石蜡包埋组织中麻风菌基因扩增试验初探
作者：吴勤学 尹跃平 张良芬 余艳华 侯伟 叶干运
单位：南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所 210042
关键词：分支杆菌；麻风聚合酶链反应
中华皮肤科杂志00zk21
【摘要】目的建立用石蜡包埋组织中麻风菌DNA进行基因扩增的试验。方法用Texpat试盒将石蜡切片脱蜡、破壁和释放麻风菌DNA并用100%乙醇沉淀纯化DNA，用引物RPOT(F)和RPUT (R)进行PCR。结果细菌指数大于1+的33份石蜡包埋标本，28份PCR阳性，细菌指数为0的标 本PCR阴性。阴性对照呈阴性反应，阳性对照呈阳性反应，方法敏感度达0.04pgDNA水平。结论用本法可从福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中释放麻风菌DNA，并获得满意基因扩增结果。
Gene Amplification Test of Mycobacterium Leprae in Paraffin- Embedded Tissue
, 百拇医药
WU Qinxue YING Yueping ZHANG Liangfen et al
(Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Nanjing210042)
【 Abstract】 Objective To establish a polymerase chain reaction(PCR) method to amplify DNA of M.leprae from fixed and paraffin- embedded tissue(FPET). Methods The DNA of M.leprae was released from FPET by using Texpat Kit and purified with 100% alcohol. The primers RPOT(1) and RPUT(2) were used to conduct the PCR. Results A total of 32 samples were examined. Out of 32 samples with BI of more than 1+ , 28 were positive for PCR. The PCR was negative in a sample with BI=0. The sensitivity of PCR reached a level of 0.04 pg DNA. Conclusion This PCR method is very useful for
, 百拇医药
amplifying the DNA of M.leprae from FPET.
【 Key word】 Mycobacterial leprae Polymerase chain reaction
由于用石蜡包埋组织中麻风菌进行基因扩增试验能大大拓宽麻风菌的研究范围，特别是回顾性研究[1]，国内外学者一直试图建立一个有效的方法，但由于既往组织在用石蜡包埋前多经福尔马林固定，为建立方法造成极大困难，所以至今国内外罕见成功的报道。最近日本学者松冈等对之有较大的改进[2]，参照他们的经验，我们获得初步成功，现将有关结果报告于下。
材料和方法
一、材料及其来源
(一)患者材料：麻风患者石蜡包埋组织。
, 百拇医药
(二)脱蜡及DNA提取剂：Texpat试盒，由日本国立感染病研究所多摩麻风研究中心松冈氏提供。
(三)标准DNA及阳性对照：标准麻风菌DNA(Thai53来源)由日本大阪大学微生物系牧野提供，浓度为2.15mg/mL。阳性对照为作者在日本多摩麻风中心自行扩增的被确认的PCR产物。
(四)PCR引物为RPOT(F)(简称P1)和RPUT(R)(简称P2)，由日本多摩麻风中心松冈氏提供。
二、方法
(一)模板DNA的制备：由石蜡包埋组织内麻风菌中提取与释放DNA，其程序如下：将切片机用70%酒精清洗干净，特别是刀片。取石蜡包埋组织(以下简称蜡块)将之切割成5μm厚切片置于1.5mLEppendorf管中，每管5片，尽置管底，向每管滴加Texpat液20滴，旋涡振荡后，置100℃水浴10min，于12000r/min离心15min，小心取150μL上清液置另一备好的Eppendorf管中，按2倍体积加无水酒精，旋涡振荡后置-72℃30min，于15000r/min离心15min，小心倾去上清液，管倒置自然干燥过夜或72℃水浴1h，或冷冻干燥30min或15000r/min真空离心30min，每管加入TE缓冲液50μL置-20℃备用。
, 百拇医药
(二)麻风菌DNA扩增和检测：每管加已提取的麻风菌DNA液1μL、dNTPs 8μL、P1 2.5μL、P2 2.5μL、Taq酶0.5μL、5×Buffer 10μL补DW至50μL。置于PTC-51B型PCR仪中，95℃10min，再按94℃90s，55℃90s，72℃120s总循环40次，最后72℃延伸10min，后取9μL扩增产物在15%聚丙烯酰胺凝胶或4%Metaphor琼脂糖电泳，用1%EB染色，在紫外检测仪下观察并照相记录结果。
结果
(一)PCR检测敏感度：用标准麻风菌Thai53之不同稀释度纯DNA作模板，放大结果见图1。在103处仍显阳性结果，相当于0.04pg/μL水平DNA。
图1 PCR检测敏感度
(二)PCR检测石蜡包埋组织切片结果：总检测标本33份，4份阴性，29份阳性。有2例BT亦为阳性。我们任选7份标本放大结果见图2。
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图2 PCR检测石蜡包埋组织切片结果
(三)不同BI石蜡包埋组织切片的PCR检测结果：32份切片中，PCR阳性见于BI>3(13份)，BI1～3(15份)；3份BI>3，1份BI≤1PCR阴性。BI1～3的标本全部检出，BI>3的标本绝大部分检出，BI≤1的标本未检出。表1结果提示PCR的检出率与切片中菌荷量有一定关系。
表1 不同保存时间石蜡包埋组织切片的PCR检测结果 取材年代
例数
PCR阳性
PCR阴性
距检测时间
不明
3
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2
1
不明
1976
1
1
0
23年
1977
1
1
0
22年
1991
, 百拇医药
2
2
0
8年
1996
5
4
1
3年
1997
6
5
1
2年
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1998
1
1
0
1年
1999
13
12
2*
2～3个月
合计
32
28
, 百拇医药
5
*其中1例BI为0
(四)不同保存时间石蜡包埋组织切片的PCR检测结果：见表1。本结果以1999年为最近保存时间，保存最长的是1976年和1977年的标本(距今20年以上)，PCR检测全为阳性，其它时间段阴性与阳性相间。在最短保存时间段里的标本PCR检测也有显示阴性结果的，原因待讨论。
讨论
有关用石蜡包埋组织中麻风菌进行基因扩增试验的报告罕见，以往许多学者曾作过尝试[1]均未获得成功。主要原因是大多石蜡包埋组织在包埋前经福尔马林固定降解了麻风菌DNA,对PCR有抑制作用难获成功[2]，且原来从石蜡包埋组织中提取麻风菌DNA手续烦琐且效率低。我们用石蜡包埋组织中麻风菌进行的基因扩增试验,结果表明含菌切片扩增可获满意结果。这可能归因于用Texpat试盒从石蜡切片提取DNA简单、快速而且效率很高；更主要的原因是松冈的引物高效且适于放大降解DNA[3]。本法的建立扩大了PCR在麻风的应用和研究范围，特别是作回顾性的研究有重要意义[4]。在当代收集适于研究用的新鲜活检标本较为困难的情况下尤为重要。用本法使有计划大规模地回顾性研究(如麻风菌的基因分型和分布，耐药菌株抵抗的分子机理的研究等)成为可能。
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在进行试验过程中结合我国的实际情况，将松冈方法作了一些变动，如将高速真空离心步骤改为自然干燥，PCR敏感度仍达0.04pg/μL水平(图1)，这样不但解决了必须采用高级设备的问题，而且更易推广使用。我们的实验表明此步如改为72℃水浴1～2h，或冷冻干燥30min至1h，亦可获得满意结果；将4%Metaphor琼脂糖电泳改为15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，不但获得了满意的结果，而且节约了经费。
参考文献
1，Workshop on PCR technology for the detection of M.leprae. Thailand: April 1991.8- 19.
2，Pierard PE. The polymerase chain reaction method and applications in dermatology, Exp Dermatol, 1993,15(2):118- 126.
3，松冈正典,前田伸司，甲斐雅规，他.らハ菌rPOT遗子の多型性之の地理分布.JapaneseJ Lepr,1999,68:51.
4，黄培堂,俞炜源,陈添等译.PCR技术实验指南.北京:北京科学技术出版社,1998.59.
(收稿日期：1999-12-10), 百拇医药
单位：南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所 210042
关键词：分支杆菌；麻风聚合酶链反应
中华皮肤科杂志00zk21
【摘要】目的建立用石蜡包埋组织中麻风菌DNA进行基因扩增的试验。方法用Texpat试盒将石蜡切片脱蜡、破壁和释放麻风菌DNA并用100%乙醇沉淀纯化DNA，用引物RPOT(F)和RPUT (R)进行PCR。结果细菌指数大于1+的33份石蜡包埋标本，28份PCR阳性，细菌指数为0的标 本PCR阴性。阴性对照呈阴性反应，阳性对照呈阳性反应，方法敏感度达0.04pgDNA水平。结论用本法可从福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中释放麻风菌DNA，并获得满意基因扩增结果。
Gene Amplification Test of Mycobacterium Leprae in Paraffin- Embedded Tissue
, 百拇医药
WU Qinxue YING Yueping ZHANG Liangfen et al
(Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Nanjing210042)
【 Abstract】 Objective To establish a polymerase chain reaction(PCR) method to amplify DNA of M.leprae from fixed and paraffin- embedded tissue(FPET). Methods The DNA of M.leprae was released from FPET by using Texpat Kit and purified with 100% alcohol. The primers RPOT(1) and RPUT(2) were used to conduct the PCR. Results A total of 32 samples were examined. Out of 32 samples with BI of more than 1+ , 28 were positive for PCR. The PCR was negative in a sample with BI=0. The sensitivity of PCR reached a level of 0.04 pg DNA. Conclusion This PCR method is very useful for
, 百拇医药
amplifying the DNA of M.leprae from FPET.
【 Key word】 Mycobacterial leprae Polymerase chain reaction
由于用石蜡包埋组织中麻风菌进行基因扩增试验能大大拓宽麻风菌的研究范围，特别是回顾性研究[1]，国内外学者一直试图建立一个有效的方法，但由于既往组织在用石蜡包埋前多经福尔马林固定，为建立方法造成极大困难，所以至今国内外罕见成功的报道。最近日本学者松冈等对之有较大的改进[2]，参照他们的经验，我们获得初步成功，现将有关结果报告于下。
材料和方法
一、材料及其来源
(一)患者材料：麻风患者石蜡包埋组织。
, 百拇医药
(二)脱蜡及DNA提取剂：Texpat试盒，由日本国立感染病研究所多摩麻风研究中心松冈氏提供。
(三)标准DNA及阳性对照：标准麻风菌DNA(Thai53来源)由日本大阪大学微生物系牧野提供，浓度为2.15mg/mL。阳性对照为作者在日本多摩麻风中心自行扩增的被确认的PCR产物。
(四)PCR引物为RPOT(F)(简称P1)和RPUT(R)(简称P2)，由日本多摩麻风中心松冈氏提供。
二、方法
(一)模板DNA的制备：由石蜡包埋组织内麻风菌中提取与释放DNA，其程序如下：将切片机用70%酒精清洗干净，特别是刀片。取石蜡包埋组织(以下简称蜡块)将之切割成5μm厚切片置于1.5mLEppendorf管中，每管5片，尽置管底，向每管滴加Texpat液20滴，旋涡振荡后，置100℃水浴10min，于12000r/min离心15min，小心取150μL上清液置另一备好的Eppendorf管中，按2倍体积加无水酒精，旋涡振荡后置-72℃30min，于15000r/min离心15min，小心倾去上清液，管倒置自然干燥过夜或72℃水浴1h，或冷冻干燥30min或15000r/min真空离心30min，每管加入TE缓冲液50μL置-20℃备用。
, 百拇医药
(二)麻风菌DNA扩增和检测：每管加已提取的麻风菌DNA液1μL、dNTPs 8μL、P1 2.5μL、P2 2.5μL、Taq酶0.5μL、5×Buffer 10μL补DW至50μL。置于PTC-51B型PCR仪中，95℃10min，再按94℃90s，55℃90s，72℃120s总循环40次，最后72℃延伸10min，后取9μL扩增产物在15%聚丙烯酰胺凝胶或4%Metaphor琼脂糖电泳，用1%EB染色，在紫外检测仪下观察并照相记录结果。
结果
(一)PCR检测敏感度：用标准麻风菌Thai53之不同稀释度纯DNA作模板，放大结果见图1。在103处仍显阳性结果，相当于0.04pg/μL水平DNA。
图1 PCR检测敏感度
(二)PCR检测石蜡包埋组织切片结果：总检测标本33份，4份阴性，29份阳性。有2例BT亦为阳性。我们任选7份标本放大结果见图2。
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图2 PCR检测石蜡包埋组织切片结果
(三)不同BI石蜡包埋组织切片的PCR检测结果：32份切片中，PCR阳性见于BI>3(13份)，BI1～3(15份)；3份BI>3，1份BI≤1PCR阴性。BI1～3的标本全部检出，BI>3的标本绝大部分检出，BI≤1的标本未检出。表1结果提示PCR的检出率与切片中菌荷量有一定关系。
表1 不同保存时间石蜡包埋组织切片的PCR检测结果 取材年代
例数
PCR阳性
PCR阴性
距检测时间
不明
3
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2
1
不明
1976
1
1
0
23年
1977
1
1
0
22年
1991
, 百拇医药
2
2
0
8年
1996
5
4
1
3年
1997
6
5
1
2年
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1998
1
1
0
1年
1999
13
12
2*
2～3个月
合计
32
28
, 百拇医药
5
*其中1例BI为0
(四)不同保存时间石蜡包埋组织切片的PCR检测结果：见表1。本结果以1999年为最近保存时间，保存最长的是1976年和1977年的标本(距今20年以上)，PCR检测全为阳性，其它时间段阴性与阳性相间。在最短保存时间段里的标本PCR检测也有显示阴性结果的，原因待讨论。
讨论
有关用石蜡包埋组织中麻风菌进行基因扩增试验的报告罕见，以往许多学者曾作过尝试[1]均未获得成功。主要原因是大多石蜡包埋组织在包埋前经福尔马林固定降解了麻风菌DNA,对PCR有抑制作用难获成功[2]，且原来从石蜡包埋组织中提取麻风菌DNA手续烦琐且效率低。我们用石蜡包埋组织中麻风菌进行的基因扩增试验,结果表明含菌切片扩增可获满意结果。这可能归因于用Texpat试盒从石蜡切片提取DNA简单、快速而且效率很高；更主要的原因是松冈的引物高效且适于放大降解DNA[3]。本法的建立扩大了PCR在麻风的应用和研究范围，特别是作回顾性的研究有重要意义[4]。在当代收集适于研究用的新鲜活检标本较为困难的情况下尤为重要。用本法使有计划大规模地回顾性研究(如麻风菌的基因分型和分布，耐药菌株抵抗的分子机理的研究等)成为可能。
, http://www.100md.com
在进行试验过程中结合我国的实际情况，将松冈方法作了一些变动，如将高速真空离心步骤改为自然干燥，PCR敏感度仍达0.04pg/μL水平(图1)，这样不但解决了必须采用高级设备的问题，而且更易推广使用。我们的实验表明此步如改为72℃水浴1～2h，或冷冻干燥30min至1h，亦可获得满意结果；将4%Metaphor琼脂糖电泳改为15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，不但获得了满意的结果，而且节约了经费。
参考文献
1，Workshop on PCR technology for the detection of M.leprae. Thailand: April 1991.8- 19.
2，Pierard PE. The polymerase chain reaction method and applications in dermatology, Exp Dermatol, 1993,15(2):118- 126.
3，松冈正典,前田伸司，甲斐雅规，他.らハ菌rPOT遗子の多型性之の地理分布.JapaneseJ Lepr,1999,68:51.
4，黄培堂,俞炜源,陈添等译.PCR技术实验指南.北京:北京科学技术出版社,1998.59.
(收稿日期：1999-12-10), 百拇医药