内毒素抑制肝细胞白蛋白表达的分子机制研究
王新颖 李维勤 李宁 黎介寿
【摘要】 目的 观察内毒素抑制大鼠肝细胞白蛋白表达的分子机制。方法 采用1 mg/L内毒素刺激大鼠肝细胞24 h。使用20、40和100 μmol/L的蛋白合成抑制剂环己酰亚胺预处理30 min。用逆转录-聚合酶链反应检测不同浓度环己酰亚胺预处理后肝细胞白蛋白的表达，同时检测肝细胞上清中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果内毒素刺激肝细胞24 h后白蛋白mRNA表达明显下降；环己酰亚胺预处理可以完全阻断白蛋白mRNA表达的下降，而且这种阻断作用存在剂量依赖性；同时内毒素刺激后肝细胞上清中IL-6和TNF-α水平较对照组明显升高(P均<0.05)，环己酰亚胺预处理后两者水平明显下降(P均<0.05)。结论内毒素通过抑制细胞因子IL-6和TNF-α释放间接抑制大鼠肝细胞白蛋白mRNA的表达。
【关键词】 内毒素； 白蛋白； 低蛋白血症； 细胞因子； 感染
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Study on molecular mechanisms of indirect suppression of albumin mRNA expression of hepatocytes by lipopolysaccharide in rat
WANG Xin-ying, LI Wei-qin, LI Ning, LI Jie-shou . Research Institute of General Surgery, Jinling Hospital, Nanjing 210002, Jiangsu, China
Objective: To explore the molecular mechanisms of relationship between the decreased expresssion of albumin gene of the cultured hepatocytes by lipopolysaccharide (LPS) and cytokines. Methods: As an inhibitor of protein synthesis, cycloheximide (CHX) could inhibit the LPS-induced synthesis of cytokines. Therefore, the culture system pretreated with CHX could exclude the influence of cytokines on the regulation of albumin gene expression, then it might prove that LPS induced down-regulation of expression of albumin gene was a through cytokine-dependent pathway. The concentrations of interleukin(IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF -α) in the supernatant were also assayed. Results: The expression of albumin mRNA is inhibited significantly by LPS. CHX could block the pathway of LPS-induced down-regulation of expression of albumin gene at least at the transcription level. And the prevention was in a dose-related manner. The increase of IL-6 and TNF-α induced by LPS was inhibited by CHX(both P<0.05). Conclusion: The results suggest that LPS can indirectly inhibit the transcription of albuminogene through cytokines such as IL-6 and TNF-α.
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【Key words】 lipopolysaccharide; albumin; hypoalbuminemia; cytokine; sepsis
创伤感染后肠道屏障减弱，内毒素吸收增加，可以显著抑制肝细胞白蛋白基因表达，但其中所涉及的分子机制尚不明确。目前已知许多细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-1等可以诱导肝细胞白蛋白合成的下降，同时内毒素能够刺激肝内的非实质细胞(如枯否细胞)产生这些因子(1，2)。但内毒素抑制大鼠肝细胞白蛋白表达是否通过细胞因子的介导仍不明确。我们在前期实验中采用逆转录-聚合酶链法(RT-PCR)观察内毒素处理肝细胞后0、2、8、12和24 h白蛋白mRNA的水平，结果发现直至内毒素处理后24 h白蛋白mRNA才出现明显的下降(1，2)，这一反应的滞后性与内毒素抑制白蛋白表达的通路是否相关尚不清楚。为了明确内毒素是否通过细胞因子介导的间接路径抑制肝细胞白蛋白的表达，我们选用环己酰亚胺(CHX)作为工具药，观察内毒素对肝细胞白蛋白mRNA表达的作用，同时检测细胞培养体系中细胞因子TNF-α、IL-6的浓度，以进一步明确内毒素诱导白蛋白的下降是否依赖于细胞因子TNF-α、IL-6的介导。
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1 材料与方法
1.1 实验试剂:内毒素(大肠杆菌O111:B4，Sigma,美国)，RPMI1640培养基(Gibco,爱尔兰)，胎牛血清(中国佰安生物工程公司)，6孔培养板(Nunclon,丹麦)。
1 2 高纯度原代大鼠肝细胞的分离培养:选用6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量180～200 g，购自上海动物实验中心。采用改良原位灌注法充分消化肝脏后，将肝细胞及肝窦内皮细胞轻轻分离至RPMI1640培养基中,细胞悬液过滤后洗涤3次，低速离心(50×g)5 min，获得纯化的肝细胞(3)。采用RPMI1640培养基培养分离得到的肝细胞，置含体积分数为5% CO 2的37 ℃孵箱，稳定培养2 d后换入新鲜培养基。
1.3 RT-PCR检测肝细胞白蛋白mRNA:Tripure
(Roche)提取肝细胞总RNA，一步法RT-PCR试剂盒(Promega)可将cDNA合成及扩增量入同管中进行。采用质量分数为25%的TAE缓冲液制备凝胶电泳等量RT-PCR产物，标准采用Takara公司的DL2000 DNA标准品(Marker)。凝胶电泳图片经柯达数码相机扫描后，使用Kodak 1D图像处理软件进行分析。白蛋白mRNA相对表达量为白蛋白条带吸光度/β-actin吸光度的比值(4)。
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4特异性阻断剂的配制及实验设计:用蒸馏水溶解CHX的粉末配制01 mol/L贮存液，贮存液稳定存在的pH值为3~5。溶液通过022 μm孔径的膜过滤除菌后分别将30、12和06 μl的贮存液加入3 ml的培养液中，得到终浓度为100、40和20 μmol/L。用不同浓度的CHX预处理肝细胞30 min后，加入1 mg/L的内毒素再处理24 h后提取细胞的总RNA，并留取肝细胞上清检测TNF-α和IL-6的水平。
1.5 细胞上清中TNF-α、IL-6水平的检测:肝细胞培养上清中TNF-α、IL-6浓度使用Promega公司的酶联免疫吸附法(ELISA)测到，实验操作严格按试剂盒说明进行。1.6 统计学处理:白蛋白浓度表示为均值±标准差(x±s)。数据统计采用单因素方差分析(ANOVA)，后续检验采用Newman-Keul检验。
2 结 果
2.1 CHX对内毒素诱导白蛋白表达的阻断作用(图1，图2)：用1 mg/L的内毒素刺激肝细胞24 h后白蛋白mRNA有明显的下降，CHX预处理可以阻断白蛋白表达的下降，并且随着CHX剂量的增加，这种阻断作用也越来越明显，存在剂量依赖性。2.2 CHX对肝细胞上清中IL-6表达的抑制作用(表1，图3)：内毒素组肝细胞上清中IL-6浓度较对照组IL-6的水平上升了约2倍，而CHX预处理组中IL-6浓度出现了下降，随着CHX浓度的增加，IL-6浓度不断下降，到CHX 100 μmol/L时，IL-6浓度接近对照组水平。
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3 讨 论
以往研究发现，许多细胞因子如TNF-α、IL-6等可诱导肝细胞白蛋白合成的下降，而内毒素能刺激肝内非实质细胞产生这些细胞因子(1，2)。1999年，Panesar等(5)发现内毒素也可以刺激肝细胞本身分泌IL-6。我们前期的研究表明，感染状态下细胞因子水平升高与白蛋白水平下降密切相关(2)。另外，有实验也观察到内毒素处理肝细胞24 h后白蛋白mRNA才有明显的下降(6)。这种反应滞后性的机制不明确，但也提示内毒素诱导的白蛋白基因表达下降可能需要新合成的中间蛋白参与。因此我们推测，内毒素诱导肝细胞白蛋白表达的下降是通过细胞因子的间接通路(2，5，7)。但至今为止，内毒素诱导白蛋白表达下降是否是通过细胞因子介导尚不明确。为了进一步明确这种可能性，我们选用了蛋白合成抑制剂CHX作为工具药，它可以通过抑制60S核糖体亚基肽转移酶活性来抑制蛋白的合成(8，9)。CHX是一种蛋白合成抑制剂，可以抑制体外培养体系中新的中间蛋白的合成。因此，CHX的预处理可以去除培养体系中细胞因子的影响。实验选用CHX是为了去除在内毒素刺激下原代肝细胞体外培养体系中新合成中间蛋白如细胞因子的作用。结果发现CHX预处理可以去除细胞因子TNF-α、IL-6的影响，从而阻断内毒素诱导的白蛋白mRNA表达下降，且这种阻断作用存在剂量依赖性。这一结果表明，内毒素是通过诱导细胞因子的产生间接抑制肝细胞白蛋白mRNA表达，此过程并非直接作用，需要细胞因子TNF-α、IL-6等新合成的中间蛋白参与。其中，CHX 预处理后大鼠肝细胞白蛋白mRNA表达高于对照组，提示细胞因子TNF-α、IL-6的抑制对白蛋白mRNA表达存在负反馈作用。综上，本研究证实了内毒素是通过诱导细胞因子表达间接抑制肝细胞白蛋白的合成，从而起到肝脏损伤作用，为进一步明确内毒素诱导白蛋白表达下降的分子机制奠定了基础。
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参考文献
1 Cerra F B,Mazuski J E,Bankey P E,et al.Role of monokines in altering hepatic metabolism in sepsis(J).Prog Clin Biol Res，1989，286:265-277.
2 李维勤，黎介寿，顾军,等.腹腔感染后低白蛋白血症的分子机理和防治实验研究(J).
中华外科杂志,1997,35:100-103.
3 王新颖,李维勤,李宁,等.高纯度大鼠原代肝细胞的分离培养(J).医学研究生学报，2003，6:684-686.
4 王新颖，李维勤，李宁，等.大鼠白蛋白基因片段的克隆及其mRNA半定量检测方法的建立(J).解放军医学杂志，2003，6:684-686.
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5 Panesar N,Tolman K,Mazuski J E.Endotoxin stimulates hepatocyte interleukin-6 production(J).J Surg Res，1999，85:251-258.
6 王新颖，李维勤，李宁，等.内毒素诱导大鼠肝细胞白蛋白表达下降的分子机制(J).中华外科杂志，2004，42：362-365.
7 West M A,Billiar T R,Mazuski J E,et al.Endotoxin modulation of hepatocyte secretory and cellular protein synthesis is mediated by Kupffer cells(J).Arch Surg，1988，123:1400-1405.
8 Kyriakis J M,Avruch J.pp54 microtubule-associated protein 2 kinase(J).J Biol Chem,1990,265:17355-17363.
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9 Matsuguchi T,Musikacharoen T,Ogawa T,et al.Gene expressions of Toll-like receptor 2,but not Toll-like receptor 4,is induced by LPS and inflammatory cytokines in mouse macrophages(J).J Immunol，2000，165:5767-5772.
作者单位：210002 南京军区南京总医院全军普通外科研究所
作者简介：王新颖(1978-)，女(汉族)，安徽省人，医学博士，主治医师，从事外科危重患者的营养支持与代谢调理的研究，已发表论文10余篇(Email:wxinying@263.net)。, http://www.100md.com
【摘要】 目的 观察内毒素抑制大鼠肝细胞白蛋白表达的分子机制。方法 采用1 mg/L内毒素刺激大鼠肝细胞24 h。使用20、40和100 μmol/L的蛋白合成抑制剂环己酰亚胺预处理30 min。用逆转录-聚合酶链反应检测不同浓度环己酰亚胺预处理后肝细胞白蛋白的表达，同时检测肝细胞上清中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果内毒素刺激肝细胞24 h后白蛋白mRNA表达明显下降；环己酰亚胺预处理可以完全阻断白蛋白mRNA表达的下降，而且这种阻断作用存在剂量依赖性；同时内毒素刺激后肝细胞上清中IL-6和TNF-α水平较对照组明显升高(P均<0.05)，环己酰亚胺预处理后两者水平明显下降(P均<0.05)。结论内毒素通过抑制细胞因子IL-6和TNF-α释放间接抑制大鼠肝细胞白蛋白mRNA的表达。
【关键词】 内毒素； 白蛋白； 低蛋白血症； 细胞因子； 感染
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Study on molecular mechanisms of indirect suppression of albumin mRNA expression of hepatocytes by lipopolysaccharide in rat
WANG Xin-ying, LI Wei-qin, LI Ning, LI Jie-shou . Research Institute of General Surgery, Jinling Hospital, Nanjing 210002, Jiangsu, China
Objective: To explore the molecular mechanisms of relationship between the decreased expresssion of albumin gene of the cultured hepatocytes by lipopolysaccharide (LPS) and cytokines. Methods: As an inhibitor of protein synthesis, cycloheximide (CHX) could inhibit the LPS-induced synthesis of cytokines. Therefore, the culture system pretreated with CHX could exclude the influence of cytokines on the regulation of albumin gene expression, then it might prove that LPS induced down-regulation of expression of albumin gene was a through cytokine-dependent pathway. The concentrations of interleukin(IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF -α) in the supernatant were also assayed. Results: The expression of albumin mRNA is inhibited significantly by LPS. CHX could block the pathway of LPS-induced down-regulation of expression of albumin gene at least at the transcription level. And the prevention was in a dose-related manner. The increase of IL-6 and TNF-α induced by LPS was inhibited by CHX(both P<0.05). Conclusion: The results suggest that LPS can indirectly inhibit the transcription of albuminogene through cytokines such as IL-6 and TNF-α.
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【Key words】 lipopolysaccharide; albumin; hypoalbuminemia; cytokine; sepsis
创伤感染后肠道屏障减弱，内毒素吸收增加，可以显著抑制肝细胞白蛋白基因表达，但其中所涉及的分子机制尚不明确。目前已知许多细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-1等可以诱导肝细胞白蛋白合成的下降，同时内毒素能够刺激肝内的非实质细胞(如枯否细胞)产生这些因子(1，2)。但内毒素抑制大鼠肝细胞白蛋白表达是否通过细胞因子的介导仍不明确。我们在前期实验中采用逆转录-聚合酶链法(RT-PCR)观察内毒素处理肝细胞后0、2、8、12和24 h白蛋白mRNA的水平，结果发现直至内毒素处理后24 h白蛋白mRNA才出现明显的下降(1，2)，这一反应的滞后性与内毒素抑制白蛋白表达的通路是否相关尚不清楚。为了明确内毒素是否通过细胞因子介导的间接路径抑制肝细胞白蛋白的表达，我们选用环己酰亚胺(CHX)作为工具药，观察内毒素对肝细胞白蛋白mRNA表达的作用，同时检测细胞培养体系中细胞因子TNF-α、IL-6的浓度，以进一步明确内毒素诱导白蛋白的下降是否依赖于细胞因子TNF-α、IL-6的介导。
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1 材料与方法
1.1 实验试剂:内毒素(大肠杆菌O111:B4，Sigma,美国)，RPMI1640培养基(Gibco,爱尔兰)，胎牛血清(中国佰安生物工程公司)，6孔培养板(Nunclon,丹麦)。
1 2 高纯度原代大鼠肝细胞的分离培养:选用6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量180～200 g，购自上海动物实验中心。采用改良原位灌注法充分消化肝脏后，将肝细胞及肝窦内皮细胞轻轻分离至RPMI1640培养基中,细胞悬液过滤后洗涤3次，低速离心(50×g)5 min，获得纯化的肝细胞(3)。采用RPMI1640培养基培养分离得到的肝细胞，置含体积分数为5% CO 2的37 ℃孵箱，稳定培养2 d后换入新鲜培养基。
1.3 RT-PCR检测肝细胞白蛋白mRNA:Tripure
(Roche)提取肝细胞总RNA，一步法RT-PCR试剂盒(Promega)可将cDNA合成及扩增量入同管中进行。采用质量分数为25%的TAE缓冲液制备凝胶电泳等量RT-PCR产物，标准采用Takara公司的DL2000 DNA标准品(Marker)。凝胶电泳图片经柯达数码相机扫描后，使用Kodak 1D图像处理软件进行分析。白蛋白mRNA相对表达量为白蛋白条带吸光度/β-actin吸光度的比值(4)。
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4特异性阻断剂的配制及实验设计:用蒸馏水溶解CHX的粉末配制01 mol/L贮存液，贮存液稳定存在的pH值为3~5。溶液通过022 μm孔径的膜过滤除菌后分别将30、12和06 μl的贮存液加入3 ml的培养液中，得到终浓度为100、40和20 μmol/L。用不同浓度的CHX预处理肝细胞30 min后，加入1 mg/L的内毒素再处理24 h后提取细胞的总RNA，并留取肝细胞上清检测TNF-α和IL-6的水平。
1.5 细胞上清中TNF-α、IL-6水平的检测:肝细胞培养上清中TNF-α、IL-6浓度使用Promega公司的酶联免疫吸附法(ELISA)测到，实验操作严格按试剂盒说明进行。1.6 统计学处理:白蛋白浓度表示为均值±标准差(x±s)。数据统计采用单因素方差分析(ANOVA)，后续检验采用Newman-Keul检验。
2 结 果
2.1 CHX对内毒素诱导白蛋白表达的阻断作用(图1，图2)：用1 mg/L的内毒素刺激肝细胞24 h后白蛋白mRNA有明显的下降，CHX预处理可以阻断白蛋白表达的下降，并且随着CHX剂量的增加，这种阻断作用也越来越明显，存在剂量依赖性。2.2 CHX对肝细胞上清中IL-6表达的抑制作用(表1，图3)：内毒素组肝细胞上清中IL-6浓度较对照组IL-6的水平上升了约2倍，而CHX预处理组中IL-6浓度出现了下降，随着CHX浓度的增加，IL-6浓度不断下降，到CHX 100 μmol/L时，IL-6浓度接近对照组水平。
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以往研究发现，许多细胞因子如TNF-α、IL-6等可诱导肝细胞白蛋白合成的下降，而内毒素能刺激肝内非实质细胞产生这些细胞因子(1，2)。1999年，Panesar等(5)发现内毒素也可以刺激肝细胞本身分泌IL-6。我们前期的研究表明，感染状态下细胞因子水平升高与白蛋白水平下降密切相关(2)。另外，有实验也观察到内毒素处理肝细胞24 h后白蛋白mRNA才有明显的下降(6)。这种反应滞后性的机制不明确，但也提示内毒素诱导的白蛋白基因表达下降可能需要新合成的中间蛋白参与。因此我们推测，内毒素诱导肝细胞白蛋白表达的下降是通过细胞因子的间接通路(2，5，7)。但至今为止，内毒素诱导白蛋白表达下降是否是通过细胞因子介导尚不明确。为了进一步明确这种可能性，我们选用了蛋白合成抑制剂CHX作为工具药，它可以通过抑制60S核糖体亚基肽转移酶活性来抑制蛋白的合成(8，9)。CHX是一种蛋白合成抑制剂，可以抑制体外培养体系中新的中间蛋白的合成。因此，CHX的预处理可以去除培养体系中细胞因子的影响。实验选用CHX是为了去除在内毒素刺激下原代肝细胞体外培养体系中新合成中间蛋白如细胞因子的作用。结果发现CHX预处理可以去除细胞因子TNF-α、IL-6的影响，从而阻断内毒素诱导的白蛋白mRNA表达下降，且这种阻断作用存在剂量依赖性。这一结果表明，内毒素是通过诱导细胞因子的产生间接抑制肝细胞白蛋白mRNA表达，此过程并非直接作用，需要细胞因子TNF-α、IL-6等新合成的中间蛋白参与。其中，CHX 预处理后大鼠肝细胞白蛋白mRNA表达高于对照组，提示细胞因子TNF-α、IL-6的抑制对白蛋白mRNA表达存在负反馈作用。综上，本研究证实了内毒素是通过诱导细胞因子表达间接抑制肝细胞白蛋白的合成，从而起到肝脏损伤作用，为进一步明确内毒素诱导白蛋白表达下降的分子机制奠定了基础。
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参考文献
1 Cerra F B,Mazuski J E,Bankey P E,et al.Role of monokines in altering hepatic metabolism in sepsis(J).Prog Clin Biol Res，1989，286:265-277.
2 李维勤，黎介寿，顾军,等.腹腔感染后低白蛋白血症的分子机理和防治实验研究(J).
中华外科杂志,1997,35:100-103.
3 王新颖,李维勤,李宁,等.高纯度大鼠原代肝细胞的分离培养(J).医学研究生学报，2003，6:684-686.
4 王新颖，李维勤，李宁，等.大鼠白蛋白基因片段的克隆及其mRNA半定量检测方法的建立(J).解放军医学杂志，2003，6:684-686.
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6 王新颖，李维勤，李宁，等.内毒素诱导大鼠肝细胞白蛋白表达下降的分子机制(J).中华外科杂志，2004，42：362-365.
7 West M A,Billiar T R,Mazuski J E,et al.Endotoxin modulation of hepatocyte secretory and cellular protein synthesis is mediated by Kupffer cells(J).Arch Surg，1988，123:1400-1405.
8 Kyriakis J M,Avruch J.pp54 microtubule-associated protein 2 kinase(J).J Biol Chem,1990,265:17355-17363.
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作者单位：210002 南京军区南京总医院全军普通外科研究所
作者简介：王新颖(1978-)，女(汉族)，安徽省人，医学博士，主治医师，从事外科危重患者的营养支持与代谢调理的研究，已发表论文10余篇(Email:wxinying@263.net)。, http://www.100md.com