在急性肺血栓栓塞肺动脉组织中的表达
张敬霞 孙根义 陈永利 王佩显 袁志明 周毓玲
【摘要】 目的 探讨组织型纤溶酶原激活物(t-PA)在急性肺血栓栓塞(PTE)肺动脉中的表达及意义。方法 30只家兔随机分组。采用血栓阻塞法制备PTE动物模型。取材栓塞3、8和24 h后动物栓塞部位的肺动脉和栓塞远端肺动脉；同时设实验对照组，取材正常肺动脉。应用免疫组化方法检测肺动脉组织内t-PA的抗原水平。结果 正常肺动脉极少见胞浆棕染的t-PA阳性细胞。栓塞3 h组的栓塞肺动脉和未栓塞肺动脉t-PA阳性细胞数与对照组比较差异没有显著性。栓塞8 h和24 h组肺动脉残存的内皮细胞和平滑肌细胞内均可见明显的胞浆棕染的阳性细胞(P均<0.01)。结论急性PTE后可见到栓塞肺动脉t-PA表达增强，表明肺具有强大的纤溶潜力，这种内源性纤溶活性的增强有利于血栓的溶解。
关键词: 肺血栓栓塞症； 组织型纤溶酶原激活物； 肺动脉； 免疫组化方法
Level of tissue plasminogen activator protein in pulmonary artery in acute pulmonary thromboembolism in rabbit
, http://www.100md.com
ZHANG Jing-xia, SUN Gen-yi, CHEN Yong-li, WANG Pei-xian, YUAN Zhi-ming, ZHOU Yu-ling.
TianJin Thoracic Hospital, TianJin 300051, China
【Abstract】 ObJective To study the changes in tissue plasminogen activator(t-PA) protein in pulmonary artery and its clinical significance after acute pulmonary thromboembolism (PTE). Methods Thirty rabbits were randomly divided into four groups after replicating a model of acute PTE in rabbit by thrombi occlusion method. Specimens were obtained from both normal and morbid pulmonary artery 3, 8 and 24 hours after APE, and protein contents of t-PA were determined using immunohistochemical method. Results A few endothelial cells and smooth muscle cells of the normal pulmonary artery were positive for t-PA. After 3 hours of PTE, there was no significant changes in t-PA positive stain among embolismic, non-embolismic and normal pulmonary artery. After 8 and 24 hours of PTE, strong positive staining was found in the residual endothelial cells and a part of smoothmuscle cells (all P<0.01). Conclusion There is significantly strong positive staining for t-PA in the pulmonary artery wall after pulmonary embolism, implying that the local fibrinolysis activity was enhanced, and it might be helpful for lysis of the embolus. Key words: pulmonary thromboembolism; tissue plasminogen activator; pulmonary artery; immunohistochemical method
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组织型纤溶酶原激活物(t-PA)是纤溶系统中的关键酶，在各种生理和病理刺激下迅速释放入血循环。目前临床应用外源性重组组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)的溶栓治疗作用已经得到了肯定，外源性t-PA强大的溶栓效果被许多研究加以证实( 1，2)。目前关于血栓栓塞与内源性t-PA的研究较少，特别是在细胞水平尚未见有关报道。本研究中拟通过建立急性肺血栓栓塞症(acute pulmonary thromboembolism,PTE)动物模型，研究PTE后局部肺动脉t-PA的表达情况，分析内源性纤溶的变化及对血栓的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物：日本大耳白纯种家兔33只，体质量2.0~2.5 kg，雌雄不限。随机分为实验对照组(9只)及肺栓塞3 h(8只)、8 h(8只)和24 h(8只)共4组。
1.2 PTE模型的建立：按参考文献(3)方法制模。实验对照组不注入血栓，其余步骤与栓塞组相同。
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1.3 肺动脉t-PA抗原测定：制模后3、8和24 h分别处死动物，取出肺组织，用生理盐水冲洗，沿肺动脉走行解剖。肉眼可见栓塞部位肺动脉血管充盈饱满，可探及血管内栓子，而栓塞远端(未栓塞)肺动脉血管塌陷，其内无栓子。实验对照组肺动脉血管通畅，无血栓。分别取材肺栓塞组的栓塞和未栓塞部位以及实验对照组的正常肺动脉，放入冻存管后迅速置于液氮冷冻，后转入-80 ℃冰箱保存。采用免疫组化方法测定，冰冻组织用优化切片温度(OCT)复合物包被、冷冻，用切片机切成4~5 μm厚的切片。室温放置30 min后，放入4 ℃丙酮中固定10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min×3。用体积分数为3%的过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗5 min×2。体积分数为10%的正常山羊血清封闭，室温孵育20 min，倾去血清，勿洗。滴加适当比例稀释的一抗工作液(鼠源性抗人t-PA抗体373号,美国ADI公司提供)，37 ℃孵育1 h，PBS洗5 min×3。滴加二抗工作液(链霉卵白素免疫组化试剂盒SP9003,北京中山公司产品)，37 ℃孵育15 min，PBS洗5 min×3。滴加辣根酶标记链霉卵白素，于37 ℃孵育15 min，PBS洗5 min×3。3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水充分冲洗，复染，封片。同时对栓塞组肺动脉作t-PA阴性对照，即将一抗工作液改用PBS孵育1 h，其余步骤均相同。采用双盲法在光镜下观察定量。1.4 统计学处理：计数资料采用秩和检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。
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2 结 果
光镜下见t-PA阳性细胞为胞浆棕染；(±)表示肺动脉内皮和平滑肌细胞未见或偶见极少量的阳性细胞；(+)表示少部分内皮和平滑肌细胞阳性；(+ +)表示大量细胞强阳性表达。结果，正常肺动脉极少见胞浆棕染的t-PA阳性细胞；栓塞3 h组栓塞肺动脉和未栓塞肺动脉与对照组比较无显著性差异；栓塞后8、24 h组栓塞肺动脉残存的内皮细胞和平滑肌细胞内均可见明显阳性细胞(表1，彩色插页图1~4)。
3 讨 论
急性PTE的发生与下肢深部静脉血栓形成密切相关，而凝血和纤溶活性的异常是该病发病的主要因素(4)。t-PA是血管内控制纤溶作用的关键酶，在各种生理或病理因素如运动、紧张、血管损伤或血栓形成等刺激下可大量释放进入血循环(5)，激活并产生纤溶酶，从而清除血管内的血凝块，保持血管通畅。内源性t-PA除有强大的溶栓效果外，在调节血栓形成和再灌注方面也起着关键作用。临床研究发现，血浆t-PA抗原水平升高和(或)t-PA活性降低是心脑血管疾病并发血栓形成的危险因素( 6，7)。Carmeliet等( 8)发现，敲除小鼠t-PA基因后血管内血栓形成的能力增加，表明内源性纤溶系统对血栓形成具有强大的抑制作用。本实验中免疫组化检测结果发现，正常的兔肺动脉内膜完整，内皮细胞和平滑肌细胞几乎看不到t-PA阳性表达。栓塞后8 h，内皮细胞部分脱落，残存的内皮细胞和中层的平滑肌细胞可看到非常显著的t-PA棕染阳性细胞，这一结果持续到栓塞后24h。表明栓塞发生后，在栓塞局部环境内t-PA表达被诱导增强，栓塞局部产生了强大的纤溶作用，这对于血栓的溶解非常有利。研究也证明，肺具有强大的纤溶潜力，因为肺动脉内皮细胞比其他部位血管内皮细胞具有更显著的纤溶活性(9)。颈动脉粥样硬化是发生缺血性脑血管病的主要原因。因斑块破裂后血栓脱落导致的脑梗死在疾病的形成过程与PTE有相似之处，它们都是因为一个外来的栓子阻塞血管后而产生了一系列生理和病理的变化。大鼠局灶性脑缺血后6 h，缺血侧中心部位的胶质细胞和梗死灶周边的缺血半影区的神经元中显示出强阳性t-PA信号，代表了局部内源性纤溶活性的增强(10)。病变组织t-PA表达水平增强，对局部溶栓和对组织修复过程都起一定作用。Clowes等(11)研究证实，在动脉损伤后第4 d观察到平滑肌细胞从中膜向内膜迁移，在迁移过程中t-PA活性明显增强；平滑肌细胞迁移需要细胞外基质成分的降解，而t-PA可以一种活性方式存在于细胞外基质中，并可能对基质降解起作用(12)。总之，急性PTE后，在栓塞局部肺动脉内可见内皮细胞和平滑肌细胞t-PA抗原水平升高，表明局部纤溶活性增强，有利于血栓的溶解，并可能在组织修复过程中起一定作用。
, 百拇医药
参考文献
1 Sze D Y,Carey M B,Razavi M K.Treatment of massive pulmonary embolus with catheter-directed tenecteplase(J).J Vasc Interv Radiol,2001,12:1456-145.
2 Katchan B M.Thrombolytic therapy for pulmonary embolism(J).Can J Surg,2000,43:411-416.
3 陈永利，张敬霞，袁志明，等.实验性急性血栓性肺栓塞动物模型的建立(J).天津医科大学学报，2003，9：4-6.
4 常家立，刘昌起.只有经肺动脉造影才能确诊肺栓塞吗--附23例急性肺栓塞临床及治疗分析(J).中国危重病急救医学，1999，11：112-114.
, 百拇医药
5 Giles A R,Nesheim M E,Herring S W,et al.The fibrinolytic potential of the normal primate following the generation of thrombin in vivo(J).Thromb Haemost,1990,63:476-481.
6 Juhan-Vague I,Pyke S D M,Alessi M C,et al.Fibrinolytic factors and the risk of myocardial infarction or sudden death in patients with angina pectoris(J). Circulation,1996,94:2057-2063.
7 Wiman B,Andersson T,Hallqvist J,et al.Plasma levels of tissue plasminogen activator/plasminogen activator inhibitor-1 complex and von Willebrand factor are significant risk markers for recurrent myocardial infarction in the Stickholm Heart Epidemiology Program(SHEEP) study(J).Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20:2019-2023.
, 百拇医药
8 Carmeliet P,SchoonJans L,Kieckens L,et al.Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice(J).Nature,1994,368:419-424.
9 Lang I M,Marsh J J,Konopka R G,et al.Factors contributing to increased vascular fibrinolytic activity in mongrel dogs(J).Circulation,1993,87:1990-2000.
10 潘涌，谢勉，郑素秋，等.大鼠脑缺血后脑组织t-PA和PAI-1蛋白的表达(J).神经解剖学杂志,2000,16：119-122.
11 Clowes A W,Clowes M M,Au Y P T,et al.Smooth muscle cells express urokinase during mitogenesis and tissue-type plasminogen activator during migration in inJured rat carotid artery(J).Circ Res,1990,67:61-67.
12 周秀霞，温进坤，韩梅.血管再狭窄发生过程中血浆组织型纤溶酶原激活物及其抑制物与胶原转换的变化(J).中国动脉硬化杂志,2000,8：96-98
作者单位：300051 天津市胸科医院(张敬霞，孙根义)；300052天津医科大学总医院(陈永利，王佩显，袁志明)；300020 天津，中国医学科学院血液学研究所(周毓玲)
作者简介： 张敬霞(1970-)，女(汉族)，天津市人，医学博士，主治医师。, http://www.100md.com
【摘要】 目的 探讨组织型纤溶酶原激活物(t-PA)在急性肺血栓栓塞(PTE)肺动脉中的表达及意义。方法 30只家兔随机分组。采用血栓阻塞法制备PTE动物模型。取材栓塞3、8和24 h后动物栓塞部位的肺动脉和栓塞远端肺动脉；同时设实验对照组，取材正常肺动脉。应用免疫组化方法检测肺动脉组织内t-PA的抗原水平。结果 正常肺动脉极少见胞浆棕染的t-PA阳性细胞。栓塞3 h组的栓塞肺动脉和未栓塞肺动脉t-PA阳性细胞数与对照组比较差异没有显著性。栓塞8 h和24 h组肺动脉残存的内皮细胞和平滑肌细胞内均可见明显的胞浆棕染的阳性细胞(P均<0.01)。结论急性PTE后可见到栓塞肺动脉t-PA表达增强，表明肺具有强大的纤溶潜力，这种内源性纤溶活性的增强有利于血栓的溶解。
关键词: 肺血栓栓塞症； 组织型纤溶酶原激活物； 肺动脉； 免疫组化方法
Level of tissue plasminogen activator protein in pulmonary artery in acute pulmonary thromboembolism in rabbit
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ZHANG Jing-xia, SUN Gen-yi, CHEN Yong-li, WANG Pei-xian, YUAN Zhi-ming, ZHOU Yu-ling.
TianJin Thoracic Hospital, TianJin 300051, China
【Abstract】 ObJective To study the changes in tissue plasminogen activator(t-PA) protein in pulmonary artery and its clinical significance after acute pulmonary thromboembolism (PTE). Methods Thirty rabbits were randomly divided into four groups after replicating a model of acute PTE in rabbit by thrombi occlusion method. Specimens were obtained from both normal and morbid pulmonary artery 3, 8 and 24 hours after APE, and protein contents of t-PA were determined using immunohistochemical method. Results A few endothelial cells and smooth muscle cells of the normal pulmonary artery were positive for t-PA. After 3 hours of PTE, there was no significant changes in t-PA positive stain among embolismic, non-embolismic and normal pulmonary artery. After 8 and 24 hours of PTE, strong positive staining was found in the residual endothelial cells and a part of smoothmuscle cells (all P<0.01). Conclusion There is significantly strong positive staining for t-PA in the pulmonary artery wall after pulmonary embolism, implying that the local fibrinolysis activity was enhanced, and it might be helpful for lysis of the embolus. Key words: pulmonary thromboembolism; tissue plasminogen activator; pulmonary artery; immunohistochemical method
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组织型纤溶酶原激活物(t-PA)是纤溶系统中的关键酶，在各种生理和病理刺激下迅速释放入血循环。目前临床应用外源性重组组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)的溶栓治疗作用已经得到了肯定，外源性t-PA强大的溶栓效果被许多研究加以证实( 1，2)。目前关于血栓栓塞与内源性t-PA的研究较少，特别是在细胞水平尚未见有关报道。本研究中拟通过建立急性肺血栓栓塞症(acute pulmonary thromboembolism,PTE)动物模型，研究PTE后局部肺动脉t-PA的表达情况，分析内源性纤溶的变化及对血栓的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物：日本大耳白纯种家兔33只，体质量2.0~2.5 kg，雌雄不限。随机分为实验对照组(9只)及肺栓塞3 h(8只)、8 h(8只)和24 h(8只)共4组。
1.2 PTE模型的建立：按参考文献(3)方法制模。实验对照组不注入血栓，其余步骤与栓塞组相同。
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1.3 肺动脉t-PA抗原测定：制模后3、8和24 h分别处死动物，取出肺组织，用生理盐水冲洗，沿肺动脉走行解剖。肉眼可见栓塞部位肺动脉血管充盈饱满，可探及血管内栓子，而栓塞远端(未栓塞)肺动脉血管塌陷，其内无栓子。实验对照组肺动脉血管通畅，无血栓。分别取材肺栓塞组的栓塞和未栓塞部位以及实验对照组的正常肺动脉，放入冻存管后迅速置于液氮冷冻，后转入-80 ℃冰箱保存。采用免疫组化方法测定，冰冻组织用优化切片温度(OCT)复合物包被、冷冻，用切片机切成4~5 μm厚的切片。室温放置30 min后，放入4 ℃丙酮中固定10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min×3。用体积分数为3%的过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗5 min×2。体积分数为10%的正常山羊血清封闭，室温孵育20 min，倾去血清，勿洗。滴加适当比例稀释的一抗工作液(鼠源性抗人t-PA抗体373号,美国ADI公司提供)，37 ℃孵育1 h，PBS洗5 min×3。滴加二抗工作液(链霉卵白素免疫组化试剂盒SP9003,北京中山公司产品)，37 ℃孵育15 min，PBS洗5 min×3。滴加辣根酶标记链霉卵白素，于37 ℃孵育15 min，PBS洗5 min×3。3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水充分冲洗，复染，封片。同时对栓塞组肺动脉作t-PA阴性对照，即将一抗工作液改用PBS孵育1 h，其余步骤均相同。采用双盲法在光镜下观察定量。1.4 统计学处理：计数资料采用秩和检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。
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2 结 果
光镜下见t-PA阳性细胞为胞浆棕染；(±)表示肺动脉内皮和平滑肌细胞未见或偶见极少量的阳性细胞；(+)表示少部分内皮和平滑肌细胞阳性；(+ +)表示大量细胞强阳性表达。结果，正常肺动脉极少见胞浆棕染的t-PA阳性细胞；栓塞3 h组栓塞肺动脉和未栓塞肺动脉与对照组比较无显著性差异；栓塞后8、24 h组栓塞肺动脉残存的内皮细胞和平滑肌细胞内均可见明显阳性细胞(表1，彩色插页图1~4)。
3 讨 论
急性PTE的发生与下肢深部静脉血栓形成密切相关，而凝血和纤溶活性的异常是该病发病的主要因素(4)。t-PA是血管内控制纤溶作用的关键酶，在各种生理或病理因素如运动、紧张、血管损伤或血栓形成等刺激下可大量释放进入血循环(5)，激活并产生纤溶酶，从而清除血管内的血凝块，保持血管通畅。内源性t-PA除有强大的溶栓效果外，在调节血栓形成和再灌注方面也起着关键作用。临床研究发现，血浆t-PA抗原水平升高和(或)t-PA活性降低是心脑血管疾病并发血栓形成的危险因素( 6，7)。Carmeliet等( 8)发现，敲除小鼠t-PA基因后血管内血栓形成的能力增加，表明内源性纤溶系统对血栓形成具有强大的抑制作用。本实验中免疫组化检测结果发现，正常的兔肺动脉内膜完整，内皮细胞和平滑肌细胞几乎看不到t-PA阳性表达。栓塞后8 h，内皮细胞部分脱落，残存的内皮细胞和中层的平滑肌细胞可看到非常显著的t-PA棕染阳性细胞，这一结果持续到栓塞后24h。表明栓塞发生后，在栓塞局部环境内t-PA表达被诱导增强，栓塞局部产生了强大的纤溶作用，这对于血栓的溶解非常有利。研究也证明，肺具有强大的纤溶潜力，因为肺动脉内皮细胞比其他部位血管内皮细胞具有更显著的纤溶活性(9)。颈动脉粥样硬化是发生缺血性脑血管病的主要原因。因斑块破裂后血栓脱落导致的脑梗死在疾病的形成过程与PTE有相似之处，它们都是因为一个外来的栓子阻塞血管后而产生了一系列生理和病理的变化。大鼠局灶性脑缺血后6 h，缺血侧中心部位的胶质细胞和梗死灶周边的缺血半影区的神经元中显示出强阳性t-PA信号，代表了局部内源性纤溶活性的增强(10)。病变组织t-PA表达水平增强，对局部溶栓和对组织修复过程都起一定作用。Clowes等(11)研究证实，在动脉损伤后第4 d观察到平滑肌细胞从中膜向内膜迁移，在迁移过程中t-PA活性明显增强；平滑肌细胞迁移需要细胞外基质成分的降解，而t-PA可以一种活性方式存在于细胞外基质中，并可能对基质降解起作用(12)。总之，急性PTE后，在栓塞局部肺动脉内可见内皮细胞和平滑肌细胞t-PA抗原水平升高，表明局部纤溶活性增强，有利于血栓的溶解，并可能在组织修复过程中起一定作用。
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参考文献
1 Sze D Y,Carey M B,Razavi M K.Treatment of massive pulmonary embolus with catheter-directed tenecteplase(J).J Vasc Interv Radiol,2001,12:1456-145.
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3 陈永利，张敬霞，袁志明，等.实验性急性血栓性肺栓塞动物模型的建立(J).天津医科大学学报，2003，9：4-6.
4 常家立，刘昌起.只有经肺动脉造影才能确诊肺栓塞吗--附23例急性肺栓塞临床及治疗分析(J).中国危重病急救医学，1999，11：112-114.
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5 Giles A R,Nesheim M E,Herring S W,et al.The fibrinolytic potential of the normal primate following the generation of thrombin in vivo(J).Thromb Haemost,1990,63:476-481.
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7 Wiman B,Andersson T,Hallqvist J,et al.Plasma levels of tissue plasminogen activator/plasminogen activator inhibitor-1 complex and von Willebrand factor are significant risk markers for recurrent myocardial infarction in the Stickholm Heart Epidemiology Program(SHEEP) study(J).Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20:2019-2023.
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8 Carmeliet P,SchoonJans L,Kieckens L,et al.Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice(J).Nature,1994,368:419-424.
9 Lang I M,Marsh J J,Konopka R G,et al.Factors contributing to increased vascular fibrinolytic activity in mongrel dogs(J).Circulation,1993,87:1990-2000.
10 潘涌，谢勉，郑素秋，等.大鼠脑缺血后脑组织t-PA和PAI-1蛋白的表达(J).神经解剖学杂志,2000,16：119-122.
11 Clowes A W,Clowes M M,Au Y P T,et al.Smooth muscle cells express urokinase during mitogenesis and tissue-type plasminogen activator during migration in inJured rat carotid artery(J).Circ Res,1990,67:61-67.
12 周秀霞，温进坤，韩梅.血管再狭窄发生过程中血浆组织型纤溶酶原激活物及其抑制物与胶原转换的变化(J).中国动脉硬化杂志,2000,8：96-98
作者单位：300051 天津市胸科医院(张敬霞，孙根义)；300052天津医科大学总医院(陈永利，王佩显，袁志明)；300020 天津，中国医学科学院血液学研究所(周毓玲)
作者简介： 张敬霞(1970-)，女(汉族)，天津市人，医学博士，主治医师。, http://www.100md.com