阿霉素肾病肾组织中环孢素亲合素基因的表达
作者：夏正坤 高远赋 刘光陵 樊忠民 张连丰 伏洁 傅元凤
单位：南京军区南京总医院儿科，江苏南京 210002
关键词：环孢素亲合素；逆转录聚合酶链反应；儿童；阿霉素肾病
医学研究生学报00zk14摘要： 目的：观察阿霉素肾病组织环孢素亲合素基因的表达。 方法：应用传统的方法首先建立阿霉素肾病模型，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因的表达。 结果：8只SD大鼠经阿霉素注射后，尿蛋白1周后开始上升，2周后明显增加，4周后尿蛋白均>100 mg/24 h； 对照组尿蛋白始终在6 mg/24 h以下。 阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达比对照组明显增高。 结论：说明阿霉素肾病肾组织高水平的环孢素亲合素基因表达是肾组织损伤的原因之一，对CyP 在自身免疫性疾病和器官移植排斥中的研究具有重要的理论与应用价值。
, http://www.100md.com
中图分类号： R692 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)增刊-0035-02
The expression of cyclophilin mRNA in ADR Nephropathy
XIA Zheng-kun,GAO Yuan-fu,LIU Guang-ling,FAN Zhong-min,ZHANG Lian-feng,FU Jie,FU Yuan-feng
(Department of Pediatrics,Jinling Hospital，Nanjing 210002,Jiangsu,China)
Abstract: Objectives: Cyclophilin(CyP) is the receptor of cyclosporin A(CsA).The authors have studied the expression of CyP gene from renal tissue in ADR nephropathy . Methods: We have established ADR nephropathy model, and measured the expression of CyP gene in ADR nephropathy by RT-PCR. Results: We have successfully established ADR nephropathy model.After four weeks,urine protein of ADR nephropathy was more than 100 mg/24 h, and urine protein of the control was less than 6 mg/24 h. The expression of CyP gene from renal tissue in ADR nephropathy was significantly higher than the control. Conclusions: It was one of the reason for renal tissue damage that the findings revealed the high level expression of CyP mRNA in ADR nephropathy, and reflected the grade or progress in ADR nephropathy.
, 百拇医药
Key words: Cyclophilin； RT-PCR； Child； ADR nephropathy
0 引言
环孢素亲合素(cyclophilin，CyP) 是生物界普遍存在的肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl proly cistrans-isomerase,PPIase)家族的主要成员，是免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)的细胞内受体[1]，CyP可参与多种生物学功能。近年来，分子生物学家和临床免疫学家已高度重度其对免疫性疾病与器官移植中的作用。我们对阿霉素肾病组织环孢素亲合素基因表达的研究，具有重要的理论与临床意义。
1 材料与方法
1.1 阿霉素肾病模型的制作 雄性SD大鼠8只，体重180～200 g，经光适应和3次尿蛋白检测合格后(尿蛋白<5 mg/24 h)，给予阿霉素5 mg/kg 尾静脉一次注射，并以同样条件的8只大鼠作为对照组(尾静脉注射相同体积的等渗盐水)，每周测1次尿蛋白，自由饮水和进食。4周后处死，从内眦放血，测血总蛋白(BTP)、白蛋白(Alb)、胆固醇(Ch)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及24 h尿蛋白定量， 留取大鼠肾标本贮存于液氮中待用。
, 百拇医药
1.2 试剂盒 RNA抽提试剂盒(美国GIBCOBRL公司产品)，RT- PCR 试剂盒 ( 英国PROMEGA产品)，PCR Marker(上海华美生物工程公司产品)，引物由大连宝生物工程公司合成。
二条引物序列分别为：
CyP C1 5TCTTCTTGCTGGTCTTGCC，C2 5TCTCCTTTGAGCTGTTTGC；
β-Actin A1 5CTTCCTGGGCATGGAGTC，A2 5GCCGATCCACACGGAGTA。
1.3 组织RNA的抽提 将液氮中冻存的肾组织取出，用组织匀浆器制成匀浆，标本分别加入RNA抽提试剂盒中的处理液， 充分振荡，置 65 ℃下10 min，12 000 g/min离心5 min，取上清液加入无水乙醇混匀，置-20℃下1.5 h，12 000 g/min，离心12 min弃上清，加入冷75%乙醇，12 000 g/min离心5 min弃上清，再用冷75%乙醇重复操作1次，37℃下30 min烘干， 加10 μl DEPC溶解，紫外分光光度计测定RNA浓度，重复测定3次，A 260/A 280为1.8～2.0，置-70℃冰箱待检。
, 百拇医药
1.4 RT-PCR 取3 μl的标本RNA(1 μg左右) ， 依次加入1倍体积反应缓冲液，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L引物(C1+C2，A1+A2)，1 mmol/L MgSO4，0.1 U/μl逆转录酶，0.1 U/μl DNA聚合酶，反应总体积为25 μl，反应条件为48℃下45 min进行1个循环，94℃下2 min进行1个循环，95℃下30 s、53℃下30 s 、72℃下30 s进行30个循环，再72℃下延伸7 min后，4℃下保温。 以上操作于PCR扩增仪中进行(美国PE9600)。
1.5 PCR产物的分析及定量 取标本PCR产物10 μl于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色， 用密度扫描仪扫描获得CyP条带与β-Actin条带各自的峰面积积分值， 计算CyP/β-Actin比值。
2 结果
2.1 阿霉素肾病模型 8只SD大鼠经阿霉素注射，尿蛋白在注射后1周开始上升，2周后明显增加，4周后均>100 mg/24 h；对照组尿蛋白始终在6 mg/24 h以下，二者差异显著(表1)。
, 百拇医药
表1 阿霉素肾病模型尿蛋白的改变
Table 1 The chang of urine protein in ADRN Groups
Urine protein(mg/24 h)
t
P
ADRN
144.75±33.95
11.54
<0.001
Control
5.76±2.67
, 百拇医药
2.2 阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达的水平 测定阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达的水平，结果比对照组明显增高，二者差异显著(表2)。表2 阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达的水平
Table 2 The expression of CyP gene in ADRN Groups
n
CyP/β-Action
t
P
ADRN
8
0.181±0.017
, 百拇医药 3.59
<0.01
Control
8
0.154±0.012
3 讨论
环孢素亲合素广泛分布于生物体内，具有肽基脯氨酰顺反异构酶活性，相对分子质量为18 000的蛋白质，在体内外能结合蛋白质并催化加速它们的折叠、装配和转运，调节细胞的凋亡。核磁共振分析表明，CyP 分子含有三组α螺旋，八组反平行β片层结构，经过X线晶体衍射分析，CyP 整个分子呈球形，半径约为1.7 nm，CyP分子PPIase活性中心为CsA 的结合位点，引起Ca2+内流，从而细胞内Ca2+浓度增高，抑制钙依赖的神经钙蛋白磷酸化酶的活性， 使得激活的T细胞核因子 ( nucler factor of activated T cells)不能去磷酸化， 细胞因子的转录受阻，从而抑制了T细胞的增殖而引起免疫抑制[2]， 对防治器官移植的免疫排斥和自身免疫疾病具有重要意义[3]。
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我们的实验结果证明，8只SD大鼠经阿霉素注射，尿蛋白1周后开始上升，2周后明显增加，3周后达60～100 mg/24 h者4只，≥100 mg/24 h者4只；4周后尿蛋白均>100 mg/24 h，均值为(144.75±33.95)mg/24 h。对照组尿蛋白始终在6 mg/24 h以下， 均值为(5.76±2.67) mg/24 h。在制作ADR肾病模型时，所使用的ADR 的剂量(5 mg/kg)及实验结果与Bertaini T所报告的一致[4]。 本研究通过逆转录聚合酶链反应的方法，测定阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达的水平，结果表明阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达比对照组明显增高。说明阿霉素肾病肾组织高水平的环孢素亲合素基因表达是肾组织损伤的原因之一，对CyP 在自身免疫性疾病和器官移植排斥中的研究具有重要的理论与应用价值。
基金项目： 解放军“九五”医学科研规划第二批科研基金资助项目(98M027)
作者简介： 夏正坤(1963-)，男，江苏建湖人，主治医师，医学硕士，从事儿科肾脏病专业。
, 百拇医药
参考文献：
[1] Freskgard PO, Bergenhem N, Jonsson BM,et al.Isomerase and chaperone activity of prolyl isomerase in the folding of carbonic anhydrase[J].Science，1992,258:466-468.
[2] Shaw KT,Ho AM, Raghavan A,et al. Immunosuppressive drugs prevent a rapid dephosphorylation of transcription factor NFAT1 in stimulated immune cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995,92(24):11205.
[3] Schneider H,Charara N,Schmitz R,et al.Human cyclophilin C: primary structure, tissue distribution, and determination of binding specificity for cyclosporins[J].Biochemistry，1994, 33(27):8218-8224.
[4] Bertani T，Rocchi G,Biolsci D,et al. Molecular cloning: Adramycin-induced glomerulosclerosis in the rat[J].Am J Kid Dis，1986,7(1): 12-19.
收稿日期：2000-02-04, http://www.100md.com
单位：南京军区南京总医院儿科，江苏南京 210002
关键词：环孢素亲合素；逆转录聚合酶链反应；儿童；阿霉素肾病
医学研究生学报00zk14摘要： 目的：观察阿霉素肾病组织环孢素亲合素基因的表达。 方法：应用传统的方法首先建立阿霉素肾病模型，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因的表达。 结果：8只SD大鼠经阿霉素注射后，尿蛋白1周后开始上升，2周后明显增加，4周后尿蛋白均>100 mg/24 h； 对照组尿蛋白始终在6 mg/24 h以下。 阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达比对照组明显增高。 结论：说明阿霉素肾病肾组织高水平的环孢素亲合素基因表达是肾组织损伤的原因之一，对CyP 在自身免疫性疾病和器官移植排斥中的研究具有重要的理论与应用价值。
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中图分类号： R692 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)增刊-0035-02
The expression of cyclophilin mRNA in ADR Nephropathy
XIA Zheng-kun,GAO Yuan-fu,LIU Guang-ling,FAN Zhong-min,ZHANG Lian-feng,FU Jie,FU Yuan-feng
(Department of Pediatrics,Jinling Hospital，Nanjing 210002,Jiangsu,China)
Abstract: Objectives: Cyclophilin(CyP) is the receptor of cyclosporin A(CsA).The authors have studied the expression of CyP gene from renal tissue in ADR nephropathy . Methods: We have established ADR nephropathy model, and measured the expression of CyP gene in ADR nephropathy by RT-PCR. Results: We have successfully established ADR nephropathy model.After four weeks,urine protein of ADR nephropathy was more than 100 mg/24 h, and urine protein of the control was less than 6 mg/24 h. The expression of CyP gene from renal tissue in ADR nephropathy was significantly higher than the control. Conclusions: It was one of the reason for renal tissue damage that the findings revealed the high level expression of CyP mRNA in ADR nephropathy, and reflected the grade or progress in ADR nephropathy.
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Key words: Cyclophilin； RT-PCR； Child； ADR nephropathy
0 引言
环孢素亲合素(cyclophilin，CyP) 是生物界普遍存在的肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl proly cistrans-isomerase,PPIase)家族的主要成员，是免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)的细胞内受体[1]，CyP可参与多种生物学功能。近年来，分子生物学家和临床免疫学家已高度重度其对免疫性疾病与器官移植中的作用。我们对阿霉素肾病组织环孢素亲合素基因表达的研究，具有重要的理论与临床意义。
1 材料与方法
1.1 阿霉素肾病模型的制作 雄性SD大鼠8只，体重180～200 g，经光适应和3次尿蛋白检测合格后(尿蛋白<5 mg/24 h)，给予阿霉素5 mg/kg 尾静脉一次注射，并以同样条件的8只大鼠作为对照组(尾静脉注射相同体积的等渗盐水)，每周测1次尿蛋白，自由饮水和进食。4周后处死，从内眦放血，测血总蛋白(BTP)、白蛋白(Alb)、胆固醇(Ch)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及24 h尿蛋白定量， 留取大鼠肾标本贮存于液氮中待用。
, 百拇医药
1.2 试剂盒 RNA抽提试剂盒(美国GIBCOBRL公司产品)，RT- PCR 试剂盒 ( 英国PROMEGA产品)，PCR Marker(上海华美生物工程公司产品)，引物由大连宝生物工程公司合成。
二条引物序列分别为：
CyP C1 5TCTTCTTGCTGGTCTTGCC，C2 5TCTCCTTTGAGCTGTTTGC；
β-Actin A1 5CTTCCTGGGCATGGAGTC，A2 5GCCGATCCACACGGAGTA。
1.3 组织RNA的抽提 将液氮中冻存的肾组织取出，用组织匀浆器制成匀浆，标本分别加入RNA抽提试剂盒中的处理液， 充分振荡，置 65 ℃下10 min，12 000 g/min离心5 min，取上清液加入无水乙醇混匀，置-20℃下1.5 h，12 000 g/min，离心12 min弃上清，加入冷75%乙醇，12 000 g/min离心5 min弃上清，再用冷75%乙醇重复操作1次，37℃下30 min烘干， 加10 μl DEPC溶解，紫外分光光度计测定RNA浓度，重复测定3次，A 260/A 280为1.8～2.0，置-70℃冰箱待检。
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1.4 RT-PCR 取3 μl的标本RNA(1 μg左右) ， 依次加入1倍体积反应缓冲液，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L引物(C1+C2，A1+A2)，1 mmol/L MgSO4，0.1 U/μl逆转录酶，0.1 U/μl DNA聚合酶，反应总体积为25 μl，反应条件为48℃下45 min进行1个循环，94℃下2 min进行1个循环，95℃下30 s、53℃下30 s 、72℃下30 s进行30个循环，再72℃下延伸7 min后，4℃下保温。 以上操作于PCR扩增仪中进行(美国PE9600)。
1.5 PCR产物的分析及定量 取标本PCR产物10 μl于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色， 用密度扫描仪扫描获得CyP条带与β-Actin条带各自的峰面积积分值， 计算CyP/β-Actin比值。
2 结果
2.1 阿霉素肾病模型 8只SD大鼠经阿霉素注射，尿蛋白在注射后1周开始上升，2周后明显增加，4周后均>100 mg/24 h；对照组尿蛋白始终在6 mg/24 h以下，二者差异显著(表1)。
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表1 阿霉素肾病模型尿蛋白的改变
Table 1 The chang of urine protein in ADRN Groups
Urine protein(mg/24 h)
t
P
ADRN
144.75±33.95
11.54
<0.001
Control
5.76±2.67
, 百拇医药
2.2 阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达的水平 测定阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达的水平，结果比对照组明显增高，二者差异显著(表2)。表2 阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达的水平
Table 2 The expression of CyP gene in ADRN Groups
n
CyP/β-Action
t
P
ADRN
8
0.181±0.017
, 百拇医药 3.59
<0.01
Control
8
0.154±0.012
3 讨论
环孢素亲合素广泛分布于生物体内，具有肽基脯氨酰顺反异构酶活性，相对分子质量为18 000的蛋白质，在体内外能结合蛋白质并催化加速它们的折叠、装配和转运，调节细胞的凋亡。核磁共振分析表明，CyP 分子含有三组α螺旋，八组反平行β片层结构，经过X线晶体衍射分析，CyP 整个分子呈球形，半径约为1.7 nm，CyP分子PPIase活性中心为CsA 的结合位点，引起Ca2+内流，从而细胞内Ca2+浓度增高，抑制钙依赖的神经钙蛋白磷酸化酶的活性， 使得激活的T细胞核因子 ( nucler factor of activated T cells)不能去磷酸化， 细胞因子的转录受阻，从而抑制了T细胞的增殖而引起免疫抑制[2]， 对防治器官移植的免疫排斥和自身免疫疾病具有重要意义[3]。
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我们的实验结果证明，8只SD大鼠经阿霉素注射，尿蛋白1周后开始上升，2周后明显增加，3周后达60～100 mg/24 h者4只，≥100 mg/24 h者4只；4周后尿蛋白均>100 mg/24 h，均值为(144.75±33.95)mg/24 h。对照组尿蛋白始终在6 mg/24 h以下， 均值为(5.76±2.67) mg/24 h。在制作ADR肾病模型时，所使用的ADR 的剂量(5 mg/kg)及实验结果与Bertaini T所报告的一致[4]。 本研究通过逆转录聚合酶链反应的方法，测定阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达的水平，结果表明阿霉素肾病肾组织环孢素亲合素基因表达比对照组明显增高。说明阿霉素肾病肾组织高水平的环孢素亲合素基因表达是肾组织损伤的原因之一，对CyP 在自身免疫性疾病和器官移植排斥中的研究具有重要的理论与应用价值。
基金项目： 解放军“九五”医学科研规划第二批科研基金资助项目(98M027)
作者简介： 夏正坤(1963-)，男，江苏建湖人，主治医师，医学硕士，从事儿科肾脏病专业。
, 百拇医药
参考文献：
[1] Freskgard PO, Bergenhem N, Jonsson BM,et al.Isomerase and chaperone activity of prolyl isomerase in the folding of carbonic anhydrase[J].Science，1992,258:466-468.
[2] Shaw KT,Ho AM, Raghavan A,et al. Immunosuppressive drugs prevent a rapid dephosphorylation of transcription factor NFAT1 in stimulated immune cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995,92(24):11205.
[3] Schneider H,Charara N,Schmitz R,et al.Human cyclophilin C: primary structure, tissue distribution, and determination of binding specificity for cyclosporins[J].Biochemistry，1994, 33(27):8218-8224.
[4] Bertani T，Rocchi G,Biolsci D,et al. Molecular cloning: Adramycin-induced glomerulosclerosis in the rat[J].Am J Kid Dis，1986,7(1): 12-19.
收稿日期：2000-02-04, http://www.100md.com