海人酸诱导癫痫大鼠齿状回分子层突触可塑性变化的定量研究
作者：隋鸿锦 宫瑾 于胜波 伊焕发 李冬冬 张万琴
单位：隋鸿锦 宫瑾 于胜波 伊焕发(大连医科大学解剖学教研室)；李冬冬 张万琴(生理学教研室，大连 116027)
关键词：海人酸；癫痫；可塑性；突触；齿状回
解剖学报00zk32
【摘要】目的 研究海人酸(KA)诱发癫痫后颗粒细胞轴突和树突 发 芽是否会引起齿状回内突触可塑性变化。方法 电镜下对海马齿状 回分子 层内突触的密度和突触连接面的弯曲形式等参数进行定量研究。结果 1.KA注射后3d，大鼠DG分子层内的突触数目明显减少；而KA注射后7d，突触数目恢复到 与对照组相似的状态。2.与对照组及KA注射后3d组相比，KA注射后7d大鼠DG分子层内的突 触中，笑型突触所占突触总数的比例显著减少，愁型突触所占突触总数的比例显著增加。
, 百拇医药
结论 1.KA注射后7d时DG内颗粒细胞苔状纤维及树突发芽是功能性 的 。2.推测KA注射后7d时DG内愁型突触增加的原因与发芽的苔状纤维释放谷氨酸增多有关。
【中图分类号】R742.102 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-121
A QUANTITATIVE STUDY ON THE SYNAPTIC PLASTICITY IN THE MOLECULAR LAYER OF DENTATE GYRUS OF KAINATE RAT
SUI Hong-jin,GONG Jin,YU Sheng-bo,YI Huan-fa
(Department of Anatomy,)
LI Dong-dong,ZHANG Wan-qin
, 百拇医药
(Department of Physiology, Dalian Medical Un iversity,Dalian 116027,China)
【Abstract】Objective In order to investigate the synaptic p lasticity in dentate gyrus after seizures and axonal and dendrtic sprouting indu ced by KA administration.Methods The density of synapses,the c urvature forms of synaptic interface were studied under electron microscope.[ WT 5”HZ Results 1.The density of the synapse is decreased obviously 3 d ays af ter KA injection,while the density of synapses is increased to control level 7 d a ys after KA injection. 2.Compare with the curvation forms of synaptic interfac e of control animals and 3days after KA administration animals,the amount of smi le synapses is significantly decresed and the amount of frown synapses is signif icantly increased in the moleculous layer of d entate gyrus 7 days after KA injection.Conclusions 1.This re sult demonstrates that the axonal and dendritic sprouting of dentate granule cells is functional.2.The increase of frown synapse is related to the release of glutamate of sprouting mossy fibers.
, http://www.100md.com
【Key words】Kainic acid; Epilepsy; Plasticity; Synapse; Dent ate gyrus 近年来，人们很重视突触连接面本身的可塑性与多样性。突触连接面有弯曲型和平直型两种，其中多数为弯曲型。根据其形态，人们将弯曲型突触形象化的分为笑型突触(smile synapse)和愁型突触(frown synapse)两种类型。突触连接面是突触结构可塑性的一个重要参数。
脑内或全身性给予惊厥剂量的海人酸(kainic acid,KA)，可选择性的激活边缘系统，引起急性癫痫发作。KA模型的特点是具有与颞叶癫痫相似的行为特征和海马硬化等神经病理学改变。同时，动物对其后癫痫刺激的敏感性长期增强。许多证据表明，癫痫患者颞叶海马结构的典型病理表现包括齿状回门区的神经元缺失以及颗粒细胞轴突的重建，即苔状纤维发芽[1，2]。有人认为[2]，癫痫大鼠海马结构内病理性突触环路的建立使兴奋与抑制失去平衡而引起癫痫发作。但目前对于KA诱发癫痫以及颗粒细胞轴突和树突的异常发芽是否会引起齿状回内突触可塑性的变化尚不明确。因此，我们在电镜下对KA诱发癫痫后海马齿状回分子层内突触的密度、突触连接面的弯曲形式等突触可塑性的参数进行了研究。
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材料和方法
雄性SD大鼠12只，体重180～250g,分为实验组(n=8)和对照组(n=4)。实验组颈部皮下注射KA(10mg/kg体重；5g/L)，对照组注射生理盐水(2ml/kg体重)。根据 Racine 所描述的癫痫行为标准，观察实验组动物全部达到4级或5级后，即认为实验组动物已符合癫痫模型的要求。动物均分别在相应处理后3、7d后以水合氯醛(400mg/kg)麻醉。经心脏生理盐水冲洗，再用含2%多聚甲醛-1.25%戊二醛的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液灌流固定，取脑。振动切取50μm厚脑片。2%锇酸(pH7.4)后固定1h，常规Epon 812平板定位包埋。光镜下选取齿状回分子层的组织，将其粘在预制的空白包埋块上，超薄切片，铀铅双染，透射电镜观察并摄片。
每只动物随机选取2个包埋块制作超薄切片，每个包埋块捞取2张铜网，选用反差良好的一个铜网在电镜下观察。在放大10 000倍条件下，每张铜网选取 1 个网眼，随机在其上下左右4个角度各摄片 1 张，放大至20 000倍以进行形态计量分析。
, http://www.100md.com
定量数据是从电镜照片中获得，各组摄片张数相同，均为32张，每张照片观察的面积为42μm2。计数每组每张照片上突触的总数、每组动物笑型、愁型或平坦型突触的数目及其所占突触总数的比例。突触密度(个/42μm2)的组间对比采用方差分析Q检验，其余参数的组间对比采用行列表的χ2检验。
结果和讨论
电镜下，在对照组及实验组海马齿状回分子层的神经毡内，均可见较多的突触存在。各组大鼠齿状回分子层内的突触连接面可分为笑型(即突触前成分伸向突触后成分，为负向弯曲)、愁型(即突触后成分伸向突触前成分，为正向弯曲)和平坦型。
对照组及KA注射3d组和KA注射7d组大鼠海马齿状回分子层内突触的密度、突触连接面的弯曲形式等参数测量结果分别列入表1，2。
表1 大鼠DG分子层内突触密度的计数(个/42μm2)
, 百拇医药
Table 1 Enumeration of the synaptic densities in the moleculous layet of dentate gyrus in rat
对照组(NS)
(KA3d
KA7d
±s
5.43±0.56
3.04±0.31*
5.54±0.45
*P<0.05表2 大鼠DG分子层内突触连接面分型的计数
, 百拇医药
Table 2 Enumeration of the curvature forms injection 7d of synaptic interface in the moleculous layer of dentate gyrus in rat
对照组(NS)
KA3d
KA7d
笑型突触
48 (32.87%)
37 (30.33%)
25 (15.82%)*
smile synapse
, http://www.100md.com
愁型突触
27 (18.49%)
19 (15.57%)
43 (27.22%)*
frown synapse
平坦型突触
71 (48.63%)
66 (54.10%)
90 (56.96%)
flat synapse
合计(total)
, 百拇医药
146
122
158
*P<0.01
在以往的研究中，我们已经证明在KA注射后7d时，腹侧海马齿状回内不仅出现异常的苔状纤维发芽，即轴突增生，同时还存在颗粒细胞树突及树突棘的增生[3]。从表1中可以看出，在KA注射后3d，大鼠DG分子层内的突触数目明显减少；而在KA后7d，突触数目恢复到与对照组相似的状态。这一发现与本课题组以往关于树突发芽的研究结果相一致，进一步证明KA注射7d时DG内颗粒细胞苔状纤维及树突发芽是具有功能性的，可以形成突触而发挥功能。我们推测KA注射后3d海马DG内树突的减少很可能与癫痫发作后海马结构内海马门部位中间神经元以及CA1、CA3锥体细胞的广泛性损伤同步。我们以往的工作表明，1次皮下注射惊厥剂量的KA不仅诱发动物出现急性癫痫发作，而且其后7d，该动物出现癫痫发作敏感性的长期增强，它是日后癫痫长期反复发作的原因。我们认为，本研究结果为这一理论提供了突触学的证据。
, 百拇医药
突触连接面的曲率是突触可塑性的一项重要参数。有人推测，刺激轴突引起突触小泡释放递质可以使突触前膜增加，从而使突触前终扣由圆形转变为月牙形[4]。从表2中可以看出，与对照组及KA注射后3d组相比，KA后7d大鼠DG分子层内的突触中，笑型突触所占突触总数的比例显著减少，而愁型突触所占突触总数的比例则显著增加。现已证明，苔状纤维含有并释放谷氨酸[5]。我们的研究也发现(待发表资料)，KA7d时腹侧海马DG内出现谷氨酸能免疫活性物质的异常增加。因此我们推测，KA后7d时DG内愁突触增加的原因与发芽的苔状纤维释放谷氨酸增多有关，这很可能是KA 7d时癫痫发作敏感性增强的又一突触学基础。
【作者简介】隋鸿锦(1965-)，男(汉族)，辽宁省大连市人，医学博士， 副教授，硕士导师
参考文献
[1]隋鸿锦，张万琴，洪昭雄.海人酸诱导癫痫模型海马的形 态学改变[J].解剖科学进展，1997，3(2)：103～108.
, 百拇医药
[2]Buckmaster PS.Dudex FE.Network properties of the dentate g yrus in epileptic rats with hilar neuron loss and granular cell axon reorganization[J] .J Neurophysiol,1997,77(4):2685-2696.
[3]隋鸿锦，宫瑾，李冬冬，等.短暂癫痫发作诱发海马齿状回颗粒细胞 树突发芽[J].解剖学杂志，1999，22(5)：448～452.
[4]Wiley RG,Spencer C,Pysh JJ.Time course and frequency depend ence of synaptic vesicle depletion and recovery in electrically stimulated sympathetic ganglia[J].J Neurocytol,1987,16(3):359-372.
[5]Ben-Ari Y,Represa A.Brief seizure episodes induce long-t erm potent iation and mossy fibre sprouting in the hippocampus [J].Trends in Neuroscience s,1990,13(8):312-318.
【收稿日期】2000-06-15 【修回日期】2000-08-15, http://www.100md.com
单位：隋鸿锦 宫瑾 于胜波 伊焕发(大连医科大学解剖学教研室)；李冬冬 张万琴(生理学教研室，大连 116027)
关键词：海人酸；癫痫；可塑性；突触；齿状回
解剖学报00zk32
【摘要】目的 研究海人酸(KA)诱发癫痫后颗粒细胞轴突和树突 发 芽是否会引起齿状回内突触可塑性变化。方法 电镜下对海马齿状 回分子 层内突触的密度和突触连接面的弯曲形式等参数进行定量研究。结果 1.KA注射后3d，大鼠DG分子层内的突触数目明显减少；而KA注射后7d，突触数目恢复到 与对照组相似的状态。2.与对照组及KA注射后3d组相比，KA注射后7d大鼠DG分子层内的突 触中，笑型突触所占突触总数的比例显著减少，愁型突触所占突触总数的比例显著增加。
, 百拇医药
结论 1.KA注射后7d时DG内颗粒细胞苔状纤维及树突发芽是功能性 的 。2.推测KA注射后7d时DG内愁型突触增加的原因与发芽的苔状纤维释放谷氨酸增多有关。
【中图分类号】R742.102 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-121
A QUANTITATIVE STUDY ON THE SYNAPTIC PLASTICITY IN THE MOLECULAR LAYER OF DENTATE GYRUS OF KAINATE RAT
SUI Hong-jin,GONG Jin,YU Sheng-bo,YI Huan-fa
(Department of Anatomy,)
LI Dong-dong,ZHANG Wan-qin
, 百拇医药
(Department of Physiology, Dalian Medical Un iversity,Dalian 116027,China)
【Abstract】Objective In order to investigate the synaptic p lasticity in dentate gyrus after seizures and axonal and dendrtic sprouting indu ced by KA administration.Methods The density of synapses,the c urvature forms of synaptic interface were studied under electron microscope.[ WT 5”HZ Results 1.The density of the synapse is decreased obviously 3 d ays af ter KA injection,while the density of synapses is increased to control level 7 d a ys after KA injection. 2.Compare with the curvation forms of synaptic interfac e of control animals and 3days after KA administration animals,the amount of smi le synapses is significantly decresed and the amount of frown synapses is signif icantly increased in the moleculous layer of d entate gyrus 7 days after KA injection.Conclusions 1.This re sult demonstrates that the axonal and dendritic sprouting of dentate granule cells is functional.2.The increase of frown synapse is related to the release of glutamate of sprouting mossy fibers.
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【Key words】Kainic acid; Epilepsy; Plasticity; Synapse; Dent ate gyrus 近年来，人们很重视突触连接面本身的可塑性与多样性。突触连接面有弯曲型和平直型两种，其中多数为弯曲型。根据其形态，人们将弯曲型突触形象化的分为笑型突触(smile synapse)和愁型突触(frown synapse)两种类型。突触连接面是突触结构可塑性的一个重要参数。
脑内或全身性给予惊厥剂量的海人酸(kainic acid,KA)，可选择性的激活边缘系统，引起急性癫痫发作。KA模型的特点是具有与颞叶癫痫相似的行为特征和海马硬化等神经病理学改变。同时，动物对其后癫痫刺激的敏感性长期增强。许多证据表明，癫痫患者颞叶海马结构的典型病理表现包括齿状回门区的神经元缺失以及颗粒细胞轴突的重建，即苔状纤维发芽[1，2]。有人认为[2]，癫痫大鼠海马结构内病理性突触环路的建立使兴奋与抑制失去平衡而引起癫痫发作。但目前对于KA诱发癫痫以及颗粒细胞轴突和树突的异常发芽是否会引起齿状回内突触可塑性的变化尚不明确。因此，我们在电镜下对KA诱发癫痫后海马齿状回分子层内突触的密度、突触连接面的弯曲形式等突触可塑性的参数进行了研究。
, http://www.100md.com
材料和方法
雄性SD大鼠12只，体重180～250g,分为实验组(n=8)和对照组(n=4)。实验组颈部皮下注射KA(10mg/kg体重；5g/L)，对照组注射生理盐水(2ml/kg体重)。根据 Racine 所描述的癫痫行为标准，观察实验组动物全部达到4级或5级后，即认为实验组动物已符合癫痫模型的要求。动物均分别在相应处理后3、7d后以水合氯醛(400mg/kg)麻醉。经心脏生理盐水冲洗，再用含2%多聚甲醛-1.25%戊二醛的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液灌流固定，取脑。振动切取50μm厚脑片。2%锇酸(pH7.4)后固定1h，常规Epon 812平板定位包埋。光镜下选取齿状回分子层的组织，将其粘在预制的空白包埋块上，超薄切片，铀铅双染，透射电镜观察并摄片。
每只动物随机选取2个包埋块制作超薄切片，每个包埋块捞取2张铜网，选用反差良好的一个铜网在电镜下观察。在放大10 000倍条件下，每张铜网选取 1 个网眼，随机在其上下左右4个角度各摄片 1 张，放大至20 000倍以进行形态计量分析。
, http://www.100md.com
定量数据是从电镜照片中获得，各组摄片张数相同，均为32张，每张照片观察的面积为42μm2。计数每组每张照片上突触的总数、每组动物笑型、愁型或平坦型突触的数目及其所占突触总数的比例。突触密度(个/42μm2)的组间对比采用方差分析Q检验，其余参数的组间对比采用行列表的χ2检验。
结果和讨论
电镜下，在对照组及实验组海马齿状回分子层的神经毡内，均可见较多的突触存在。各组大鼠齿状回分子层内的突触连接面可分为笑型(即突触前成分伸向突触后成分，为负向弯曲)、愁型(即突触后成分伸向突触前成分，为正向弯曲)和平坦型。
对照组及KA注射3d组和KA注射7d组大鼠海马齿状回分子层内突触的密度、突触连接面的弯曲形式等参数测量结果分别列入表1，2。
表1 大鼠DG分子层内突触密度的计数(个/42μm2)
, 百拇医药
Table 1 Enumeration of the synaptic densities in the moleculous layet of dentate gyrus in rat
对照组(NS)
(KA3d
KA7d
±s
5.43±0.56
3.04±0.31*
5.54±0.45
*P<0.05表2 大鼠DG分子层内突触连接面分型的计数
, 百拇医药
Table 2 Enumeration of the curvature forms injection 7d of synaptic interface in the moleculous layer of dentate gyrus in rat
对照组(NS)
KA3d
KA7d
笑型突触
48 (32.87%)
37 (30.33%)
25 (15.82%)*
smile synapse
, http://www.100md.com
愁型突触
27 (18.49%)
19 (15.57%)
43 (27.22%)*
frown synapse
平坦型突触
71 (48.63%)
66 (54.10%)
90 (56.96%)
flat synapse
合计(total)
, 百拇医药
146
122
158
*P<0.01
在以往的研究中，我们已经证明在KA注射后7d时，腹侧海马齿状回内不仅出现异常的苔状纤维发芽，即轴突增生，同时还存在颗粒细胞树突及树突棘的增生[3]。从表1中可以看出，在KA注射后3d，大鼠DG分子层内的突触数目明显减少；而在KA后7d，突触数目恢复到与对照组相似的状态。这一发现与本课题组以往关于树突发芽的研究结果相一致，进一步证明KA注射7d时DG内颗粒细胞苔状纤维及树突发芽是具有功能性的，可以形成突触而发挥功能。我们推测KA注射后3d海马DG内树突的减少很可能与癫痫发作后海马结构内海马门部位中间神经元以及CA1、CA3锥体细胞的广泛性损伤同步。我们以往的工作表明，1次皮下注射惊厥剂量的KA不仅诱发动物出现急性癫痫发作，而且其后7d，该动物出现癫痫发作敏感性的长期增强，它是日后癫痫长期反复发作的原因。我们认为，本研究结果为这一理论提供了突触学的证据。
, 百拇医药
突触连接面的曲率是突触可塑性的一项重要参数。有人推测，刺激轴突引起突触小泡释放递质可以使突触前膜增加，从而使突触前终扣由圆形转变为月牙形[4]。从表2中可以看出，与对照组及KA注射后3d组相比，KA后7d大鼠DG分子层内的突触中，笑型突触所占突触总数的比例显著减少，而愁型突触所占突触总数的比例则显著增加。现已证明，苔状纤维含有并释放谷氨酸[5]。我们的研究也发现(待发表资料)，KA7d时腹侧海马DG内出现谷氨酸能免疫活性物质的异常增加。因此我们推测，KA后7d时DG内愁突触增加的原因与发芽的苔状纤维释放谷氨酸增多有关，这很可能是KA 7d时癫痫发作敏感性增强的又一突触学基础。
【作者简介】隋鸿锦(1965-)，男(汉族)，辽宁省大连市人，医学博士， 副教授，硕士导师
参考文献
[1]隋鸿锦，张万琴，洪昭雄.海人酸诱导癫痫模型海马的形 态学改变[J].解剖科学进展，1997，3(2)：103～108.
, 百拇医药
[2]Buckmaster PS.Dudex FE.Network properties of the dentate g yrus in epileptic rats with hilar neuron loss and granular cell axon reorganization[J] .J Neurophysiol,1997,77(4):2685-2696.
[3]隋鸿锦，宫瑾，李冬冬，等.短暂癫痫发作诱发海马齿状回颗粒细胞 树突发芽[J].解剖学杂志，1999，22(5)：448～452.
[4]Wiley RG,Spencer C,Pysh JJ.Time course and frequency depend ence of synaptic vesicle depletion and recovery in electrically stimulated sympathetic ganglia[J].J Neurocytol,1987,16(3):359-372.
[5]Ben-Ari Y,Represa A.Brief seizure episodes induce long-t erm potent iation and mossy fibre sprouting in the hippocampus [J].Trends in Neuroscience s,1990,13(8):312-318.
【收稿日期】2000-06-15 【修回日期】2000-08-15, http://www.100md.com