肺炎衣原体感染在哮喘发病中的作用及意义
郭强 张连祥 蔡忠
【关键词】 肺炎衣原体； 感染； 哮喘
肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae，CP)是一种重要的呼吸道病原体。近年来研究发现，CP感染在哮喘的发作中可能起重要作用(1,2)。我们应用免疫荧光法测定哮喘患者血清中CP特异性抗体，采咽拭子用聚合酶链反应(PCR)进行 DNA扩增检测CP,采外周血计数嗜酸粒细胞，以健康体检者作对照，探讨CP感染在哮喘发病中的可能作用。
1 资料与方法
1.1 病例：2002年10月-2003年8月门诊和住院哮喘患者86例，其中男32例，女54例；平均年龄(41.3±12.1)岁；哮喘病史6个月内，均为近期哮喘。根据患者的发病时间和就诊时有无喘息分成3组：初次发病组16例，男4例，女12例；平均年龄(39.3±11.2)岁。有症状组27例，男11例，女16例；平均年龄(43.4±12.3)岁。未发作组43例，男17例，女26例；平均年龄(41.2±12.7)岁。哮喘诊断符合1997年中华医学会制订的支气管哮喘诊治标准(草案)。以40例健康体检者为对照组，其中男20例，女20例；平均年龄(39.6±14.3)岁.
, 百拇医药
1.2 方法：入院后或就诊时立即采静脉血2 ml，4周后采集第2份静脉血；部分患者同时采咽拭子洗涤于1 ml生理盐水中，-40 ℃保存，集中用PCR法进行CP扩增；均采外周血计数嗜酸粒细胞。试剂为CP原体CWL-029培养物涂片；异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗人IgG、IgM。PCR扩增特异引物为：5′-GTTGTTCATGAGGCCTACT-3′和5′-TGCATAACCTACGGTGTGTT-3′及Taq酶(均为华美公司制品)。
1.2.1 PCR检测CP：咽拭子标本混悬于1 ml、pH74的磷酸盐缓冲液(PBS)中，低速(500×g)离心10 min，去除细胞及黏液，再经1 500×g离心30 min，沉淀物按照常规方法提取DNA。PCR扩增程序为94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，延伸5 min，扩增产物经琼脂电泳、溴乙锭染色，检查637 bp扩增物。
1.2.2 荧光抗体法检测哮喘患者血清中CP抗体：应用CWL-029原体抗原涂片。待验血清2倍系列稀释，分别以FITC标记的羊抗人IgG和IgM抗体检测。在荧光显微镜下观察，读取阳性血清最高稀释度。CP感染的诊断标准：①急性感染：IgM≥1∶32或IgM≥1∶16，且咽拭子PCR阳性，或者双份血清抗体滴度增高4倍或以上。②慢性感染：IgG抗体滴度≥1∶64。1.3 统计学处理：数据采用均数±标准差(x±s)表示。近期哮喘各组CP感染阳性率采用χ2检验；抗体滴度均经以10为底的对数变换，再应用方差分析进行比较。IgG抗体滴度与嗜酸粒细胞计数作相关分析。
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2 结 果
2.1 各组CP感染阳性率比较见表1。
近期哮喘患者血清CP IgG抗体平均滴度和嗜酸粒细胞计数比较(表1)显示，两者有显著正相关(r=062,P<0.05)。
2.2 近期哮喘患者咽拭子PCR阳性率：随机采集20例咽拭子，阳性者17例(85%)，其中初次发病者9例，有症状者5例，未发作者3例；健康对照组采集10例咽拭子，其中阳性者3例(30%)，近期哮喘组与健康对照组比较差异有显著性(P<0.05)。
2.3 近期哮喘有症状组痰细菌培养结果：27例中9例(333%)分离到病原菌，其中流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌各2例，肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、肠杆菌、肺炎支原体和鲍曼不动杆菌各1例。
3 讨 论Normann等(3)对哮喘急性发作患儿进行CP检测，阳性率为12%。Hahn等(4)对163例青少年和成人哮喘患者用血清学试验和培养分离技术进行CP检测，其中20例(12%)有CP感染，10例(50%)属首次喘息发作，6例发展为慢性哮喘或慢性支气管炎；另143例慢性哮喘患者中有10例确定为近期CP感染。Schmidt等(5)用PCR法检测106例儿童喘息患者支气管吸取物中的CP，55例(51.9%)有CP感染。在Miyashita等(1)的研究中，急性发作期哮喘患者中有89%经血清学证实存在急性CP感染，明显高于对照组。郑闻等(6)研究报道，哮喘患者的CP特异性IgG抗体阳性率为81.3%。本研究结果显示，近期哮喘患者的急性CP感染率达337%,初次发病组和有症状组分别为43.7%和37.0%,明显高于未发作组27.9%,且均高于健康对照组，提示急性CP感染与近期哮喘有关；初次发病组和有症状组急性感染率均高于慢性感染率，未发作组慢性感染率高于有症状组和初次发病组。但各组间无统计学意义,提示慢性感染在近期哮喘患者中也很常见,可能是启动哮喘症状发作的促发因子；初次发病组IgG抗体滴度高于有症状组，有症状组高于未发作组，且均高于健康对照组，近期哮喘患者IgG抗体滴度和嗜酸粒细胞计数呈正相关。说明嗜酸粒细胞作为参与过敏反应的细胞在哮喘发病中起重要作用，CP感染可促使此类细胞增高；采用PCR法检测20例近期哮喘患者咽拭子CP阳性率达85%，但对照组健康者咽拭子CP阳性率为30%。说明PCR法检测CP可能有假阳性，也可能为携带者。本组有333%的患者同时有其他病原菌感染，提示CP感染只是哮喘的诱发因素之一。(致谢：本文得到王金良主任的指导，特此表示感谢。)
, http://www.100md.com
参考文献
1 Miyashita N,kubota Y,Nakajima M,et al.Chlamydia pneumoniae and exacerbations of asthma in adults(J).Ann Allergy Asthma Immunol,1998,80:405-409.
2 Cunningham A F,Johnston S L,Julious S A,et al.Chronic chlamydia pneumoniae infection and ashma exacerbation(J).Eur Respir J，1998,11:345-349.
3 Normann D,Jantus C A.Rapid detection of chlamydia pneumoniae by PCR-enzyme immunoassay(J).J Chin Microbiol,1998,36:1890-1894
, 百拇医药
4 Hahn D L,McDonald R.Can acute chlamydia pneumoniae respiratory tract infection initiate chronic asthma(J)？ Ann Allergy Asthma Immunol,1998,81:339-344
5 Schmidt T J,Muller C E，Fronczek F R,et al.Bronchial chlamydia pneumoniae infection markers of allergic inflammation and lung function in children(J).Pediatr Allergy Immunol,2001,12:257-265.
6 郑闻，施毅，夏锡荣，等.哮喘患者肺炎衣原体感染的临床研究(J).江苏医药，2000，26：710-711
作者单位 300051 天津市胸科医院作者简介：郭强(1954-)，男(汉族)，天津市人，副主任技师., 百拇医药
【关键词】 肺炎衣原体； 感染； 哮喘
肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae，CP)是一种重要的呼吸道病原体。近年来研究发现，CP感染在哮喘的发作中可能起重要作用(1,2)。我们应用免疫荧光法测定哮喘患者血清中CP特异性抗体，采咽拭子用聚合酶链反应(PCR)进行 DNA扩增检测CP,采外周血计数嗜酸粒细胞，以健康体检者作对照，探讨CP感染在哮喘发病中的可能作用。
1 资料与方法
1.1 病例：2002年10月-2003年8月门诊和住院哮喘患者86例，其中男32例，女54例；平均年龄(41.3±12.1)岁；哮喘病史6个月内，均为近期哮喘。根据患者的发病时间和就诊时有无喘息分成3组：初次发病组16例，男4例，女12例；平均年龄(39.3±11.2)岁。有症状组27例，男11例，女16例；平均年龄(43.4±12.3)岁。未发作组43例，男17例，女26例；平均年龄(41.2±12.7)岁。哮喘诊断符合1997年中华医学会制订的支气管哮喘诊治标准(草案)。以40例健康体检者为对照组，其中男20例，女20例；平均年龄(39.6±14.3)岁.
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1.2 方法：入院后或就诊时立即采静脉血2 ml，4周后采集第2份静脉血；部分患者同时采咽拭子洗涤于1 ml生理盐水中，-40 ℃保存，集中用PCR法进行CP扩增；均采外周血计数嗜酸粒细胞。试剂为CP原体CWL-029培养物涂片；异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗人IgG、IgM。PCR扩增特异引物为：5′-GTTGTTCATGAGGCCTACT-3′和5′-TGCATAACCTACGGTGTGTT-3′及Taq酶(均为华美公司制品)。
1.2.1 PCR检测CP：咽拭子标本混悬于1 ml、pH74的磷酸盐缓冲液(PBS)中，低速(500×g)离心10 min，去除细胞及黏液，再经1 500×g离心30 min，沉淀物按照常规方法提取DNA。PCR扩增程序为94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，延伸5 min，扩增产物经琼脂电泳、溴乙锭染色，检查637 bp扩增物。
1.2.2 荧光抗体法检测哮喘患者血清中CP抗体：应用CWL-029原体抗原涂片。待验血清2倍系列稀释，分别以FITC标记的羊抗人IgG和IgM抗体检测。在荧光显微镜下观察，读取阳性血清最高稀释度。CP感染的诊断标准：①急性感染：IgM≥1∶32或IgM≥1∶16，且咽拭子PCR阳性，或者双份血清抗体滴度增高4倍或以上。②慢性感染：IgG抗体滴度≥1∶64。1.3 统计学处理：数据采用均数±标准差(x±s)表示。近期哮喘各组CP感染阳性率采用χ2检验；抗体滴度均经以10为底的对数变换，再应用方差分析进行比较。IgG抗体滴度与嗜酸粒细胞计数作相关分析。
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2 结 果
2.1 各组CP感染阳性率比较见表1。
近期哮喘患者血清CP IgG抗体平均滴度和嗜酸粒细胞计数比较(表1)显示，两者有显著正相关(r=062,P<0.05)。
2.2 近期哮喘患者咽拭子PCR阳性率：随机采集20例咽拭子，阳性者17例(85%)，其中初次发病者9例，有症状者5例，未发作者3例；健康对照组采集10例咽拭子，其中阳性者3例(30%)，近期哮喘组与健康对照组比较差异有显著性(P<0.05)。
2.3 近期哮喘有症状组痰细菌培养结果：27例中9例(333%)分离到病原菌，其中流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌各2例，肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、肠杆菌、肺炎支原体和鲍曼不动杆菌各1例。
3 讨 论Normann等(3)对哮喘急性发作患儿进行CP检测，阳性率为12%。Hahn等(4)对163例青少年和成人哮喘患者用血清学试验和培养分离技术进行CP检测，其中20例(12%)有CP感染，10例(50%)属首次喘息发作，6例发展为慢性哮喘或慢性支气管炎；另143例慢性哮喘患者中有10例确定为近期CP感染。Schmidt等(5)用PCR法检测106例儿童喘息患者支气管吸取物中的CP，55例(51.9%)有CP感染。在Miyashita等(1)的研究中，急性发作期哮喘患者中有89%经血清学证实存在急性CP感染，明显高于对照组。郑闻等(6)研究报道，哮喘患者的CP特异性IgG抗体阳性率为81.3%。本研究结果显示，近期哮喘患者的急性CP感染率达337%,初次发病组和有症状组分别为43.7%和37.0%,明显高于未发作组27.9%,且均高于健康对照组，提示急性CP感染与近期哮喘有关；初次发病组和有症状组急性感染率均高于慢性感染率，未发作组慢性感染率高于有症状组和初次发病组。但各组间无统计学意义,提示慢性感染在近期哮喘患者中也很常见,可能是启动哮喘症状发作的促发因子；初次发病组IgG抗体滴度高于有症状组，有症状组高于未发作组，且均高于健康对照组，近期哮喘患者IgG抗体滴度和嗜酸粒细胞计数呈正相关。说明嗜酸粒细胞作为参与过敏反应的细胞在哮喘发病中起重要作用，CP感染可促使此类细胞增高；采用PCR法检测20例近期哮喘患者咽拭子CP阳性率达85%，但对照组健康者咽拭子CP阳性率为30%。说明PCR法检测CP可能有假阳性，也可能为携带者。本组有333%的患者同时有其他病原菌感染，提示CP感染只是哮喘的诱发因素之一。(致谢：本文得到王金良主任的指导，特此表示感谢。)
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参考文献
1 Miyashita N,kubota Y,Nakajima M,et al.Chlamydia pneumoniae and exacerbations of asthma in adults(J).Ann Allergy Asthma Immunol,1998,80:405-409.
2 Cunningham A F,Johnston S L,Julious S A,et al.Chronic chlamydia pneumoniae infection and ashma exacerbation(J).Eur Respir J，1998,11:345-349.
3 Normann D,Jantus C A.Rapid detection of chlamydia pneumoniae by PCR-enzyme immunoassay(J).J Chin Microbiol,1998,36:1890-1894
, 百拇医药
4 Hahn D L,McDonald R.Can acute chlamydia pneumoniae respiratory tract infection initiate chronic asthma(J)？ Ann Allergy Asthma Immunol,1998,81:339-344
5 Schmidt T J,Muller C E，Fronczek F R,et al.Bronchial chlamydia pneumoniae infection markers of allergic inflammation and lung function in children(J).Pediatr Allergy Immunol,2001,12:257-265.
6 郑闻，施毅，夏锡荣，等.哮喘患者肺炎衣原体感染的临床研究(J).江苏医药，2000，26：710-711
作者单位 300051 天津市胸科医院作者简介：郭强(1954-)，男(汉族)，天津市人，副主任技师., 百拇医药