RNA沉默：基因组的免疫系统
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身体无忧
RNA沉默，的确是在基因组水平的免疫现象，不仅在动物体内存在，而且在植物体内也存在，是一种原始的基因组对抗来自外来基因表达的保护机制。如果我们认为它是属于免疫的范畴，那么传统免疫系统的内容是否应该改写，是否应该有一门叫《基因组免疫学》的分支学科？很值得探讨。
所有复杂生物的基因组是病毒和转座子入侵潜在的目标。人类基因组45%是由以前的转座子/病毒的遗留部分组成：21%的长散布元件(LINE)、13%的短散布元件(SINE)、8% 的逆转录病毒和3%DNA转座子，比编码蛋白(非转座子)的基因少2% 。人们期望生物体能和这些入侵者战斗，以避免基因组被分子入侵者完全占领。生物体保护基因组的完整性类似于脊椎动物的免疫系统，存在两个问题：1、如何识别"自己"和"非己"和2、怎样以特殊的方式放大起始的应答？
脊椎动物的免疫系统与入侵者战斗采用两步战略：通过基因重排，使有限的基因片段组成很多抗体编码基因 ，各种抗体编码基因分布在大量细胞之中。 感染以后，通过克隆选择和相应细胞的扩增， 产生针对免疫原的特异性免疫应答。脊椎动物的免疫系统，在早期发育阶段通过产生多少不等的任意成分，经过耐受诱导的滤过过程：针对自身抗原的细胞被从成熟的免疫系统中清除，已经解决了特异性的问题。
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基因组是如何识别入侵者及对他们产生一个具有压倒性和特异性的"免疫应答"的呢？一种策略是通过在基因组中的转座子序列甲基化来抑制转座子，虽然这种现象是次要的抑制效果，但还在被争论，这里不进一步讨论，已有很多这方面的综述。近年来，一个使RNA沉默的机制在不同的物种(真菌⒍锖椭参铮┲斜环⑾郑芸赡茏魑蜃榈?免疫系统"。在其机制被认识以前，在不同生物体中这个系统开始被独立发现和研究。在植物中转录后基因沉默(Posttranscriptional gene silencing ，PTGS) 和共同抑制、植物中RNA介导的病毒抵抗、动物中的RNA干预(第一个在新小杆线虫属线虫中被发现)、和在真菌及藻中(链孢菌属中的"镇压")的沉默，所有这些都是基于同样的核心机制。这种结论是建立在共同作用因子的发现(小干预RNA，small interfering RNAs ，siRNAs)和在植物、动物、真菌和藻中这种机制所需的基因之间的同源性。
这些现象的真正机制正在迅速被阐明，被认为是RNA沉默。我认为RNA沉默就等于脊椎动物免疫系统产生大规模免疫应答的"克隆选择"。
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RNA沉默的功能
正常情况下，线虫和果蝇都不会遇到高浓度的与内源某个基因相同的双链RNA(dsRNA)。然而，遗传分析显示通过外源dsRNA触发基因沉默所需要的基因数量大于10倍。那么这种精细途径的自然功能是什么？
在植物中，从最清晰的照片中可以看到，转录后基因沉默和病毒诱导的基因沉默是针对频繁出现的病毒感染的保护机制。这种防御系统的优势是其防御信号可以扩散，如果接种一片树叶的一个区域，能将免疫力给予周围的细胞。关于这个问题的一项研究显示，一种动物病毒同样编码一个RNA干预(RNAi)的抑制者，支持关于在动物中RNAi可能具有抗病毒功能的概念。在线虫，RNAi所需的基因功能丢失导致胚系多种转座子的激活，证明在蠕虫的后代基因组内RNAi的功能是抑制转座子的扩散。
保护性对抗病毒和转座子可能是RNAi途径的自然功能的核心，但它不能解释RNAi的所有方面的作用。在线虫中，RNAi的最明显的特征之一是它的全身效应，在动物的一个部位注射裸dsRNA可以影响其他部位基因的表达，并且dsRNA和食物一起给予通过肠腔吸收，在性腺中发现影响子代基因的表达。在植物，嫁接实验已经显示免疫力可以在干组织移动超过30厘米；这种能力可以增加保护作用以防被病毒重复感染 。这种全身效应并不是在所有系统都能看到。至于线虫，RNA沉默效应能够被食物中dsRNA触发。 线虫能从食物中摄入核酸前体。通过食物诱导的RNAi 可能利用了两个途径，一个是自然功能，摄入核酸是用于复制和转录，另一个功能是防止病毒和转座子的入侵。
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自己和非己
将dsRNA触发的RNAi作为基因组的"免疫系统"，人们可能要问：转座子和病毒是如何诱导与它们自己序列相对应的dsRNA 的？在线虫，至少可有三个可能的解释。第一，一旦一个基因单元已经将多个拷贝插入基因组的任意位置，从启动子端开始连续转录可以从两条链产生RNA，形成dsRNA。这种情况出现的机会将随着插入的数量而增加， 这将提供一个感受随机整合的拷贝数的装置，存在于基因组中的一种转座子扩散的感受器。第二， 在线虫中的知道要被RNAi调节的转座子有末端反向重复序列。一个单拷贝的连续阅读转录能够产生与这些末端对应的折回dsRNAR。我们在线虫中确实观察到与转座子末端对应的dsRNA 。 第三，可能存在其他转座子感受器 。所有"好"基因在它们的mRNA中分享结构基序，甚至可能是5' 和 3' 端之间的相互作用，及蛋白质因子与它们的结合。 缺乏这些特征的mRNAs 通过一个特殊的装置转变成dsRNA。转座子沉默有缺陷的几个线虫突变，在给予dsRNA后在RNAi中没有缺陷 ，可能存在将外源mRNAs转变成dsRNA的步骤。
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在转基因沉默中有缺陷的植物突变，在病毒诱导沉默中没有发现缺陷。它们包含一个RNA-引导的RNA聚合酶(RdRP)的突变，它的可能作用是将外源转基因的单链RNA(ssRNA)变成dsRNA。这样，对于病毒这个非己成分能简单的生成dsRNA，而对转基因这个非己成分，则需要RdRP 识别然后将单链RNA转变成dsRNA。
放大效应
在线虫中，小量的dsRNA 能够使大量的靶RNA沉默。 这种现象至少有三种机制：1、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的"初级"短RNA(siRNA)(如下图)， 因为每一个siRNA具有结合一个同源mRNA的能力，效应的放大水平取决于dsRNA的长度 ，很容易检测到放大10~20倍。2、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供进一步放大。3、 短RNAs可作为靶mRNA的引物，产生后代"次级siRNAs"(靶序列直接扩增)，并且这样启动一个RNA诱导的RNA聚合反应。
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靶依赖的放大效应
这个反应的第一步，mRNA被初级siRNA所识别。假设反应顺序如下： dsRNA被切成短的siRNAs，假定这些从dsRNA转变成ssRNA，接着会发生两个事件。这些siRNAs (可能与蛋白质结合) 它们本身不稳定，并且被降解，除非它们在细胞中识别同源靶mRNA，并且与它结合 。这在线虫中有三个证据：1、在体内RNAi对抗一个标志基因[绿荧光基因(GFP)] 不能够导致可测定的siRNA，除非GFP基因被表达在靶组织；2、在体内仅看到siRNA的反义链，没有有意义链；3、许多RNAi缺陷的突变，在体内不能测定到稳定状态的siRNA，而Dicer酶的活性在体外通过细胞粗提物很容易测定到。显然，这些突变能使siRNA在野生型水平，但不能使它们稳定，可能它们没有达到siRNA与它们的靶序列配对的阶段 。
稳定性提供一个迅速而特异的过滤器，假如无论什么原因产生了dsRNAs ，假如没有相应的能被它们作用而沉默的mRNAs存在， 反应立即消失，因为siRNA是不稳定的。另一方面，假如存在这些siRNA的靶RNA，那么反应会继续。
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然后，进入第二步，反义siRNA与靶mRNA结合后，能出现靶序列诱导的扩增。在蠕虫和植物中， 在一个基因中间的一个区域相应的dsRNA诱导的RNA干预(RNAi )，导致靶位点侧siRNA的合成。在蠕虫(而不是植物和果蝇提取物)这个影响显示多极性(仅看到5' 端次级siRNA)， 并且这是一个很清楚的距离的影响，被称之为"过度效应"不能进一步延伸到几百个碱基对。可能许多来自起始dsRNA覆盖的区域(称为"初级"siRNA)的siRNA可能同样是次级的和是由于在这个区域内的短的延长反应的产物。过度性RNAi的第二项指标是RNAi直接对抗(转基因)基因融合的表现 ，这个效应可以从一个3'端到一个5'端的区域，并且因此影响到一个5'端区域的没有关系的未融合的基因 。最后，可以通过注射短的反义RNAs来触发有效的RNAi。
扩增需要的聚合酶在不同的组织可能不同。在线虫的胚系，ego-1 基因已被RNAi涉及；它与以前从西红柿中分离的一个RdRP 有同源序列。在线虫的躯体细胞，发现另一个RdRP 类似物：rrf-1。rrf-1 基因的突变导致RNAi的丢失和siRNA显著减少。另一个RdRP同源物的失活有着相反的效应，增强RNAi作用(rrf-3)。rrf-3 基因产物可能有很低的活性，并且可能与rrf-1在相关复合物中竞争。在网柄菌属(Dictyostelium)中，已发现三个RdRP 类似物。它们中一个(rrpA)丢失，导致RNAi消失和测定不到siRNA。
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拟南芥的RdRP类似物SDE1/SGS2同样被过度的RNAi所需要。在线虫和植物中过度RNAi显著不同，在植物中，过度效应可出现在3' 端和5'端方向，结果可在3' 端和5'端靶区域发现次级siRNA。 在植物，siRNAs可以针对一个mRNA诱导一个RdRP，触发合成RNA分子的RdRP 活性。
SiRNA的稳定性和过度RNAi的结合导致一个"连锁反应"，多个复制周期可以出现。
结束语
我们正在解剖一个保护物种最敏感部分-遗传密码的古老机制。象脊椎动物的免疫系统，这个装置识别分子寄生者，发动起始应答，并且稳定和放大这种应答。尽管细节可能不同，但只要给予RNAi -沉默机器的部分，基因组防御机制将被扩散。就象免疫学知识奠定了免疫治疗的基础，彻底了解基因组免疫系统具有很大可能在直接基因沉默中应用，在实验生物学，甚至在疾病的治疗。
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RNA干预——免疫学研究的新领域？(37C医学网)
年度SCIENCE选出10大科技,RNA干预列为第一.是热点中的热点.植物与某些低等动物可以用RNA,这个以前认为是没用的,只是起转录,翻译用途的物质,来控制基因,象开关控制电灯亮暗一样,让某些基因失效或有效.但在哺乳动物中,还比较困难,正在研究.这里向大家介绍一下.
我们知道，人和脊椎动物体内都存在着一种对抗外来病原微生物的系统，称之为免疫系统。人们在很早的时候就对机体的免疫功能有所认识。十八世纪末，英国乡村医生Edward Jenner 从挤奶女工那里获知，感染过毒性低的牛痘病毒就不会被天花病毒感染，于是他发明了牛痘疫苗，人类经过200年的努力，终于在1980年世界卫生组织宣布：天花从地球消失，这是人类用人工免疫的方法，彻底战胜的第一种疾病，也为我们利用免疫学的手段征服其它疾病树立了信心。谈到免疫，只是指动物体内存在的一个防御系统，那么植物是否具有对抗病原微生物的能力？人们一直对此并不太清楚，直到最近几年人们才发现，植物细胞可以通过降解病毒RNA 的方式来对抗病毒的入侵，称为RNA干预(RNAi)，并且发现在真菌和动物体内都存在这种机制。既然这种RNA干预与机体对抗病原微生物有关，它与我们已知的免疫系统有什么关系？它的应用前景如何？
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RNA干预的发现.
十多年前，Jorgensen和他的同事们试图加深矮牵牛花的紫色，就将一个强启动子控制下的色素基因转入，但结果非常惊奇，许多花并不是紫色而是杂色，甚至是白色。Jorgensen称这种现象为共抑制(cosuppression)，即转入的外源基因和其本身的同源基因都被抑制-出现基因沉默(silencing) ，后来发现许多植物都有这种现象。尽管在一些植物中转基因诱导的沉默是由于基因特异性的甲基化的结果，但另一些是在转录后水平出现的，即转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)[1]。除转基因能诱导PTGS外，转入某些病毒同样能够诱导，提示外源基因诱导的RNA沉默是植物对抗病毒和转座子的一个防御系统。1995年，Guo等想利用反义RNA技术阻断线虫(C. elegans)中的par-1基因，但却得到了一个意想不到的结果。在对照实验中给线虫注射正义RNA(sense RNA)以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。直到1998年Fire等首次揭开这个悬疑之谜。他们证实，Guo等遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，他们将这一现象称为RNA干预(RNA interference ,简称RNAi)。
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RNA干预的原理
体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23个核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶-Dicer，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶Dicer识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA；识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象，其基本过程如图1所示。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2，RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。
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在线虫中，小量的dsRNA 能够使大量的靶RNA沉默。 这种现象至少有三种机制[2]：1、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的"初级"短RNA(siRNA)。2、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供进一步放大。3、 短RNAs可作为靶mRNA的引物，产生后代"次级siRNAs"(靶序列直接扩增)，并且这样启动一个RNA诱导的RNA聚合反应。
RNAi与免疫作用的比较
脊椎动物的免疫系统对于病毒等病原微生物的入侵采用两步战略：通过基因重排，使有限的基因片段组成很多抗体编码基因 ，各种抗体编码基因分布在大量细胞之中。 感染以后，通过克隆选择和相应细胞的扩增， 产生针对免疫原的特异性免疫应答。脊椎动物的免疫细胞-T、B淋巴细胞，在早期发育阶段通过阳性和阴性选择，将能识别自身抗原的克隆排除，从而解决了特异性的问题。RNAi系统的作用也具有同样的特异性，当病毒进入，只出现病毒基因的沉默现象，而机体的其它基因表达正常。
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脊椎动物的免疫系统，能将局部接触的抗原的信息传播到全身。RNAi系统是否具有这种功能？在植物中，可以观察到，转录后基因沉默和病毒诱导的基因沉默是针对频繁出现的病毒感染的保护机制。这种防御系统的优势是其防御信号可以扩散，如果接种到一片树叶的一个区域，能将免疫力给予周围的细胞。在线虫中，RNAi的最明显的特征之一是它的全身效应，在动物的一个部位注射裸dsRNA可以影响其他部位基因的表达，并且dsRNA和食物一起给予通过肠腔吸收，在性腺中发现影响子代基因的表达。这种能力可以增加保护作用以防被病毒重复感染 。
当病原微生物进入机体后，通过抗原处理和递呈，使相应淋巴细胞克隆活化，并发生克隆扩增，从而形成很多针对该抗原的淋巴细胞，从而有效地对抗病原微生物。在线虫中，小量的dsRNA 能够使大量的靶RNA沉默[3]。 这种现象主要是因为Dicer酶将长dsRNA分子切成短RNA(siRNA)， 因为每一个siRNA具有结合一个同源mRNA的能力，效应的放大水平取决于dsRNA的长度 ，很容易检测到放大10~20倍。
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免疫系统的一个重要生理功能是清除体内衰老的或异常的细胞，从而保持机体的生理平衡和稳定。RNAi同样具有降解体内异常基因的RNA的功能，从而使异常基因不能表达。
从上面几方面的比较可以看出，RNAi系统确实具有免疫系统的一些特点。
RNAi系统应该归为免疫系统
当然，RNAi的研究才刚刚开始4年左右，对哺乳动物细胞中RNAi的研究仅1年，还有许多问题不清楚，例如它是如何识别外来基因的？这个系统中还有哪些成员？尽管如此，从已经获得的研究成果来看，RNAi应该是机体基因组水平的免疫。如果将RNAi归为免疫系统，那么我们教科书上的很多概念可能就要更改，绱车拿庖哐В庖呦低车淖槌芍饕噶馨拖低臣洳铮庖哂Υ鹨仓饕芓、B淋巴细胞介导的细胞和体液免疫。既然RNAi也是机体免疫系统的一部分，也许应该从体液、细胞和基因三个水平来阐明机体对抗病毒的入侵，也许体液、细胞免疫和RNAi之间还有某种联系，例如当病毒进入机体，当病毒的抗原刺激机体免疫系统产生抗体和致敏淋巴细胞时，是否其传入的信号也启动了RNAi系统？
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RNAi的在医学上的应用前景
目前，人类在对待细菌感染性疾病要比病毒感染的疾病有更多的对策，其根本原因是病毒的简单性，没有很多的靶目标和有些病毒的易变性，象流感病毒和艾滋病病毒，它们的抗原经常发生改变，使我们很难对其通过疫苗进行预防。艾滋病病毒发现将近20年，到目前为止，还没有有效的疫苗进行预防。2002年6月份《自然医学》杂志，刊登了美国的科学家用短干预RNA(siRNA)的方法，使细胞表面HIV病毒结合受体-CD4的基因沉默，结果降低了细胞内病毒的拷贝数，这的确给我们最后征服艾滋病带来希望。除此之外，也许我们根据HIV的mRNA的序列，制备出双链RNA(dsRNA)作为HIV的疫苗，当它们进入细胞后可以降解HIV的mRNA，从而阻止HIV在细胞内的复制。另外，癌症的治疗同样可以用RNAi的方法，我们知道，癌症细胞之所以能无限增殖，主要与细胞内某些基因的异常表达有关，如果我们通过RNAi的手段使这些基因沉默，也许会取得很好的效果。
总之，RNAi的发现，为我们了解生命和征服疾病提供了新的手段，同时也使我们对机体的免疫系统有一个更加完整的认识。
参考文献：
1. Jorgensen RA，Cluster PD，English J et al . Plant Mol Biol. 1996；31：957-973。
2. Plasterk, RA. Science. 2002; 296:1263-1265.
3. Hannon. Nature. 2002; 418:244-251, http://www.100md.com
所有复杂生物的基因组是病毒和转座子入侵潜在的目标。人类基因组45%是由以前的转座子/病毒的遗留部分组成：21%的长散布元件(LINE)、13%的短散布元件(SINE)、8% 的逆转录病毒和3%DNA转座子，比编码蛋白(非转座子)的基因少2% 。人们期望生物体能和这些入侵者战斗，以避免基因组被分子入侵者完全占领。生物体保护基因组的完整性类似于脊椎动物的免疫系统，存在两个问题：1、如何识别"自己"和"非己"和2、怎样以特殊的方式放大起始的应答？
脊椎动物的免疫系统与入侵者战斗采用两步战略：通过基因重排，使有限的基因片段组成很多抗体编码基因 ，各种抗体编码基因分布在大量细胞之中。 感染以后，通过克隆选择和相应细胞的扩增， 产生针对免疫原的特异性免疫应答。脊椎动物的免疫系统，在早期发育阶段通过产生多少不等的任意成分，经过耐受诱导的滤过过程：针对自身抗原的细胞被从成熟的免疫系统中清除，已经解决了特异性的问题。
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基因组是如何识别入侵者及对他们产生一个具有压倒性和特异性的"免疫应答"的呢？一种策略是通过在基因组中的转座子序列甲基化来抑制转座子，虽然这种现象是次要的抑制效果，但还在被争论，这里不进一步讨论，已有很多这方面的综述。近年来，一个使RNA沉默的机制在不同的物种(真菌⒍锖椭参铮┲斜环⑾郑芸赡茏魑蜃榈?免疫系统"。在其机制被认识以前，在不同生物体中这个系统开始被独立发现和研究。在植物中转录后基因沉默(Posttranscriptional gene silencing ，PTGS) 和共同抑制、植物中RNA介导的病毒抵抗、动物中的RNA干预(第一个在新小杆线虫属线虫中被发现)、和在真菌及藻中(链孢菌属中的"镇压")的沉默，所有这些都是基于同样的核心机制。这种结论是建立在共同作用因子的发现(小干预RNA，small interfering RNAs ，siRNAs)和在植物、动物、真菌和藻中这种机制所需的基因之间的同源性。
这些现象的真正机制正在迅速被阐明，被认为是RNA沉默。我认为RNA沉默就等于脊椎动物免疫系统产生大规模免疫应答的"克隆选择"。
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RNA沉默的功能
正常情况下，线虫和果蝇都不会遇到高浓度的与内源某个基因相同的双链RNA(dsRNA)。然而，遗传分析显示通过外源dsRNA触发基因沉默所需要的基因数量大于10倍。那么这种精细途径的自然功能是什么？
在植物中，从最清晰的照片中可以看到，转录后基因沉默和病毒诱导的基因沉默是针对频繁出现的病毒感染的保护机制。这种防御系统的优势是其防御信号可以扩散，如果接种一片树叶的一个区域，能将免疫力给予周围的细胞。关于这个问题的一项研究显示，一种动物病毒同样编码一个RNA干预(RNAi)的抑制者，支持关于在动物中RNAi可能具有抗病毒功能的概念。在线虫，RNAi所需的基因功能丢失导致胚系多种转座子的激活，证明在蠕虫的后代基因组内RNAi的功能是抑制转座子的扩散。
保护性对抗病毒和转座子可能是RNAi途径的自然功能的核心，但它不能解释RNAi的所有方面的作用。在线虫中，RNAi的最明显的特征之一是它的全身效应，在动物的一个部位注射裸dsRNA可以影响其他部位基因的表达，并且dsRNA和食物一起给予通过肠腔吸收，在性腺中发现影响子代基因的表达。在植物，嫁接实验已经显示免疫力可以在干组织移动超过30厘米；这种能力可以增加保护作用以防被病毒重复感染 。这种全身效应并不是在所有系统都能看到。至于线虫，RNA沉默效应能够被食物中dsRNA触发。 线虫能从食物中摄入核酸前体。通过食物诱导的RNAi 可能利用了两个途径，一个是自然功能，摄入核酸是用于复制和转录，另一个功能是防止病毒和转座子的入侵。
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自己和非己
将dsRNA触发的RNAi作为基因组的"免疫系统"，人们可能要问：转座子和病毒是如何诱导与它们自己序列相对应的dsRNA 的？在线虫，至少可有三个可能的解释。第一，一旦一个基因单元已经将多个拷贝插入基因组的任意位置，从启动子端开始连续转录可以从两条链产生RNA，形成dsRNA。这种情况出现的机会将随着插入的数量而增加， 这将提供一个感受随机整合的拷贝数的装置，存在于基因组中的一种转座子扩散的感受器。第二， 在线虫中的知道要被RNAi调节的转座子有末端反向重复序列。一个单拷贝的连续阅读转录能够产生与这些末端对应的折回dsRNAR。我们在线虫中确实观察到与转座子末端对应的dsRNA 。 第三，可能存在其他转座子感受器 。所有"好"基因在它们的mRNA中分享结构基序，甚至可能是5' 和 3' 端之间的相互作用，及蛋白质因子与它们的结合。 缺乏这些特征的mRNAs 通过一个特殊的装置转变成dsRNA。转座子沉默有缺陷的几个线虫突变，在给予dsRNA后在RNAi中没有缺陷 ，可能存在将外源mRNAs转变成dsRNA的步骤。
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在转基因沉默中有缺陷的植物突变，在病毒诱导沉默中没有发现缺陷。它们包含一个RNA-引导的RNA聚合酶(RdRP)的突变，它的可能作用是将外源转基因的单链RNA(ssRNA)变成dsRNA。这样，对于病毒这个非己成分能简单的生成dsRNA，而对转基因这个非己成分，则需要RdRP 识别然后将单链RNA转变成dsRNA。
放大效应
在线虫中，小量的dsRNA 能够使大量的靶RNA沉默。 这种现象至少有三种机制：1、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的"初级"短RNA(siRNA)(如下图)， 因为每一个siRNA具有结合一个同源mRNA的能力，效应的放大水平取决于dsRNA的长度 ，很容易检测到放大10~20倍。2、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供进一步放大。3、 短RNAs可作为靶mRNA的引物，产生后代"次级siRNAs"(靶序列直接扩增)，并且这样启动一个RNA诱导的RNA聚合反应。
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靶依赖的放大效应
这个反应的第一步，mRNA被初级siRNA所识别。假设反应顺序如下： dsRNA被切成短的siRNAs，假定这些从dsRNA转变成ssRNA，接着会发生两个事件。这些siRNAs (可能与蛋白质结合) 它们本身不稳定，并且被降解，除非它们在细胞中识别同源靶mRNA，并且与它结合 。这在线虫中有三个证据：1、在体内RNAi对抗一个标志基因[绿荧光基因(GFP)] 不能够导致可测定的siRNA，除非GFP基因被表达在靶组织；2、在体内仅看到siRNA的反义链，没有有意义链；3、许多RNAi缺陷的突变，在体内不能测定到稳定状态的siRNA，而Dicer酶的活性在体外通过细胞粗提物很容易测定到。显然，这些突变能使siRNA在野生型水平，但不能使它们稳定，可能它们没有达到siRNA与它们的靶序列配对的阶段 。
稳定性提供一个迅速而特异的过滤器，假如无论什么原因产生了dsRNAs ，假如没有相应的能被它们作用而沉默的mRNAs存在， 反应立即消失，因为siRNA是不稳定的。另一方面，假如存在这些siRNA的靶RNA，那么反应会继续。
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然后，进入第二步，反义siRNA与靶mRNA结合后，能出现靶序列诱导的扩增。在蠕虫和植物中， 在一个基因中间的一个区域相应的dsRNA诱导的RNA干预(RNAi )，导致靶位点侧siRNA的合成。在蠕虫(而不是植物和果蝇提取物)这个影响显示多极性(仅看到5' 端次级siRNA)， 并且这是一个很清楚的距离的影响，被称之为"过度效应"不能进一步延伸到几百个碱基对。可能许多来自起始dsRNA覆盖的区域(称为"初级"siRNA)的siRNA可能同样是次级的和是由于在这个区域内的短的延长反应的产物。过度性RNAi的第二项指标是RNAi直接对抗(转基因)基因融合的表现 ，这个效应可以从一个3'端到一个5'端的区域，并且因此影响到一个5'端区域的没有关系的未融合的基因 。最后，可以通过注射短的反义RNAs来触发有效的RNAi。
扩增需要的聚合酶在不同的组织可能不同。在线虫的胚系，ego-1 基因已被RNAi涉及；它与以前从西红柿中分离的一个RdRP 有同源序列。在线虫的躯体细胞，发现另一个RdRP 类似物：rrf-1。rrf-1 基因的突变导致RNAi的丢失和siRNA显著减少。另一个RdRP同源物的失活有着相反的效应，增强RNAi作用(rrf-3)。rrf-3 基因产物可能有很低的活性，并且可能与rrf-1在相关复合物中竞争。在网柄菌属(Dictyostelium)中，已发现三个RdRP 类似物。它们中一个(rrpA)丢失，导致RNAi消失和测定不到siRNA。
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拟南芥的RdRP类似物SDE1/SGS2同样被过度的RNAi所需要。在线虫和植物中过度RNAi显著不同，在植物中，过度效应可出现在3' 端和5'端方向，结果可在3' 端和5'端靶区域发现次级siRNA。 在植物，siRNAs可以针对一个mRNA诱导一个RdRP，触发合成RNA分子的RdRP 活性。
SiRNA的稳定性和过度RNAi的结合导致一个"连锁反应"，多个复制周期可以出现。
结束语
我们正在解剖一个保护物种最敏感部分-遗传密码的古老机制。象脊椎动物的免疫系统，这个装置识别分子寄生者，发动起始应答，并且稳定和放大这种应答。尽管细节可能不同，但只要给予RNAi -沉默机器的部分，基因组防御机制将被扩散。就象免疫学知识奠定了免疫治疗的基础，彻底了解基因组免疫系统具有很大可能在直接基因沉默中应用，在实验生物学，甚至在疾病的治疗。
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RNA干预——免疫学研究的新领域？(37C医学网)
年度SCIENCE选出10大科技,RNA干预列为第一.是热点中的热点.植物与某些低等动物可以用RNA,这个以前认为是没用的,只是起转录,翻译用途的物质,来控制基因,象开关控制电灯亮暗一样,让某些基因失效或有效.但在哺乳动物中,还比较困难,正在研究.这里向大家介绍一下.
我们知道，人和脊椎动物体内都存在着一种对抗外来病原微生物的系统，称之为免疫系统。人们在很早的时候就对机体的免疫功能有所认识。十八世纪末，英国乡村医生Edward Jenner 从挤奶女工那里获知，感染过毒性低的牛痘病毒就不会被天花病毒感染，于是他发明了牛痘疫苗，人类经过200年的努力，终于在1980年世界卫生组织宣布：天花从地球消失，这是人类用人工免疫的方法，彻底战胜的第一种疾病，也为我们利用免疫学的手段征服其它疾病树立了信心。谈到免疫，只是指动物体内存在的一个防御系统，那么植物是否具有对抗病原微生物的能力？人们一直对此并不太清楚，直到最近几年人们才发现，植物细胞可以通过降解病毒RNA 的方式来对抗病毒的入侵，称为RNA干预(RNAi)，并且发现在真菌和动物体内都存在这种机制。既然这种RNA干预与机体对抗病原微生物有关，它与我们已知的免疫系统有什么关系？它的应用前景如何？
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RNA干预的发现.
十多年前，Jorgensen和他的同事们试图加深矮牵牛花的紫色，就将一个强启动子控制下的色素基因转入，但结果非常惊奇，许多花并不是紫色而是杂色，甚至是白色。Jorgensen称这种现象为共抑制(cosuppression)，即转入的外源基因和其本身的同源基因都被抑制-出现基因沉默(silencing) ，后来发现许多植物都有这种现象。尽管在一些植物中转基因诱导的沉默是由于基因特异性的甲基化的结果，但另一些是在转录后水平出现的，即转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)[1]。除转基因能诱导PTGS外，转入某些病毒同样能够诱导，提示外源基因诱导的RNA沉默是植物对抗病毒和转座子的一个防御系统。1995年，Guo等想利用反义RNA技术阻断线虫(C. elegans)中的par-1基因，但却得到了一个意想不到的结果。在对照实验中给线虫注射正义RNA(sense RNA)以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。直到1998年Fire等首次揭开这个悬疑之谜。他们证实，Guo等遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，他们将这一现象称为RNA干预(RNA interference ,简称RNAi)。
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RNA干预的原理
体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23个核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶-Dicer，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶Dicer识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA；识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象，其基本过程如图1所示。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2，RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。
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在线虫中，小量的dsRNA 能够使大量的靶RNA沉默。 这种现象至少有三种机制[2]：1、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的"初级"短RNA(siRNA)。2、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供进一步放大。3、 短RNAs可作为靶mRNA的引物，产生后代"次级siRNAs"(靶序列直接扩增)，并且这样启动一个RNA诱导的RNA聚合反应。
RNAi与免疫作用的比较
脊椎动物的免疫系统对于病毒等病原微生物的入侵采用两步战略：通过基因重排，使有限的基因片段组成很多抗体编码基因 ，各种抗体编码基因分布在大量细胞之中。 感染以后，通过克隆选择和相应细胞的扩增， 产生针对免疫原的特异性免疫应答。脊椎动物的免疫细胞-T、B淋巴细胞，在早期发育阶段通过阳性和阴性选择，将能识别自身抗原的克隆排除，从而解决了特异性的问题。RNAi系统的作用也具有同样的特异性，当病毒进入，只出现病毒基因的沉默现象，而机体的其它基因表达正常。
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脊椎动物的免疫系统，能将局部接触的抗原的信息传播到全身。RNAi系统是否具有这种功能？在植物中，可以观察到，转录后基因沉默和病毒诱导的基因沉默是针对频繁出现的病毒感染的保护机制。这种防御系统的优势是其防御信号可以扩散，如果接种到一片树叶的一个区域，能将免疫力给予周围的细胞。在线虫中，RNAi的最明显的特征之一是它的全身效应，在动物的一个部位注射裸dsRNA可以影响其他部位基因的表达，并且dsRNA和食物一起给予通过肠腔吸收，在性腺中发现影响子代基因的表达。这种能力可以增加保护作用以防被病毒重复感染 。
当病原微生物进入机体后，通过抗原处理和递呈，使相应淋巴细胞克隆活化，并发生克隆扩增，从而形成很多针对该抗原的淋巴细胞，从而有效地对抗病原微生物。在线虫中，小量的dsRNA 能够使大量的靶RNA沉默[3]。 这种现象主要是因为Dicer酶将长dsRNA分子切成短RNA(siRNA)， 因为每一个siRNA具有结合一个同源mRNA的能力，效应的放大水平取决于dsRNA的长度 ，很容易检测到放大10~20倍。
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免疫系统的一个重要生理功能是清除体内衰老的或异常的细胞，从而保持机体的生理平衡和稳定。RNAi同样具有降解体内异常基因的RNA的功能，从而使异常基因不能表达。
从上面几方面的比较可以看出，RNAi系统确实具有免疫系统的一些特点。
RNAi系统应该归为免疫系统
当然，RNAi的研究才刚刚开始4年左右，对哺乳动物细胞中RNAi的研究仅1年，还有许多问题不清楚，例如它是如何识别外来基因的？这个系统中还有哪些成员？尽管如此，从已经获得的研究成果来看，RNAi应该是机体基因组水平的免疫。如果将RNAi归为免疫系统，那么我们教科书上的很多概念可能就要更改，绱车拿庖哐В庖呦低车淖槌芍饕噶馨拖低臣洳铮庖哂Υ鹨仓饕芓、B淋巴细胞介导的细胞和体液免疫。既然RNAi也是机体免疫系统的一部分，也许应该从体液、细胞和基因三个水平来阐明机体对抗病毒的入侵，也许体液、细胞免疫和RNAi之间还有某种联系，例如当病毒进入机体，当病毒的抗原刺激机体免疫系统产生抗体和致敏淋巴细胞时，是否其传入的信号也启动了RNAi系统？
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RNAi的在医学上的应用前景
目前，人类在对待细菌感染性疾病要比病毒感染的疾病有更多的对策，其根本原因是病毒的简单性，没有很多的靶目标和有些病毒的易变性，象流感病毒和艾滋病病毒，它们的抗原经常发生改变，使我们很难对其通过疫苗进行预防。艾滋病病毒发现将近20年，到目前为止，还没有有效的疫苗进行预防。2002年6月份《自然医学》杂志，刊登了美国的科学家用短干预RNA(siRNA)的方法，使细胞表面HIV病毒结合受体-CD4的基因沉默，结果降低了细胞内病毒的拷贝数，这的确给我们最后征服艾滋病带来希望。除此之外，也许我们根据HIV的mRNA的序列，制备出双链RNA(dsRNA)作为HIV的疫苗，当它们进入细胞后可以降解HIV的mRNA，从而阻止HIV在细胞内的复制。另外，癌症的治疗同样可以用RNAi的方法，我们知道，癌症细胞之所以能无限增殖，主要与细胞内某些基因的异常表达有关，如果我们通过RNAi的手段使这些基因沉默，也许会取得很好的效果。
总之，RNAi的发现，为我们了解生命和征服疾病提供了新的手段，同时也使我们对机体的免疫系统有一个更加完整的认识。
参考文献：
1. Jorgensen RA，Cluster PD，English J et al . Plant Mol Biol. 1996；31：957-973。
2. Plasterk, RA. Science. 2002; 296:1263-1265.
3. Hannon. Nature. 2002; 418:244-251, http://www.100md.com