蛋白转导治疗脑梗塞的实验研究
复旦大学附属华山医院神经科 (200040)
本实验首先应用pTransVector 构建了表达融合蛋白PTD-Calbindin D28K (CaBP) 和PTD-XIAP(BIR3-RING) 的重组质粒，转化BL21菌株后诱导表达并进行分离、纯化及Western blot鉴定。PTD-CaBP及PTD-XIAP 经FITC标记后，分别在体外及体内对其生物膜、血脑屏障通透功能进行鉴定。在此基础上，应用体外培养的器官型海马片OGD模型及SD大鼠MCAO模型对PTD-XIAP及PTD-CaBP的缺血脑保护作用进行研究，结果发现：
1. 用pTransVector 质粒表达得到的融合蛋白PTD-XIAP(BIR3-RING)和PTD-Calbindin D28K 不仅可以高效地转导进入体外培养的cos7细胞及器官型海马片细胞内，而且通过腹腔注射进入小鼠体内后穿透血脑屏障而进入脑细胞内，用His单克隆抗体进行免疫荧光染色后在脑组织各部位中可见大量阳性细胞，尤其在大脑皮质，血管、脑室周围(基底节区)多见；
2. MCAO大鼠脑组织缺血2h、再灌注72h后，缺血周边区可见大量的活性Caspase-3(+)及TUNEL(+)细胞；在梗死中心区残存的细胞内也可发现这些阳性细胞，尤其是Caspase-3(+)细胞。梗死侧半球内出现大量的活性Caspase-3蛋白片断，Procaspase-3、9 mRNA表达显著上调。这些结果充分说明，细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。
3. 无论是体外器官型海马片OGD实验，还是体内大鼠MCAO模型的研究，PTD-XIAP(BIR3-RING)和PTD-Calbindin D28K对脑缺血再灌注损伤均具有保护作用：
在体外实验中，以PTD-XIAP或PTD-CaBP孵育器官型海马片后进行缺氧缺糖(OGD)试验，复糖复氧后2、5、24、72h各个时点海马片细胞死亡均显著低于单纯OGD组海马片(PTD-XIAP孵育的海马片在1h即有减少)；72h时细胞存活也明显增加；电子显微镜观察发现，海马细胞超微结构明显改善。
在体内实验中，首先建立了MCAO大鼠脑组织局灶性缺血再灌注模型。在MCAO前1h或者MCAO后0.5h经腹腔注射PTD-XIAP或PTD-CaBP，再灌注72h后发现，PTD-CaBP或PTD-XIAP干预组大鼠梗死周边区脑组织中活性Caspase-3(+)及TUNEL(+)细胞均比单纯MCAO组显著减少，缺血侧脑组织Procaspase-3、Caspase-3蛋白活性裂解片断减少；PTD-CaBP还可以下调Procaspase-9 mRNA的表达。在PTD-CaBP或者PTD-XIAP作用下，大鼠神经功能缺损的恢复明显好于单纯MCAO组。但梗死体积并未发现明显缩小。
综上所述，PTD-XIAP或PTD-CaBP通过PTD的介导不仅能够穿过生物膜进入体外培养的细胞内，也可以穿透血脑屏障进入脑组织细胞内，且对缺血再灌注损伤具有显著的保护作用，为缺血脑保护新途径的探索提供些许帮助。, http://www.100md.com(吕传真 樊永峰)
本实验首先应用pTransVector 构建了表达融合蛋白PTD-Calbindin D28K (CaBP) 和PTD-XIAP(BIR3-RING) 的重组质粒，转化BL21菌株后诱导表达并进行分离、纯化及Western blot鉴定。PTD-CaBP及PTD-XIAP 经FITC标记后，分别在体外及体内对其生物膜、血脑屏障通透功能进行鉴定。在此基础上，应用体外培养的器官型海马片OGD模型及SD大鼠MCAO模型对PTD-XIAP及PTD-CaBP的缺血脑保护作用进行研究，结果发现：
1. 用pTransVector 质粒表达得到的融合蛋白PTD-XIAP(BIR3-RING)和PTD-Calbindin D28K 不仅可以高效地转导进入体外培养的cos7细胞及器官型海马片细胞内，而且通过腹腔注射进入小鼠体内后穿透血脑屏障而进入脑细胞内，用His单克隆抗体进行免疫荧光染色后在脑组织各部位中可见大量阳性细胞，尤其在大脑皮质，血管、脑室周围(基底节区)多见；
2. MCAO大鼠脑组织缺血2h、再灌注72h后，缺血周边区可见大量的活性Caspase-3(+)及TUNEL(+)细胞；在梗死中心区残存的细胞内也可发现这些阳性细胞，尤其是Caspase-3(+)细胞。梗死侧半球内出现大量的活性Caspase-3蛋白片断，Procaspase-3、9 mRNA表达显著上调。这些结果充分说明，细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。
3. 无论是体外器官型海马片OGD实验，还是体内大鼠MCAO模型的研究，PTD-XIAP(BIR3-RING)和PTD-Calbindin D28K对脑缺血再灌注损伤均具有保护作用：
在体外实验中，以PTD-XIAP或PTD-CaBP孵育器官型海马片后进行缺氧缺糖(OGD)试验，复糖复氧后2、5、24、72h各个时点海马片细胞死亡均显著低于单纯OGD组海马片(PTD-XIAP孵育的海马片在1h即有减少)；72h时细胞存活也明显增加；电子显微镜观察发现，海马细胞超微结构明显改善。
在体内实验中，首先建立了MCAO大鼠脑组织局灶性缺血再灌注模型。在MCAO前1h或者MCAO后0.5h经腹腔注射PTD-XIAP或PTD-CaBP，再灌注72h后发现，PTD-CaBP或PTD-XIAP干预组大鼠梗死周边区脑组织中活性Caspase-3(+)及TUNEL(+)细胞均比单纯MCAO组显著减少，缺血侧脑组织Procaspase-3、Caspase-3蛋白活性裂解片断减少；PTD-CaBP还可以下调Procaspase-9 mRNA的表达。在PTD-CaBP或者PTD-XIAP作用下，大鼠神经功能缺损的恢复明显好于单纯MCAO组。但梗死体积并未发现明显缩小。
综上所述，PTD-XIAP或PTD-CaBP通过PTD的介导不仅能够穿过生物膜进入体外培养的细胞内，也可以穿透血脑屏障进入脑组织细胞内，且对缺血再灌注损伤具有显著的保护作用，为缺血脑保护新途径的探索提供些许帮助。, http://www.100md.com(吕传真 樊永峰)