肿瘤患者外周血淋巴细胞rDNA转录活性分析
作者：王俊杰 扬建良 申文江 王燕华 付健
单位：北京医科大学第三医院肿瘤治疗中心(北京，100034)
关键词：肿瘤；rDNA；嗜银蛋白；预后
癌症99zk41
中图号：R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)s0-0103-01
核仁组成区(NOR)是指rDNA周围具有生物活性的非组蛋白，其功能是指导核仁合成和组装rDNA，其相关蛋白(AgNORsAP)可通过银染方法显示〔1〕。AgNORs的相对含量反映了rDNA转录活性和蛋白质合成的活跃状态〔2，3，4〕，有研究报道在肿瘤良、恶性鉴别及肿瘤恶性程度上具有诊断价值，而关于肿瘤患者外周血淋巴细胞rDNA转录活性能否作为肿瘤预后和转归监测指标国内外尚未见报道。
, 百拇医药
1材料和方法
1.1研究对象
健康人19例，患者220例为1997年9月～1998年4月收治并经病理证实的病例。临床资料祥见表1。
1.2试剂和仪器
1.2.1试剂：外周血细胞rDNA培养试剂盒由北京中北博康生物技术研究所提供。银染液A液为50%AgNO3水溶液，B液为3%甲酸+2%明胶。低渗液0.07mol/LNaCI。
1.2.2仪器：rDNA转录活性分析系统(中国科学院大恒集团北京大恒图象视觉有限公司提供)。
1.3方法
1.3.1培养：静脉血0.5ml，rDNA培养瓶中培养，37℃72小时。
, 百拇医药
1.3.2分离：(1)吸管混匀，离心2000r/min，10min；(2)弃上清液，加低渗液5ml，离心2000r/min；(3)弃上清液，加入固定液5ml，离心；(4)重复(3)；(5)弃上清液，滴在冰冻的载玻片上2～3滴，室温干燥。
1.3.3银染：A液和B液染色，90℃水浴箱中加热，涂片深黄色时取出，水冲洗，自然干燥。
1.3.4图象分析：rDNA图象分析系统分析。
Ⅰ.S=核仁积分面积/细胞核积分面积×100%
Ⅰ.O.D=核仁银染积分光密度/细胞核银染积分光密度×100%
数学模式分别为：
, 百拇医药
式中m：每组制片数；n：每张制片上被观察的细胞数；a：每个细胞中银染核仁积分总面积；b：每个细胞核的积分面积；c：每个细胞中银染核仁的Ⅰ.O.D值；d：每个细胞核的Ⅰ.O.D值。每张涂片计数10个细胞，结果为计数细胞的平均值。
1.4统计学处理：t检验。
2结果
19例健康人和220例肿瘤患者的分析结果，见表1。
表1 肿瘤患者rDNA转录活性分析(
±s)
项目
例数
I.S(%)
, 百拇医药
I.O.D(%)
正常人
19
7.78±1.40
6.41±0.99
头颈部癌术后
3
5.13±1.32
4.15±1.08
头颈部癌
10
4.73±1.14
, 百拇医药 3.90±0.90*
转移或复发
5
4.80±1.46
3.94±1.15*
肺癌术后
3
5.52±0.48
4.58±0.62
肺癌
7
4.45±0.99
351±0.69*
, 百拇医药
转移或复发
12
4.23±1.77
3.67±0.60*
食道癌术后
13
5.17±1.85
4.31±1.22
食道癌
8
4.31±0.84
3.65±0.72*
, 百拇医药
转移或复发
8
4.16±1.35
3.54±1.15*
乳腺癌术后
33
5.69±1.26
4.73±1.11*
转移或复发
14
4.65±1.58
3.82±1.24**
, 百拇医药
淋巴瘤和白血病
20
4.32±0.83
3.56±0.66
脑瘤(Ⅰ、Ⅱ)术后
3
5.79±0.96
4.85±0.83*
术后残留
3
3.68±0.65
3.01±0.34*
, 百拇医药
肝癌
4
3.17±0.85
2.84±0.81*
直肠癌术后
3
5.19±0.91
4.38±0.66*
转移或复发
14
4.11±0.56
3.37±0.31**
, http://www.100md.com
泌尿系癌术后
9
5.21±0.81
4.41±0.84*
转移或复发
3
3.32±0.65
2.85±0.60**
其它癌术后
21
5.47±1.87
4.62±1.52*
, 百拇医药
其它癌
9
4.46±1.12
3.89±1.02
转移或复发
15
3.98±1.08
3.30±0.93*
(
±s).*P<0.01；**P<0.05
由表1可见肿瘤患者的Ⅰ.S%和Ⅰ.O.D比值均明显低于正常人(P<0.01)，食道癌、乳腺癌、直肠癌和泌尿系统肿瘤转移或复发后Ⅰ.S%和Ⅰ.O.D比值进一步下降，统计学处理品差别显著(P<0.05)。而在头颈部癌、肺癌和其它类型癌，当肿瘤转移或复发后Ⅰ.S%和Ⅰ.O.D比值亦有下降趋势。
, http://www.100md.com
3讨论
肿瘤特异性标记物是肿瘤早期诊断、早期治疗和检测预后的关键，目前临床尚无特异性的检测指标。恶性肿瘤细胞核仁的AgNOR颗粒数量明显增大和增多，而且分化程度与AgNOR的颗粒数量呈相关关系。王恩华等〔6〕研究发现，AgNOR计数对肿瘤良恶性鉴别诊断具有重要的参考价值。对宫颈癌和胰腺癌研究表现〔7，8〕，AgNOR数量和形态变化既可用于良恶性疾病的诊断，亦可用于肿瘤的分型、分级以及预测预后。但是临床需要采集组织标本，操作过程烦琐。
肿瘤的发生和发展受人体免疫系统的监视和抑制，其中T淋巴细胞是人体的主要免疫细胞，其生物活性的变化是反映体内肿瘤恶性程度的重要参数。但是由于检验T淋巴细胞方法的不一致，至今仍没有对临床提供有指导意义的结论。我们利用计算机图象分析系统对肿瘤患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性进行分析，结果恶性肿瘤患者的rDNA转录活性明显低于正常人，肿瘤切除术后，患者rDNA转录活性回升；在食道癌、乳腺癌、直肠癌和泌尿系统肿瘤，随肿瘤的恶化而进一步下降，提示肿瘤患者的免疫功能进一步抑制；头颈部癌、肺癌和其它类型癌转移或复发时Ⅰ.S%和Ⅰ.O.D%比值也下降，虽然统计学没有明显差异，分析可能与样本量小有关。
, 百拇医药
我们认为肿瘤患者外周血淋巴细胞转录活性分析不但可以反映肿瘤患者的自身免疫功能，而且可以作为临床肿瘤追踪观察的指标。
利用计算机图象分析系统对肿瘤患者外周血T淋巴细胞转录活性进行定量化分析，克服了既往操作繁琐和结果判定难以统一的缺点，具有快速、简便、分辨率高和定量化等特点，临床操作简便、易行值得进一步深入研究。
〔参考文献〕
1 Ochs RL,Busch H.Further evidence that phosphoprotein C23(110KD/P15.1)is the nucleolar silver staining protein〔J〕 . Exop Cell Res,1984,152:260.
2 Crocker J.Skilbeck N.Nucleolar organizer region associated proteins in cutaneous melanotic lesion:a quantitative study〔J〕 . J Clin Pathol,1987,40:885.
, 百拇医药
3 Egan MJ,Crocker J.Nucleolar organizer region in cutaneous tumours〔J〕 .J Pathlo,1987,154:247.
4 Anonymous.NORs a new method for the pathologist〔J〕 .Lancet,1987,1:1413.
5 许良中.关于核仁组织区(AgNOR)研究工作的标准化方案〔J〕.肿瘤，1996，3：402.
6 王恩华，戴晓淳，何安光，等.AgNOR计数在肺癌诊断及肺腺癌分型中的应用研究〔J〕.中国医科大学学报，1995，2：132.
7 李庆菊，刘秀云，陈正勤，等.AgNOR检测对宫颈癌预后的意义〔J〕.肿瘤防治研究，1996，1：21.
8 胡育新，许国铭.胰腺癌AgNORs的定量分析〔J〕.第二军医大学学报，1995，16(2)：158.
收稿日期：1998-05-04；修回日期：1998-07-20, 百拇医药
单位：北京医科大学第三医院肿瘤治疗中心(北京，100034)
关键词：肿瘤；rDNA；嗜银蛋白；预后
癌症99zk41
中图号：R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)s0-0103-01
核仁组成区(NOR)是指rDNA周围具有生物活性的非组蛋白，其功能是指导核仁合成和组装rDNA，其相关蛋白(AgNORsAP)可通过银染方法显示〔1〕。AgNORs的相对含量反映了rDNA转录活性和蛋白质合成的活跃状态〔2，3，4〕，有研究报道在肿瘤良、恶性鉴别及肿瘤恶性程度上具有诊断价值，而关于肿瘤患者外周血淋巴细胞rDNA转录活性能否作为肿瘤预后和转归监测指标国内外尚未见报道。
, 百拇医药
1材料和方法
1.1研究对象
健康人19例，患者220例为1997年9月～1998年4月收治并经病理证实的病例。临床资料祥见表1。
1.2试剂和仪器
1.2.1试剂：外周血细胞rDNA培养试剂盒由北京中北博康生物技术研究所提供。银染液A液为50%AgNO3水溶液，B液为3%甲酸+2%明胶。低渗液0.07mol/LNaCI。
1.2.2仪器：rDNA转录活性分析系统(中国科学院大恒集团北京大恒图象视觉有限公司提供)。
1.3方法
1.3.1培养：静脉血0.5ml，rDNA培养瓶中培养，37℃72小时。
, 百拇医药
1.3.2分离：(1)吸管混匀，离心2000r/min，10min；(2)弃上清液，加低渗液5ml，离心2000r/min；(3)弃上清液，加入固定液5ml，离心；(4)重复(3)；(5)弃上清液，滴在冰冻的载玻片上2～3滴，室温干燥。
1.3.3银染：A液和B液染色，90℃水浴箱中加热，涂片深黄色时取出，水冲洗，自然干燥。
1.3.4图象分析：rDNA图象分析系统分析。
Ⅰ.S=核仁积分面积/细胞核积分面积×100%
Ⅰ.O.D=核仁银染积分光密度/细胞核银染积分光密度×100%
数学模式分别为：
, 百拇医药
式中m：每组制片数；n：每张制片上被观察的细胞数；a：每个细胞中银染核仁积分总面积；b：每个细胞核的积分面积；c：每个细胞中银染核仁的Ⅰ.O.D值；d：每个细胞核的Ⅰ.O.D值。每张涂片计数10个细胞，结果为计数细胞的平均值。
1.4统计学处理：t检验。
2结果
19例健康人和220例肿瘤患者的分析结果，见表1。
表1 肿瘤患者rDNA转录活性分析(
±s)项目
例数
I.S(%)
, 百拇医药
I.O.D(%)
正常人
19
7.78±1.40
6.41±0.99
头颈部癌术后
3
5.13±1.32
4.15±1.08
头颈部癌
10
4.73±1.14
, 百拇医药 3.90±0.90*
转移或复发
5
4.80±1.46
3.94±1.15*
肺癌术后
3
5.52±0.48
4.58±0.62
肺癌
7
4.45±0.99
351±0.69*
, 百拇医药
转移或复发
12
4.23±1.77
3.67±0.60*
食道癌术后
13
5.17±1.85
4.31±1.22
食道癌
8
4.31±0.84
3.65±0.72*
, 百拇医药
转移或复发
8
4.16±1.35
3.54±1.15*
乳腺癌术后
33
5.69±1.26
4.73±1.11*
转移或复发
14
4.65±1.58
3.82±1.24**
, 百拇医药
淋巴瘤和白血病
20
4.32±0.83
3.56±0.66
脑瘤(Ⅰ、Ⅱ)术后
3
5.79±0.96
4.85±0.83*
术后残留
3
3.68±0.65
3.01±0.34*
, 百拇医药
肝癌
4
3.17±0.85
2.84±0.81*
直肠癌术后
3
5.19±0.91
4.38±0.66*
转移或复发
14
4.11±0.56
3.37±0.31**
, http://www.100md.com
泌尿系癌术后
9
5.21±0.81
4.41±0.84*
转移或复发
3
3.32±0.65
2.85±0.60**
其它癌术后
21
5.47±1.87
4.62±1.52*
, 百拇医药
其它癌
9
4.46±1.12
3.89±1.02
转移或复发
15
3.98±1.08
3.30±0.93*
(
±s).*P<0.01；**P<0.05由表1可见肿瘤患者的Ⅰ.S%和Ⅰ.O.D比值均明显低于正常人(P<0.01)，食道癌、乳腺癌、直肠癌和泌尿系统肿瘤转移或复发后Ⅰ.S%和Ⅰ.O.D比值进一步下降，统计学处理品差别显著(P<0.05)。而在头颈部癌、肺癌和其它类型癌，当肿瘤转移或复发后Ⅰ.S%和Ⅰ.O.D比值亦有下降趋势。
, http://www.100md.com
3讨论
肿瘤特异性标记物是肿瘤早期诊断、早期治疗和检测预后的关键，目前临床尚无特异性的检测指标。恶性肿瘤细胞核仁的AgNOR颗粒数量明显增大和增多，而且分化程度与AgNOR的颗粒数量呈相关关系。王恩华等〔6〕研究发现，AgNOR计数对肿瘤良恶性鉴别诊断具有重要的参考价值。对宫颈癌和胰腺癌研究表现〔7，8〕，AgNOR数量和形态变化既可用于良恶性疾病的诊断，亦可用于肿瘤的分型、分级以及预测预后。但是临床需要采集组织标本，操作过程烦琐。
肿瘤的发生和发展受人体免疫系统的监视和抑制，其中T淋巴细胞是人体的主要免疫细胞，其生物活性的变化是反映体内肿瘤恶性程度的重要参数。但是由于检验T淋巴细胞方法的不一致，至今仍没有对临床提供有指导意义的结论。我们利用计算机图象分析系统对肿瘤患者外周血T淋巴细胞rDNA转录活性进行分析，结果恶性肿瘤患者的rDNA转录活性明显低于正常人，肿瘤切除术后，患者rDNA转录活性回升；在食道癌、乳腺癌、直肠癌和泌尿系统肿瘤，随肿瘤的恶化而进一步下降，提示肿瘤患者的免疫功能进一步抑制；头颈部癌、肺癌和其它类型癌转移或复发时Ⅰ.S%和Ⅰ.O.D%比值也下降，虽然统计学没有明显差异，分析可能与样本量小有关。
, 百拇医药
我们认为肿瘤患者外周血淋巴细胞转录活性分析不但可以反映肿瘤患者的自身免疫功能，而且可以作为临床肿瘤追踪观察的指标。
利用计算机图象分析系统对肿瘤患者外周血T淋巴细胞转录活性进行定量化分析，克服了既往操作繁琐和结果判定难以统一的缺点，具有快速、简便、分辨率高和定量化等特点，临床操作简便、易行值得进一步深入研究。
〔参考文献〕
1 Ochs RL,Busch H.Further evidence that phosphoprotein C23(110KD/P15.1)is the nucleolar silver staining protein〔J〕 . Exop Cell Res,1984,152:260.
2 Crocker J.Skilbeck N.Nucleolar organizer region associated proteins in cutaneous melanotic lesion:a quantitative study〔J〕 . J Clin Pathol,1987,40:885.
, 百拇医药
3 Egan MJ,Crocker J.Nucleolar organizer region in cutaneous tumours〔J〕 .J Pathlo,1987,154:247.
4 Anonymous.NORs a new method for the pathologist〔J〕 .Lancet,1987,1:1413.
5 许良中.关于核仁组织区(AgNOR)研究工作的标准化方案〔J〕.肿瘤，1996，3：402.
6 王恩华，戴晓淳，何安光，等.AgNOR计数在肺癌诊断及肺腺癌分型中的应用研究〔J〕.中国医科大学学报，1995，2：132.
7 李庆菊，刘秀云，陈正勤，等.AgNOR检测对宫颈癌预后的意义〔J〕.肿瘤防治研究，1996，1：21.
8 胡育新，许国铭.胰腺癌AgNORs的定量分析〔J〕.第二军医大学学报，1995，16(2)：158.
收稿日期：1998-05-04；修回日期：1998-07-20, 百拇医药