腺病毒载体转染p53基因提高肿瘤放射敏感性的实验研究进展
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2004年9月29日
朱广迎 蔡伟明 徐国镇 中华放射肿瘤学杂志1999年6月第8卷第2期
几十年来，许多放射生物学和放射肿瘤学专家致力于寻找提高肿瘤放射敏感性的理想药物，试用了生物还原剂、亲电子化合物、修复抑制剂等诸多药物，均因效果欠佳或毒性大而未能广泛应用于临床[1]。近年来分子生物学迅猛发展，为肿瘤学和放射肿瘤学研究提供了新的线索。癌基因、抗癌基因及细胞内信号传导的研究进一步丰富了放射线治疗肿瘤的理论[2-4]。因此作者综述 p53基因转染提高肿瘤放射敏感性的实验研究进展。
1 p53基因与肿瘤放射敏感性
近年来的研究证明，细胞受到射线照射之后所发生的一系列变化都与基因有关[5-7]。射线引起细胞内双链断裂之后， dNA依赖的蛋白激酶( dNA dependentprotein kinase， dNA-PK)或共济失调性毛细管扩张症突变基因( mutated in ataxia telangiectasia， aTM)把信号传递给 p53基因，其表达产物为 p53蛋白。 p53蛋白利用其羧基域直接识别 dNA损伤，同时通过反式激活上调另一种抑癌基因 wAF1/ cIP1( wild-typep53-activated frag-ment1/ cDK interacting protein1)，表达产生一种相对分子质量为21×103的蛋白质 p21，后者抑制增殖细胞核抗原和多种细胞周期素，如细胞由 g1期进入 s期所必需的细胞周期素 d( cyclinD)、细胞周期素依赖的激酶4( cyclin dependent ki-nase4， cDK4)及 cyclinE和 cDK2，使分裂细胞阻滞于 g1期，保证细胞在复制 dNA之前有足够的时间修复损伤的 dNA。如果细胞 dNA损伤未能得到及时修复，则可能 p53蛋白会进而下调 bcl-2基因和(或)上调 bax基因，引起细胞凋亡。野生型 p53( wild-typep53， wtp53)基因突变成为突变型 p53( mutant-typep53， mtp53)基因之后，则不但诱导凋亡的作用消失，反而抑制凋亡[8]。参与诱导凋亡的还有 apo-1， fas基因及肿瘤坏死因子α( tumor necrosis factorα， tNF-α)等，参与抑制凋亡的基因还有 h-ras， e1b等[9]。
, 百拇医药
多数临床研究证明 p53基因与肿瘤放射敏感性有关，如：放射治疗疗效较好的肿瘤(髓母细胞瘤、头颈肿瘤、宫颈癌) p53基因突变提示预后不良[10]；放射敏感的肿瘤(精原细胞瘤，神经母细胞瘤) p53突变率低；神经系统中放射抗拒的星形细胞瘤 p53突变率高，而其他肿瘤 p53突变率低。但也有相反的报告，放射敏感的淋巴瘤和小细胞肺癌 p53基因突变相当常见，而放射抗拒的恶性黑色素瘤又缺乏 p53突变[11，12]。
大多数实验室研究也证明 p53与细胞放射敏感性有关，如表达内源性突变型 p53的细胞和野生型 p53敲除( knock out)的细胞的放射敏感性下降[10]；转染外源 mtp53基因细胞和转染无效 p53基因( null p53 transgenic)细胞放射敏感性下降，而外源 wtp53基因转染能抑制无 wtp53蛋白细胞的生长； p53蛋白被猿猴病毒( simian virus 40， sV40)大 t抗原和 hPV-E6基因失活的细胞放射敏感性下降。但也有人报告表达 mtp53的细胞放射敏感性增高，转染 mtp53的纤维母细胞放射敏感性增高[10，13，14]。
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上述研究结果有分歧的原因：(1)判断 p53对放射敏感性影响的标准不一致。(2)各实验采用的细胞来源不统一。(3)免疫组化法难以完全准确地反映 p53蛋白的功能[10]。一般认为 wtp53蛋白半衰期仅6～20分钟， mtp53蛋白半衰期长达数小时。免疫组化阴性提示细胞内 p53基因突变，但一些情况下组化阴性时 p53蛋白已失去功能，如： p53基因无义或移码突变、转录错误、结构重排以及 p53构型改变、不能进入细胞核、降解加快等，而另一些情况下免疫组化阳性时 p53蛋白又可能具有一定的功能，如 wtp53蛋白积聚或 mtp53蛋白保留部分功能[15，16]。
2 p53基因转移的载体
目的基因确定之后，基因转染的另一个重要问题就是选择基因转染的方法。裸鼠 dNA直接注射方法简便，缺点是转染范围限于注射部位附近的细胞、缺乏组织靶向性。近来有学者采用金粒携带 dNA高速轰击组织，在肝脏和肿瘤组织中表达目的基因，同样也存在类似的缺点[3]。利用载体转染基因是目前基因治疗实验研究中常用的方法，理想的载体应具有：(1)准确的靶向性，即特异地定位于某种细胞以减少副作用。(2)较高的转染效率。(3)外源基因表达强度和时限的可控性。(4)高容量，即可携带大片断的目的基因。(5)无副作用，即无致突变性，无免疫原性，无致病性。目前研究和使用较多的载体是重组腺病毒。它是线状双链 dNA病毒，常用的5型腺病毒早期转录区有6个独立区域： e1A， e1B， e2A， e2B， e3， e4。 e1A和 e1B分别位于基因组5’侧1.3～4.5基因图单位和4.6～11.1基因图单位处，其完整性是复制的必需条件，重组腺病毒可缺失 e1， e3或 e4区。最近，有人构建了缺失除内末端重复和包装序列以外全部其他序列的腺病毒载体，大大提高了外源基因容量[17]。腺病毒载体的优点是：(1)基因组为36kb，可插入较大的外源基因。(2)滴度高，大于1×1011cfu/ mL( colony-forming unit， cfu)。(3)转染效率高。(4)宿主范围广，除造血干细胞外，少量腺病毒载体转染其他组织均可得到有效表达。缺点是：(1)缺乏靶向性。(2)不能整合入宿主 dNA，外源基因表达期限短。(3)存在免疫反应和细胞毒作用。这主要是由于重组腺病毒中存在少量完整病毒基因，其低水平表达产生的病毒蛋白可引起免疫反应和淋巴细胞介导的细胞毒作用，损害宿主细胞。首次使用腺病毒载体后机体会产生免疫力，再次使用时机体会利用免疫反应较快清除腺病毒载体，难以达到转染外源基因的目的。利用放射线局部照射有可能减轻局部免疫反应，延长外源基因表达期限。
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3 p53基因转染提高肿瘤放射敏感性实验研究
pirollo等[18]采用腺病毒载体( aden-oviral vector， avl)携带 p53基因( avlp53)，并用 avl携带β-半乳糖苷酶( avllacZ)作对照，研究 p53基因对细胞放射敏感性的影响，结果表明： p53基因可抑制多种肿瘤的体外生长，如头颈鳞癌细胞系 jSQ-3， sQ20B， sCC61以及乳腺癌细胞系 sK-BR-3，其中对乳癌细胞抑制更明显。 p53抑制细胞生长作用与细胞内 p53基因状态有关，内含 mtp53或 wtp53缺失肿瘤细胞受抑制明显，而含 wtp53的人纤维母细胞则不受抑制； wtp53转染能提高放射抗拒的头颈鳞癌细胞系 jSQ-3的放射敏感性，这种效应具有时间和重组病毒感染剂量依赖性，1次20感染复数( multiplicity of infection， mOI)的 avlp53感染后36小时放射增敏效应最大。头颈鳞癌细胞系 jSQ-3接种裸鼠，待种植肿瘤体积长至12mm3时，一次性注射2.5×108～1.5×109噬菌斑形成单位( phagemid formation unit， pFU)的 avlp53，36～48小时后开始照射γ线2.5Gy，隔天1次，总剂量20Gy，实验组开始照射后42天至65天肿瘤全部消失，观察5个月未见复发，而单纯 avlp53局部注射组肿瘤持续生长或缩小至50%后又生长，单纯照射后早期肿瘤缩小，但照射5周后又复发；病理切片也显示 p53加照射组肿瘤放射反应明显重于单纯照射组或单纯基因转染组。
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xu等[19]利用转铁蛋白脂质体转染 wtp53，发现被转染的细胞内有大量的 p53蛋白表达，并能消除细胞内 mtp53效应，提高放射抗拒性 jSQ-3细胞放射敏感性，1×105细胞内导入3μ g质粒可以把 d10(使细胞存活率下降到10%所需的剂量)由(6.36±0.54) gy降至(4.13±0.06) gy， p<0.01，接近于放射敏感的纤维母细胞系 h500细胞，其 d10为(4.5±0.05) gy。
gallardo等[20]着重研究了 p53基因缺失的卵巢癌细胞系接受腺病毒( aden-ovirus， adV)介导 wtp53基因转染后的放射敏感性改变。体外实验发现 mOI为10∶1的 adVp53感染48小时后，几乎所有细胞均表达 p53蛋白，每隔48小时计数细胞，7天后转染 wtp53的细胞仅约为对照组的1/3，说明 wtp53转染有一定的抑制肿瘤细胞生长作用；照射2Gy或4Gy后发现转染 wtp53的细胞放射敏感性明显高于对照组( p<0.05)。体内实验用5×106SK-OV-3细胞接种 sCID小鼠，4周后肿瘤直径长至0.5～0.6cm时，实验组和对照组分别注射1×108PFU的 adVp53和 adVLacZ，注射3天后，免疫组化 p53蛋白染色说明 p53转染至50%的肿瘤细胞，照射采用60Co，24Gy，6次，结果发现单纯照射组和单纯 adVp53转染组肿瘤生长曲线相似，均比 adVLacZ组和生理盐水组生长缓慢，但没有长期控制， adVp53加照射组45%肿瘤得以控制，观察50天后无肿瘤复发。
总之，基因治疗是现代医学的研究热点，有可能在一定程度上改变人类疾病治疗的历史进程，但目前的基因治疗尚处于婴儿期，在目的基因有效性、基因转移系统的可控性和靶向性方面还存在许多问题，短期内难以在临床上单独发挥作用，研究与基因治疗有关的综合治疗是一件有意义的工作。, 百拇医药
几十年来，许多放射生物学和放射肿瘤学专家致力于寻找提高肿瘤放射敏感性的理想药物，试用了生物还原剂、亲电子化合物、修复抑制剂等诸多药物，均因效果欠佳或毒性大而未能广泛应用于临床[1]。近年来分子生物学迅猛发展，为肿瘤学和放射肿瘤学研究提供了新的线索。癌基因、抗癌基因及细胞内信号传导的研究进一步丰富了放射线治疗肿瘤的理论[2-4]。因此作者综述 p53基因转染提高肿瘤放射敏感性的实验研究进展。
1 p53基因与肿瘤放射敏感性
近年来的研究证明，细胞受到射线照射之后所发生的一系列变化都与基因有关[5-7]。射线引起细胞内双链断裂之后， dNA依赖的蛋白激酶( dNA dependentprotein kinase， dNA-PK)或共济失调性毛细管扩张症突变基因( mutated in ataxia telangiectasia， aTM)把信号传递给 p53基因，其表达产物为 p53蛋白。 p53蛋白利用其羧基域直接识别 dNA损伤，同时通过反式激活上调另一种抑癌基因 wAF1/ cIP1( wild-typep53-activated frag-ment1/ cDK interacting protein1)，表达产生一种相对分子质量为21×103的蛋白质 p21，后者抑制增殖细胞核抗原和多种细胞周期素，如细胞由 g1期进入 s期所必需的细胞周期素 d( cyclinD)、细胞周期素依赖的激酶4( cyclin dependent ki-nase4， cDK4)及 cyclinE和 cDK2，使分裂细胞阻滞于 g1期，保证细胞在复制 dNA之前有足够的时间修复损伤的 dNA。如果细胞 dNA损伤未能得到及时修复，则可能 p53蛋白会进而下调 bcl-2基因和(或)上调 bax基因，引起细胞凋亡。野生型 p53( wild-typep53， wtp53)基因突变成为突变型 p53( mutant-typep53， mtp53)基因之后，则不但诱导凋亡的作用消失，反而抑制凋亡[8]。参与诱导凋亡的还有 apo-1， fas基因及肿瘤坏死因子α( tumor necrosis factorα， tNF-α)等，参与抑制凋亡的基因还有 h-ras， e1b等[9]。
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多数临床研究证明 p53基因与肿瘤放射敏感性有关，如：放射治疗疗效较好的肿瘤(髓母细胞瘤、头颈肿瘤、宫颈癌) p53基因突变提示预后不良[10]；放射敏感的肿瘤(精原细胞瘤，神经母细胞瘤) p53突变率低；神经系统中放射抗拒的星形细胞瘤 p53突变率高，而其他肿瘤 p53突变率低。但也有相反的报告，放射敏感的淋巴瘤和小细胞肺癌 p53基因突变相当常见，而放射抗拒的恶性黑色素瘤又缺乏 p53突变[11，12]。
大多数实验室研究也证明 p53与细胞放射敏感性有关，如表达内源性突变型 p53的细胞和野生型 p53敲除( knock out)的细胞的放射敏感性下降[10]；转染外源 mtp53基因细胞和转染无效 p53基因( null p53 transgenic)细胞放射敏感性下降，而外源 wtp53基因转染能抑制无 wtp53蛋白细胞的生长； p53蛋白被猿猴病毒( simian virus 40， sV40)大 t抗原和 hPV-E6基因失活的细胞放射敏感性下降。但也有人报告表达 mtp53的细胞放射敏感性增高，转染 mtp53的纤维母细胞放射敏感性增高[10，13，14]。
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上述研究结果有分歧的原因：(1)判断 p53对放射敏感性影响的标准不一致。(2)各实验采用的细胞来源不统一。(3)免疫组化法难以完全准确地反映 p53蛋白的功能[10]。一般认为 wtp53蛋白半衰期仅6～20分钟， mtp53蛋白半衰期长达数小时。免疫组化阴性提示细胞内 p53基因突变，但一些情况下组化阴性时 p53蛋白已失去功能，如： p53基因无义或移码突变、转录错误、结构重排以及 p53构型改变、不能进入细胞核、降解加快等，而另一些情况下免疫组化阳性时 p53蛋白又可能具有一定的功能，如 wtp53蛋白积聚或 mtp53蛋白保留部分功能[15，16]。
2 p53基因转移的载体
目的基因确定之后，基因转染的另一个重要问题就是选择基因转染的方法。裸鼠 dNA直接注射方法简便，缺点是转染范围限于注射部位附近的细胞、缺乏组织靶向性。近来有学者采用金粒携带 dNA高速轰击组织，在肝脏和肿瘤组织中表达目的基因，同样也存在类似的缺点[3]。利用载体转染基因是目前基因治疗实验研究中常用的方法，理想的载体应具有：(1)准确的靶向性，即特异地定位于某种细胞以减少副作用。(2)较高的转染效率。(3)外源基因表达强度和时限的可控性。(4)高容量，即可携带大片断的目的基因。(5)无副作用，即无致突变性，无免疫原性，无致病性。目前研究和使用较多的载体是重组腺病毒。它是线状双链 dNA病毒，常用的5型腺病毒早期转录区有6个独立区域： e1A， e1B， e2A， e2B， e3， e4。 e1A和 e1B分别位于基因组5’侧1.3～4.5基因图单位和4.6～11.1基因图单位处，其完整性是复制的必需条件，重组腺病毒可缺失 e1， e3或 e4区。最近，有人构建了缺失除内末端重复和包装序列以外全部其他序列的腺病毒载体，大大提高了外源基因容量[17]。腺病毒载体的优点是：(1)基因组为36kb，可插入较大的外源基因。(2)滴度高，大于1×1011cfu/ mL( colony-forming unit， cfu)。(3)转染效率高。(4)宿主范围广，除造血干细胞外，少量腺病毒载体转染其他组织均可得到有效表达。缺点是：(1)缺乏靶向性。(2)不能整合入宿主 dNA，外源基因表达期限短。(3)存在免疫反应和细胞毒作用。这主要是由于重组腺病毒中存在少量完整病毒基因，其低水平表达产生的病毒蛋白可引起免疫反应和淋巴细胞介导的细胞毒作用，损害宿主细胞。首次使用腺病毒载体后机体会产生免疫力，再次使用时机体会利用免疫反应较快清除腺病毒载体，难以达到转染外源基因的目的。利用放射线局部照射有可能减轻局部免疫反应，延长外源基因表达期限。
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3 p53基因转染提高肿瘤放射敏感性实验研究
pirollo等[18]采用腺病毒载体( aden-oviral vector， avl)携带 p53基因( avlp53)，并用 avl携带β-半乳糖苷酶( avllacZ)作对照，研究 p53基因对细胞放射敏感性的影响，结果表明： p53基因可抑制多种肿瘤的体外生长，如头颈鳞癌细胞系 jSQ-3， sQ20B， sCC61以及乳腺癌细胞系 sK-BR-3，其中对乳癌细胞抑制更明显。 p53抑制细胞生长作用与细胞内 p53基因状态有关，内含 mtp53或 wtp53缺失肿瘤细胞受抑制明显，而含 wtp53的人纤维母细胞则不受抑制； wtp53转染能提高放射抗拒的头颈鳞癌细胞系 jSQ-3的放射敏感性，这种效应具有时间和重组病毒感染剂量依赖性，1次20感染复数( multiplicity of infection， mOI)的 avlp53感染后36小时放射增敏效应最大。头颈鳞癌细胞系 jSQ-3接种裸鼠，待种植肿瘤体积长至12mm3时，一次性注射2.5×108～1.5×109噬菌斑形成单位( phagemid formation unit， pFU)的 avlp53，36～48小时后开始照射γ线2.5Gy，隔天1次，总剂量20Gy，实验组开始照射后42天至65天肿瘤全部消失，观察5个月未见复发，而单纯 avlp53局部注射组肿瘤持续生长或缩小至50%后又生长，单纯照射后早期肿瘤缩小，但照射5周后又复发；病理切片也显示 p53加照射组肿瘤放射反应明显重于单纯照射组或单纯基因转染组。
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xu等[19]利用转铁蛋白脂质体转染 wtp53，发现被转染的细胞内有大量的 p53蛋白表达，并能消除细胞内 mtp53效应，提高放射抗拒性 jSQ-3细胞放射敏感性，1×105细胞内导入3μ g质粒可以把 d10(使细胞存活率下降到10%所需的剂量)由(6.36±0.54) gy降至(4.13±0.06) gy， p<0.01，接近于放射敏感的纤维母细胞系 h500细胞，其 d10为(4.5±0.05) gy。
gallardo等[20]着重研究了 p53基因缺失的卵巢癌细胞系接受腺病毒( aden-ovirus， adV)介导 wtp53基因转染后的放射敏感性改变。体外实验发现 mOI为10∶1的 adVp53感染48小时后，几乎所有细胞均表达 p53蛋白，每隔48小时计数细胞，7天后转染 wtp53的细胞仅约为对照组的1/3，说明 wtp53转染有一定的抑制肿瘤细胞生长作用；照射2Gy或4Gy后发现转染 wtp53的细胞放射敏感性明显高于对照组( p<0.05)。体内实验用5×106SK-OV-3细胞接种 sCID小鼠，4周后肿瘤直径长至0.5～0.6cm时，实验组和对照组分别注射1×108PFU的 adVp53和 adVLacZ，注射3天后，免疫组化 p53蛋白染色说明 p53转染至50%的肿瘤细胞，照射采用60Co，24Gy，6次，结果发现单纯照射组和单纯 adVp53转染组肿瘤生长曲线相似，均比 adVLacZ组和生理盐水组生长缓慢，但没有长期控制， adVp53加照射组45%肿瘤得以控制，观察50天后无肿瘤复发。
总之，基因治疗是现代医学的研究热点，有可能在一定程度上改变人类疾病治疗的历史进程，但目前的基因治疗尚处于婴儿期，在目的基因有效性、基因转移系统的可控性和靶向性方面还存在许多问题，短期内难以在临床上单独发挥作用，研究与基因治疗有关的综合治疗是一件有意义的工作。, 百拇医药