三七总皂甙对脑出血大鼠前脑生长因子等影响的实验研究
作者：张俊敏 朱培纯
单位：北京中医药大学解剖学教研室，北京100029
关键词：生长因子；脑出血；免疫组织化学；大鼠
解剖学报00zk19
【摘要】目的 研究三七总皂甙对脑出血大鼠脑内碱性成纤维细胞生 长因子(bFGF)、层粘连蛋白(Ln)表达的影响及可能机制。 方法 用免疫 组织化学方法观察胶原酶诱导 的脑出血大鼠脑内bFGF、Ln在给药组和对照组的表达变化。 结果 脑出 血后脑内bFGF主要在扣 带皮质、海马、缰核及其他区域表达，阳性细胞主要有神经元、神经胶质、吞噬细胞、室管 膜细胞、伸长细胞等；Ln不仅在大脑皮质、海马、缰核、下丘脑等区域的神经元表达，且在 这些区域的 神经胶质细胞也表达，血管也有阳性反应。以上活性因子给药组比对照组表达明显增强。 结论 三七总皂甙可通过上调bFGF、Ln的表达促进脑出血后脑内神经元的存活及损伤 修复。
, 百拇医药
【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)增-72
STUDY ON EXPRESSION OF GROWTH FACTOR ETC AFTER INTRACEREBRAL HEMORRHAGE AND EFFECT OF PANAX NOTOGINSENG SAPONINS
ZHANG Jun-min，ZHU Pei-chun
(Departmont of Anatomy,Beijing University of Chinese Medicine and Pharm acolocology,Beijing 100029,China)
【Abstract】Objective To study the expression of bFGF ,Ln in brain aft er intracerebral hemorrhage and effect of Panax notoginseng saponins.Met hod Immu nohistochemistry technique has been used to examine the change of expression of bFGF and Ln in rat brain in treatment group and control group after intracerebral hemo rrhage.Result bFGF immunoreactivity was found in neuron and gli al cell in corte x,hippocampus habenular nucleus,and found in macrophage surrounding hematoma; Ln immunoreactivity was found in neurons,glial cells and blood vessles in front a l cortex,hippocampus,thalamus hypothalamus.All of these active moleculars were e nh anced in treatment group against control group.Conclusion The expres sion of bFGF,Ln were increased in frontal brain aftet intracerebral hemorrh age by Panax notoginseng saponins.
, http://www.100md.com
【Key words】Gorwth factor; Intracerebral hemorrhage; Immun ohistochemistry; Rat 三七具有止血、活血、散瘀、消肿止痛等作用。云南植物药厂已成功地从三七中提纯出其活性成分，并研制出针剂——三七总皂甙注射液(血塞通)。临床研究表明，三七总皂甙对脑缺血及脑出血后遗症有确切疗效，尤其对急性期缺血性脑血管疾病疗效显著，但对脑出血急性期的作用尚未见报道，本研究用胶原酶诱发脑出血模型，探讨三七总皂甙对脑出血大鼠脑内大脑皮质、海马、缰核碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、层粘连蛋白(Ln)表达的影响。
材料和方法
1.动物分组与处置
用Wister大鼠73只，体重200～250g，雌雄不拘，用10%水合氯醛腹腔麻醉(400mg/kg体重)，将大鼠固定在SN-2型脑立体定位仪上，切开头部正中皮肤，暴露颅骨，以前囟为原点，向左旁开4mm,后1mm，在颅骨表面钻孔，直径1mm，向下进针5mm，用自动推进器向左侧尾壳核缓注0.4μ1胶原酶(Sigma,type Vll，lunit/μ1),于10min内注完。造模后，将动物分为给药组与对照组，给药组手术后每天腹腔注射三七皂甙针剂0.5ml和0.5ml生理盐水，对组每天腹腔注射生理盐水1ml。各组动物分别于造膜后1、3、7、40d 取材。用水合氯醛麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，快速灌入200ml生理盐水冲洗，后用250ml 0.1mol/L磷酸缓冲液配制的4%多聚甲醛(pH7.2～7.4)快速固定，当动物肢体伸展后减慢灌注速度，约30min内灌注完毕。随后打开颅骨，取出大脑，置于上述固定液中后固定4h以上，入20%蔗糖溶液(用0.1mol/L PBS配置)，4℃保存。切片前脑组织经液氮骤冷，恒冷箱切片(厚30μm)，将配对的对照组和给药组固定在同一载物托上切片，并粘贴在同一张载玻片上。保存于-30℃冰箱备用。
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2.免疫组织化学法
免疫组织化学染色用ABC法：(1)切片入H2O2甲醇液，室温20min;(2)正常羊血清，室温3 0min(3)兔抗bFGF(1：1000，Sigma),兔抗Lminin(1：600，ZYMED公司)4℃过夜；(4)生物素化羊抗兔IgG和ABC 复合物(1：200)(HISTOSTATN-SP药盒，ZYMED公司)，室温40min；(5)0.05%DAB(用0.01mol/L PBS配置)预孵40min;(6)0.01%H2 O2与0.05%DAB呈色，部分切片用硫酸镍胺加强染色。上述各抗血清的稀释及切片漂洗均用0.01mol/L(pH7.4)。在步骤(1)～(4)前后均用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min。阴性对照：(1)省去一抗；(2)用正常羊血清代替一抗。
3.图像分析
, 百拇医药
对免疫组织化学染色结果，各组选取3张切片，每张切片选取3个视野，用CMIAS8真彩色病理图像分析系统(中国航空航天大学图像分析中心)进行分析，统计每个视野中阳性反应的面积。
4.统计方法
多组间资料统计采用方差分析，两组间资料统计采用t检验。率的比较用卡方检验。数据用SPSS软件处理。
结 果
1.bGFG免疫组织化学染色
在正常脑组织中，bFGF阳性神经元主要见于海马CA2区锥体神经元和大脑皮质扣带区。非神经细胞主要分布于脉络丛上皮细胞和室管膜细胞。这些细胞均为轻度表达，细胞胞浆染成浅淡棕色。
1.1大脑皮质：脑出血后1d，大脑皮质扣带区、额叶即有bFGF阳性神经元和胶质细胞，神经元胞体较大，胶质细胞呈卵圆形、胞体较小，染色较浅。脑出血后3d和7d反应明显增强，尤以7d反应最为突出，阳性反应细胞密集，着深棕色，大神经元胞浆与大突起均着色(图1，2)。40d反应减弱，阳性神经元稀少，但神经胶质细胞明显增多，反应增强，整个细胞呈深棕色，图像分析与统计学处理，脑出血各时间段阳性细胞的总和即阳性面积给药组比对照组高、具有显著性差异P<0.01(表1)。
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表1 脑出血大鼠不同时间大脑皮质bFGF
阳性表达面积的变化Table 1 Area of basic fibroblast growth factor immunopositivity after intracerebral hemorrhage in cortex of rat (
±s,μm2) 组别(group)
对照组(control)
给药组(treatment)
(n=9)
(n=9)
Day1
, 百拇医药
20.35±1.15
28.66±2.05
Day3
23.73±4.47
34.05±4.00
Day7
26.01±2.54
47.61±2.08
Day40
8.85±0.21
24.58±0.72
1.2海马：脑出血后1d，即可见海马内锥体细胞呈bFGF弱阳性，它们在CA1～CA4均有表达，胶质细胞反应有少量分布，呈棕色。脑出血后3d、7d、时反应显著增强，CA2区的阳性锥体细胞反应最强，CA3区次之，CA4更弱，CA1最弱。胞体及大突起均有反应，胞体呈棕色，突起浅棕色。bFGF阳性胶质细胞反应也上调，阳性细胞分布较密集，呈深棕色， 脑出血后40d，海马内阳性神经元少见，但bFGF阳性胶质细胞在海马各层均匀分布、尤以齿状回、门内分布最稠密，且染色较深，整个细胞均呈深棕色。统计学处理和图像分析表明海马内阳性细胞的面积给药组显著高于对照组P<0.05(表2)。表2 脑出血大鼠不同时间海马bFGF表达的
, 百拇医药
阳性面积的变化
Table 2 Area of basic fibroblast growth factor immunopositivity after intracerebral hemorrhage in hippocampus of rat (±s，μm2) 组别(group)
对照组(control)
给药组(tretment)
(n=9)
(n=9)
Day1
39.72±0.16
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90.23±7.04
Day3
65.34±1.34
72.19±9.79
Day7
87.84±2.03
165.4±10.21
Day40
46.31±1.89
123.69±6.05
1.3缰核：缰核在脑出血后1d即有反应，3d有所增强，7d显著增强，40d时与7d反应接近。神经元以3d、7d在缰核区域反应为强(图3，4)。而胶质细胞在40d反应最为突出，统计学处理和图像分析表明各时间段给药组均比对照组阳性反应面积增大(P<0.01)，反应程度也有增强(表3)。表3 脑出血大鼠不同时间缰核bFGF阳性表达面积的变化
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Table 3 Area of basic fibroblast growth factor immunopositivity after introcerebral hemorrhage in habenular nucleus in rat (±s,μm2) 组别(group)
对照组(control)
给药组(treatment)
(n=9)
(n=9)
Day1
133.24±9.51
, 百拇医药 182.53±13.85
Day3
134.49±14.40
323.64±41.82
Day7
160.92±30.72
395.29±17.51
Day40
140.88±15.21
367.36±23.19
2.Ln免疫组织化学染色
, 百拇医药 正常大鼠脑内额叶皮质的Ⅲ、Ⅴ层神经细胞轻度表达Ln,核为阴性，海马Ln阳性反应主要见于CA2区锥体细胞层，胞体有较弱的阳性反应。此外脑内血管基底膜也有阳性反应。脑出血后病灶内可见吞噬细胞表达Ln，也有Ln阳性反应血管，形态各异。
2.1大脑皮质：脑出血后ld，大脑皮质额叶的神经细胞呈Ln阳性，其小的卵圆形或圆形胶质细胞也呈Ln弱阳性。脑出血后3d，阳性反应增强，前额叶、扣带区、杏仁区和各层均有Ln阳性反应神经元与胶质细胞，神经元胞体较大，着色较深，胞浆近膜处阳性颗粒分布、核仁也着色(图5，6)。脑出血后7d、阳性反应显著增强，皮质细胞各层均有Ln阳性反应，阳性神经元胞浆及大突起着色，胶质细胞主要在胞浆有阳性Ln颗粒，核为阴性。脑出血后40d较7d略有减弱。脑出血各时间段的图像分析与统计学处理表明，给药组均比对照组反应增强(P<0.05)，表现为反应面积增大，反应强度即光密度值也升高(表4)。
2.2海马：脑出血后1d，海马阳性神经元见于锥体细胞层，反应强度中等。脑出血后3d，海马反应有所增强，CA1～CA4区阳性细胞数量增多，尤以CA2为突出，细胞排列紧密(图7，8)，胞浆及突起着色，有的整个细胞被染成棕色， 脑出血后7d反应明显增强，而40d时反应略有减弱，图像分析与统计学处理表明，三七总皂甙治疗组Ln阳性反应面积比脑出血后各相应对照明显增大。表4 脑出血大鼠不同时间大脑皮质Ln
, 百拇医药
阳性表达面积的变化
Table 4 Area of laminin immunopositivity in cerebral cortex after intracerebral hemorrhage in rat (±s，μm2) 组别(group)
对照组(control)
给药组(treatment)
(n=9)
(n=9)
Day1
156.67±15.71
, http://www.100md.com
199.26±26.06
Day3
200.27±30.49
275.37±86.57
Day7
218.88±45.21
335.76±40.96
Day40
143.25±33.60
274.59±64.34
讨 论
bFGF免疫组织化学及原位杂交研究表明，机械性脑损伤和化学性脑损伤及脑缺血等均可引起FGF及FGFmRNA的表达上调[1，2]。本研究用胶原酶注入尾壳核引起脑出血后，在前脑内bFGF上调的范围远远大于脑缺血，除了额顶叶皮质、海马外，还见于缰核、丘脑、下丘脑的一些核团的神经元，(关于缰核的bFGF的表达，尚未见报道)。此外非神经元(包括室管膜细胞、伸长细胞、反应性星形胶质细胞)也明显表达。本研究结果证明，三七总皂甙可使皮质、海马、缰核神经元内bFGF明显上调。bFGF和其他神经营养因子一样具有多功能性[3]，在胚胎发育和分化中起重要作用，成年后只有少数脑区有轻度表达，当脑损伤或脑缺血时则明显上调，加速创伤的愈合，三七总皂甙促进bFGF增高可能也是起到对损伤神经元的保护作用。已知脑缺血或脑出血造成神经元损伤有多种机制，如细胞内钙超载，兴奋性氨基酸如谷氨酸的毒性作用[4]，NO、自由基的产生释放、铁离子的增多等等，而脑出血后急性期bFGF在神经元表达正是对神经元内急性损伤的一种拮抗作用，对神经细胞起到保护作用。体外培养研究表明，bFGF可以拮抗谷氨酸的兴奋性毒性作用，抑制NO的释放[5]，阻止细胞的钙离子浓度升高。以往工作也证明三七总皂甙能降低缺氧机体耗氧量，维持缺血脑细胞膜及微血管膜的稳定性[6]，及特异性阻断受体操纵钙离子通道[7]，提高神经细胞的耐缺氧能力。
, 百拇医药
目前一些作者认为能促进神经元存活的神经营养因子除了一些多肽生长因子、神经递质、激素以外，还有一些细胞外基质粘连分子也归属于神经营养因子的范畴，特别是Ln引起人们更多的关注。在神经系统的胚胎发育中，Ln可作为神经细胞迁移和轴突生长的向导[8]，出生后，对损伤的外周神经有促进其再生的作用。脑损伤或脑缺血后，Ln表达明显上调[9] ，起到促进神经元存活和促进损伤修复的作用。这一作用机制尚不清楚。现在已知Ln可以介导或调节NGF等多肽生长因子的神经营养作用，在培养7d鸡胚的交感神经元实验研究中，只有Ln存在时，NGF才能促进神经元的存活[3]。已知细胞外基质Ln与硫酸肝素等蛋白多糖结合，后者作为FGF存贮库，可增强FGF的生物学作用[1]，此外Ln也具有肝素结合位点，可能与细胞外基质蛋白多糖结合间接起到对神经元的营养作用。脑出血后三七总皂甙上调是否通过上述作用机理起神经营养作用?尚不清楚。以往大量文献报道，脑损伤或脑缺血后，主要是在神经变性区域星形胶质细胞内表达Ln。而本研究结果表明，脑出血后Ln主要在神经元之内表达，且主要是对脑损伤比较敏感的区域如皮质、海马等区域。这一结果与近年的一些报道吻合[9]，超微结构证明，Ln主要分布于神经元内质网上。这可能是由于损伤条件、抗体或固定方法不同所致。
, 百拇医药
总之，三七总皂甙可能促进脑出血后脑内神经元及非神经元合成、释放bFGF等神经营养因子，通过这些大分子物质的相互作用，相互影响，加速血肿吸收，调节细胞间液成分，促进血管形成和伤口修复，特别是加强了神经元的营养作用，保护一些神经元免于溃变，最终调动了存活的神经元的功能活动。
本文图1～8见插图第10页
, 百拇医药
图1 脑出血后7d，对照组大脑皮质bFGF阳性反应细胞。×125
图2 脑出血后7d，给药组大脑皮质bFGF阳性反应细胞。×125
图3 脑出血后3d，对照组缰核bFGF阳性反应细胞。×125
图4 脑出血后3d，给药组缰核bFGF阳性反应细胞。×125
图5 脑出血后3d，对照组大脑皮质Ln阳性反应细胞。×300
图6 脑出血后3d，给药组大脑皮质Ln阳性反应细胞。×300
图7 脑出血后7d，对照组海马CA2区bFGF阳性锥体细胞。×400
图8 脑出血后7d，给药组海马CA2区bFGF阳性锥体细胞。×400
, 百拇医药
Fig.1 bFGF-IR cells in control group were observed in cortex in 7 days after intracerebral hemorrhage. ×125
Fig.2 bFGF-IR cells in treatment group were observed in cortex in 7 days after intracerebral hemorrhage.×125
Fig.3 bFGF-IR cells in control group were observed in habenular nucleus in 3 days after intracerebral hemorrhage.×125
Fig.4 bFGF-IR cells in treatment group were observed in habenular nucleus in 3 days after intracerebral hemorrhage.×125
, 百拇医药
Fig.5 Ln-IR cells in control group were observed in cortex in 3 days after intracerebral hemorrhage.×300
Fig.6 Ln-IR cells in treatment group were observed in cortex in 3 days after intracerebral hemorrhage.×300
Fig.7 Ln-IR cells in control group were observed in CA2 of hippocampus in 3 days after intracerebral hemorrhage.×400
Fig.8 Ln-IR cells in treatment group were observed in CA2 of hippocampus in 3 days after intracerebral hemorrhage.×400
, 百拇医药
【作者简介】张俊敏(1965-)，女(汉族)，山西五台人，医学博士，讲师 ，现在中国协和医科大学出版社工作(100730)
参考文献
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[2] Florkiewicz RZ,Shibata F,Barankiewicz T,et al.Basic fibroblast grow th factor gene expressions[J].Ann N Y Acad Sci ,1991,638:109-126.
, http://www.100md.com
[3] 汪浩勇，王会信.成纤维细胞生长因子.见周廷冲主编.多肽生长因子基础与临 床[M].第13章.北京：中国科学技术出版社，1992：209～230.
[4] 张萍，王忠诚.谷氨酸及其受体变化与神经细胞损害[J].国外医学 神经病 学神经外科学分册，1995，22(4)：182～185.
[5] Maiese K,Boniece I,DeMeo D,et al.Peptide growth factors protect aga inst isc hemia in culture by preventing nitric oxide toxicity[J].J Neurosci 1993,13(7): 3034-3040.
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【收稿日期】2000-07-05 【修回日期】2000-08-05, http://www.100md.com
单位：北京中医药大学解剖学教研室，北京100029
关键词：生长因子；脑出血；免疫组织化学；大鼠
解剖学报00zk19
【摘要】目的 研究三七总皂甙对脑出血大鼠脑内碱性成纤维细胞生 长因子(bFGF)、层粘连蛋白(Ln)表达的影响及可能机制。 方法 用免疫 组织化学方法观察胶原酶诱导 的脑出血大鼠脑内bFGF、Ln在给药组和对照组的表达变化。 结果 脑出 血后脑内bFGF主要在扣 带皮质、海马、缰核及其他区域表达，阳性细胞主要有神经元、神经胶质、吞噬细胞、室管 膜细胞、伸长细胞等；Ln不仅在大脑皮质、海马、缰核、下丘脑等区域的神经元表达，且在 这些区域的 神经胶质细胞也表达，血管也有阳性反应。以上活性因子给药组比对照组表达明显增强。 结论 三七总皂甙可通过上调bFGF、Ln的表达促进脑出血后脑内神经元的存活及损伤 修复。
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【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)增-72
STUDY ON EXPRESSION OF GROWTH FACTOR ETC AFTER INTRACEREBRAL HEMORRHAGE AND EFFECT OF PANAX NOTOGINSENG SAPONINS
ZHANG Jun-min，ZHU Pei-chun
(Departmont of Anatomy,Beijing University of Chinese Medicine and Pharm acolocology,Beijing 100029,China)
【Abstract】Objective To study the expression of bFGF ,Ln in brain aft er intracerebral hemorrhage and effect of Panax notoginseng saponins.Met hod Immu nohistochemistry technique has been used to examine the change of expression of bFGF and Ln in rat brain in treatment group and control group after intracerebral hemo rrhage.Result bFGF immunoreactivity was found in neuron and gli al cell in corte x,hippocampus habenular nucleus,and found in macrophage surrounding hematoma; Ln immunoreactivity was found in neurons,glial cells and blood vessles in front a l cortex,hippocampus,thalamus hypothalamus.All of these active moleculars were e nh anced in treatment group against control group.Conclusion The expres sion of bFGF,Ln were increased in frontal brain aftet intracerebral hemorrh age by Panax notoginseng saponins.
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【Key words】Gorwth factor; Intracerebral hemorrhage; Immun ohistochemistry; Rat 三七具有止血、活血、散瘀、消肿止痛等作用。云南植物药厂已成功地从三七中提纯出其活性成分，并研制出针剂——三七总皂甙注射液(血塞通)。临床研究表明，三七总皂甙对脑缺血及脑出血后遗症有确切疗效，尤其对急性期缺血性脑血管疾病疗效显著，但对脑出血急性期的作用尚未见报道，本研究用胶原酶诱发脑出血模型，探讨三七总皂甙对脑出血大鼠脑内大脑皮质、海马、缰核碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、层粘连蛋白(Ln)表达的影响。
材料和方法
1.动物分组与处置
用Wister大鼠73只，体重200～250g，雌雄不拘，用10%水合氯醛腹腔麻醉(400mg/kg体重)，将大鼠固定在SN-2型脑立体定位仪上，切开头部正中皮肤，暴露颅骨，以前囟为原点，向左旁开4mm,后1mm，在颅骨表面钻孔，直径1mm，向下进针5mm，用自动推进器向左侧尾壳核缓注0.4μ1胶原酶(Sigma,type Vll，lunit/μ1),于10min内注完。造模后，将动物分为给药组与对照组，给药组手术后每天腹腔注射三七皂甙针剂0.5ml和0.5ml生理盐水，对组每天腹腔注射生理盐水1ml。各组动物分别于造膜后1、3、7、40d 取材。用水合氯醛麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，快速灌入200ml生理盐水冲洗，后用250ml 0.1mol/L磷酸缓冲液配制的4%多聚甲醛(pH7.2～7.4)快速固定，当动物肢体伸展后减慢灌注速度，约30min内灌注完毕。随后打开颅骨，取出大脑，置于上述固定液中后固定4h以上，入20%蔗糖溶液(用0.1mol/L PBS配置)，4℃保存。切片前脑组织经液氮骤冷，恒冷箱切片(厚30μm)，将配对的对照组和给药组固定在同一载物托上切片，并粘贴在同一张载玻片上。保存于-30℃冰箱备用。
, http://www.100md.com
2.免疫组织化学法
免疫组织化学染色用ABC法：(1)切片入H2O2甲醇液，室温20min;(2)正常羊血清，室温3 0min(3)兔抗bFGF(1：1000，Sigma),兔抗Lminin(1：600，ZYMED公司)4℃过夜；(4)生物素化羊抗兔IgG和ABC 复合物(1：200)(HISTOSTATN-SP药盒，ZYMED公司)，室温40min；(5)0.05%DAB(用0.01mol/L PBS配置)预孵40min;(6)0.01%H2 O2与0.05%DAB呈色，部分切片用硫酸镍胺加强染色。上述各抗血清的稀释及切片漂洗均用0.01mol/L(pH7.4)。在步骤(1)～(4)前后均用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min。阴性对照：(1)省去一抗；(2)用正常羊血清代替一抗。
3.图像分析
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对免疫组织化学染色结果，各组选取3张切片，每张切片选取3个视野，用CMIAS8真彩色病理图像分析系统(中国航空航天大学图像分析中心)进行分析，统计每个视野中阳性反应的面积。
4.统计方法
多组间资料统计采用方差分析，两组间资料统计采用t检验。率的比较用卡方检验。数据用SPSS软件处理。
结 果
1.bGFG免疫组织化学染色
在正常脑组织中，bFGF阳性神经元主要见于海马CA2区锥体神经元和大脑皮质扣带区。非神经细胞主要分布于脉络丛上皮细胞和室管膜细胞。这些细胞均为轻度表达，细胞胞浆染成浅淡棕色。
1.1大脑皮质：脑出血后1d，大脑皮质扣带区、额叶即有bFGF阳性神经元和胶质细胞，神经元胞体较大，胶质细胞呈卵圆形、胞体较小，染色较浅。脑出血后3d和7d反应明显增强，尤以7d反应最为突出，阳性反应细胞密集，着深棕色，大神经元胞浆与大突起均着色(图1，2)。40d反应减弱，阳性神经元稀少，但神经胶质细胞明显增多，反应增强，整个细胞呈深棕色，图像分析与统计学处理，脑出血各时间段阳性细胞的总和即阳性面积给药组比对照组高、具有显著性差异P<0.01(表1)。
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表1 脑出血大鼠不同时间大脑皮质bFGF
阳性表达面积的变化Table 1 Area of basic fibroblast growth factor immunopositivity after intracerebral hemorrhage in cortex of rat (
±s,μm2) 组别(group)对照组(control)
给药组(treatment)
(n=9)
(n=9)
Day1
, 百拇医药
20.35±1.15
28.66±2.05
Day3
23.73±4.47
34.05±4.00
Day7
26.01±2.54
47.61±2.08
Day40
8.85±0.21
24.58±0.72
1.2海马：脑出血后1d，即可见海马内锥体细胞呈bFGF弱阳性，它们在CA1～CA4均有表达，胶质细胞反应有少量分布，呈棕色。脑出血后3d、7d、时反应显著增强，CA2区的阳性锥体细胞反应最强，CA3区次之，CA4更弱，CA1最弱。胞体及大突起均有反应，胞体呈棕色，突起浅棕色。bFGF阳性胶质细胞反应也上调，阳性细胞分布较密集，呈深棕色， 脑出血后40d，海马内阳性神经元少见，但bFGF阳性胶质细胞在海马各层均匀分布、尤以齿状回、门内分布最稠密，且染色较深，整个细胞均呈深棕色。统计学处理和图像分析表明海马内阳性细胞的面积给药组显著高于对照组P<0.05(表2)。表2 脑出血大鼠不同时间海马bFGF表达的
, 百拇医药
阳性面积的变化
Table 2 Area of basic fibroblast growth factor immunopositivity after intracerebral hemorrhage in hippocampus of rat (
±s，μm2) 组别(group)对照组(control)
给药组(tretment)
(n=9)
(n=9)
Day1
39.72±0.16
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90.23±7.04
Day3
65.34±1.34
72.19±9.79
Day7
87.84±2.03
165.4±10.21
Day40
46.31±1.89
123.69±6.05
1.3缰核：缰核在脑出血后1d即有反应，3d有所增强，7d显著增强，40d时与7d反应接近。神经元以3d、7d在缰核区域反应为强(图3，4)。而胶质细胞在40d反应最为突出，统计学处理和图像分析表明各时间段给药组均比对照组阳性反应面积增大(P<0.01)，反应程度也有增强(表3)。表3 脑出血大鼠不同时间缰核bFGF阳性表达面积的变化
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Table 3 Area of basic fibroblast growth factor immunopositivity after introcerebral hemorrhage in habenular nucleus in rat (
±s,μm2) 组别(group)对照组(control)
给药组(treatment)
(n=9)
(n=9)
Day1
133.24±9.51
, 百拇医药 182.53±13.85
Day3
134.49±14.40
323.64±41.82
Day7
160.92±30.72
395.29±17.51
Day40
140.88±15.21
367.36±23.19
2.Ln免疫组织化学染色
, 百拇医药 正常大鼠脑内额叶皮质的Ⅲ、Ⅴ层神经细胞轻度表达Ln,核为阴性，海马Ln阳性反应主要见于CA2区锥体细胞层，胞体有较弱的阳性反应。此外脑内血管基底膜也有阳性反应。脑出血后病灶内可见吞噬细胞表达Ln，也有Ln阳性反应血管，形态各异。
2.1大脑皮质：脑出血后ld，大脑皮质额叶的神经细胞呈Ln阳性，其小的卵圆形或圆形胶质细胞也呈Ln弱阳性。脑出血后3d，阳性反应增强，前额叶、扣带区、杏仁区和各层均有Ln阳性反应神经元与胶质细胞，神经元胞体较大，着色较深，胞浆近膜处阳性颗粒分布、核仁也着色(图5，6)。脑出血后7d、阳性反应显著增强，皮质细胞各层均有Ln阳性反应，阳性神经元胞浆及大突起着色，胶质细胞主要在胞浆有阳性Ln颗粒，核为阴性。脑出血后40d较7d略有减弱。脑出血各时间段的图像分析与统计学处理表明，给药组均比对照组反应增强(P<0.05)，表现为反应面积增大，反应强度即光密度值也升高(表4)。
2.2海马：脑出血后1d，海马阳性神经元见于锥体细胞层，反应强度中等。脑出血后3d，海马反应有所增强，CA1～CA4区阳性细胞数量增多，尤以CA2为突出，细胞排列紧密(图7，8)，胞浆及突起着色，有的整个细胞被染成棕色， 脑出血后7d反应明显增强，而40d时反应略有减弱，图像分析与统计学处理表明，三七总皂甙治疗组Ln阳性反应面积比脑出血后各相应对照明显增大。表4 脑出血大鼠不同时间大脑皮质Ln
, 百拇医药
阳性表达面积的变化
Table 4 Area of laminin immunopositivity in cerebral cortex after intracerebral hemorrhage in rat (
±s，μm2) 组别(group)对照组(control)
给药组(treatment)
(n=9)
(n=9)
Day1
156.67±15.71
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199.26±26.06
Day3
200.27±30.49
275.37±86.57
Day7
218.88±45.21
335.76±40.96
Day40
143.25±33.60
274.59±64.34
讨 论
bFGF免疫组织化学及原位杂交研究表明，机械性脑损伤和化学性脑损伤及脑缺血等均可引起FGF及FGFmRNA的表达上调[1，2]。本研究用胶原酶注入尾壳核引起脑出血后，在前脑内bFGF上调的范围远远大于脑缺血，除了额顶叶皮质、海马外，还见于缰核、丘脑、下丘脑的一些核团的神经元，(关于缰核的bFGF的表达，尚未见报道)。此外非神经元(包括室管膜细胞、伸长细胞、反应性星形胶质细胞)也明显表达。本研究结果证明，三七总皂甙可使皮质、海马、缰核神经元内bFGF明显上调。bFGF和其他神经营养因子一样具有多功能性[3]，在胚胎发育和分化中起重要作用，成年后只有少数脑区有轻度表达，当脑损伤或脑缺血时则明显上调，加速创伤的愈合，三七总皂甙促进bFGF增高可能也是起到对损伤神经元的保护作用。已知脑缺血或脑出血造成神经元损伤有多种机制，如细胞内钙超载，兴奋性氨基酸如谷氨酸的毒性作用[4]，NO、自由基的产生释放、铁离子的增多等等，而脑出血后急性期bFGF在神经元表达正是对神经元内急性损伤的一种拮抗作用，对神经细胞起到保护作用。体外培养研究表明，bFGF可以拮抗谷氨酸的兴奋性毒性作用，抑制NO的释放[5]，阻止细胞的钙离子浓度升高。以往工作也证明三七总皂甙能降低缺氧机体耗氧量，维持缺血脑细胞膜及微血管膜的稳定性[6]，及特异性阻断受体操纵钙离子通道[7]，提高神经细胞的耐缺氧能力。
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目前一些作者认为能促进神经元存活的神经营养因子除了一些多肽生长因子、神经递质、激素以外，还有一些细胞外基质粘连分子也归属于神经营养因子的范畴，特别是Ln引起人们更多的关注。在神经系统的胚胎发育中，Ln可作为神经细胞迁移和轴突生长的向导[8]，出生后，对损伤的外周神经有促进其再生的作用。脑损伤或脑缺血后，Ln表达明显上调[9] ，起到促进神经元存活和促进损伤修复的作用。这一作用机制尚不清楚。现在已知Ln可以介导或调节NGF等多肽生长因子的神经营养作用，在培养7d鸡胚的交感神经元实验研究中，只有Ln存在时，NGF才能促进神经元的存活[3]。已知细胞外基质Ln与硫酸肝素等蛋白多糖结合，后者作为FGF存贮库，可增强FGF的生物学作用[1]，此外Ln也具有肝素结合位点，可能与细胞外基质蛋白多糖结合间接起到对神经元的营养作用。脑出血后三七总皂甙上调是否通过上述作用机理起神经营养作用?尚不清楚。以往大量文献报道，脑损伤或脑缺血后，主要是在神经变性区域星形胶质细胞内表达Ln。而本研究结果表明，脑出血后Ln主要在神经元之内表达，且主要是对脑损伤比较敏感的区域如皮质、海马等区域。这一结果与近年的一些报道吻合[9]，超微结构证明，Ln主要分布于神经元内质网上。这可能是由于损伤条件、抗体或固定方法不同所致。
, 百拇医药
总之，三七总皂甙可能促进脑出血后脑内神经元及非神经元合成、释放bFGF等神经营养因子，通过这些大分子物质的相互作用，相互影响，加速血肿吸收，调节细胞间液成分，促进血管形成和伤口修复，特别是加强了神经元的营养作用，保护一些神经元免于溃变，最终调动了存活的神经元的功能活动。
本文图1～8见插图第10页
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图1 脑出血后7d，对照组大脑皮质bFGF阳性反应细胞。×125
图2 脑出血后7d，给药组大脑皮质bFGF阳性反应细胞。×125
图3 脑出血后3d，对照组缰核bFGF阳性反应细胞。×125
图4 脑出血后3d，给药组缰核bFGF阳性反应细胞。×125
图5 脑出血后3d，对照组大脑皮质Ln阳性反应细胞。×300
图6 脑出血后3d，给药组大脑皮质Ln阳性反应细胞。×300
图7 脑出血后7d，对照组海马CA2区bFGF阳性锥体细胞。×400
图8 脑出血后7d，给药组海马CA2区bFGF阳性锥体细胞。×400
, 百拇医药
Fig.1 bFGF-IR cells in control group were observed in cortex in 7 days after intracerebral hemorrhage. ×125
Fig.2 bFGF-IR cells in treatment group were observed in cortex in 7 days after intracerebral hemorrhage.×125
Fig.3 bFGF-IR cells in control group were observed in habenular nucleus in 3 days after intracerebral hemorrhage.×125
Fig.4 bFGF-IR cells in treatment group were observed in habenular nucleus in 3 days after intracerebral hemorrhage.×125
, 百拇医药
Fig.5 Ln-IR cells in control group were observed in cortex in 3 days after intracerebral hemorrhage.×300
Fig.6 Ln-IR cells in treatment group were observed in cortex in 3 days after intracerebral hemorrhage.×300
Fig.7 Ln-IR cells in control group were observed in CA2 of hippocampus in 3 days after intracerebral hemorrhage.×400
Fig.8 Ln-IR cells in treatment group were observed in CA2 of hippocampus in 3 days after intracerebral hemorrhage.×400
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【作者简介】张俊敏(1965-)，女(汉族)，山西五台人，医学博士，讲师 ，现在中国协和医科大学出版社工作(100730)
参考文献
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【收稿日期】2000-07-05 【修回日期】2000-08-05, http://www.100md.com