人碱性成纤维细胞生长因子基因在 COS-7细胞中的表达及活性检测
作者：于凤山 段德义 姜传涛 陈立南 秦丽华 徐群渊
单位：首都医科大学北京神经科学研空所，北京100054
关键词：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；RT-PCR；cDNA克隆；Western Blot
解剖学报00zk20
【摘要】目的 获得人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，用于治疗 神经系统 疾病；克隆添加Kozak序列的bFGF cDNA序列，用于真核细胞表达。 方法 提取国人脑胶质瘤细 胞系BT325总RNA，RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段，重组于pGEM-3zf(+)载体，测序正确后构 建 表达载体，转染猴肾成纤维细胞系COS-7，Western Blot 检测表达，收集培养上清用PC-1 2进行活性检测。 结果 RT-PCR扩增到473bp的带有Kozak序列的cDNA片 段；成功构建了真核表达 载体；在COS-7得到了表达，并有一定的生物活性。 结论 由克隆到的b FGF cDNA片段构建的真核表达载体能在COS-7中表达、分泌，并具有生物活性。
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【中图分类号】Q189 [文献标识码]A [文章编号]0529-1356(2000)-增-76
THE EXPRESSION AND ACTIVITY OF NEWLY-CLONED HUMAN BASLC FIBROBLAST GROWTH FACTOR GENE IN COS-7 CELL
YU Feng-shan, DUAN De-yi, JIANG Chuan-tao, CHEN li-nan, QIN Li-hua , XU Qun-Yuan
(Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Scie nces, Beijing 100054,China)
【Abstract】 Objective The cDNA fragment of human basic fibr oblast growth factor (bFGF) with additional Kozak sequence was cloned and was th en expressed in eukaryotic cells in order to investigate the roles of bFGF in tr eatment of diseases in the nervous system. Methods T otal cellular RNA of glioma BT325 was isolated and RT-PCR amplification of the c DNA fragments was performed. The fragment was cloned into pGEM-3zf(+) vector an d sequenced. The eukaryotic expression vector was recombined and transfected into fibroblast cell line COS-7. bFGF expression was analysized using Western blot. The effect of bFGF on cultured PC-12 was observed. Results The DNA fragment of 473bp with additional Kozak sequence was amplified from reverse transcription mixture. Eukaryotic expression vector pCI-bFGF was r e combined and expressed in COS-7. The biological activity was shown on the cultu red PC-12 cell.Conclusion Full-length of cDNA of hu man bFGF with additional Kozak sequence was cloned and expressed in COS-7. This expressed product showed biological activity on certain cultured cell.
, 百拇医药
【Key words】Basic fibroblast growrh factor(bFGF); RT -PCR; cDNA cloning; Western blot 各种体内外实验均证实，某些神经营养因子能够促进神经元的存活，抑制凋亡，既能保护神经元免受疾病损伤，又能在进行细胞移植治疗时提高移植细胞的存活率，故在神经系统疾病(如帕金森病、老年性痴呆等)的治疗中有重要的应用前景[1，2]。
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一种具有广泛生物学作用的生长因子，对多种来源于中胚层和外胚层的细胞具有促进生长、促进有丝分裂的作用。实验证实，bFGF 是一种重要的神经营养因子，有促进多种神经元的存活和抑制凋亡的作用[3]；对中脑多巴胺能神经元还有促进轴突生长、提高酪氨酸羟化酶活性、促进对多巴胺的摄取和提高其对抗神经毒性的作用[4，5]。另外，也有实验证明，bFGF在黑质-纹状体系统中的作用至少部分是由星形胶质细胞介导的[5]。因此，bFGF基因在当前帕金森病基因治疗研究中应具有重要的价值。
, 百拇医药
当前国内使用的bFGF基因尤其是人的bFGF基因多来自国外，应用受到诸多限制。为此，本实验拟克隆中国人bFGF cDNA，并构建其真核表达载体，以进一步研究该营养因子在中枢神经系统神经元变性修复中的作用。
材料和方法
1.材料
1.1 细胞：人胶质母细胞瘤细胞系BT325，购自北京天坛医院细胞生物室；猴肾成纤维细胞系COS-7，本室冻存；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12，本室冻存。
1.2 PCR 引物：参考GenBank登录的bFGF cDNA 序列(J04513)进行设计，由上海生物工程有限公司合成。其序列如下：
上游引物序列为：5'-GAATTCCACCATGGCAGCCGGGAGCATCA-3'，上游引物从起始密码子ATG开始。
, 百拇医药
下游引物序列为：5'-TCTAGATCAGCTCTTAGCAGACATTGG-3'，终止于终止密码子TGA，即该序列中的TCA。
分别在上游引物5'端、下游引物3'端引入EcoR I和Xba I 的酶切位点(下画线碱基)，框内所示CCACC为Kozak序列，预期扩增产物长度为485bp。
1.3 主要试剂及工具酶：异硫氰酸胍(Gibco),Superscript ll 逆转录酶(Gibco)，pfu DNA 聚合酶(Promega)，dNTPs(Promega),T4多核苷酸激酶(Promega),T4 DNA 连接酶(Promega),pCI-neo(Promega)，核酸内切酶EcoR I、 Xba I、 Sma I、 BamH I和Hinc II (华美)，DMEM(Gibco)，FBS(Gibco),兔抗bFGF 多抗(Santz Cruz)，生物素化山羊抗兔IgG(ZYMED)，预染蛋白分子量标准(Gibco),DAB(Sigma)，其他为国产或进口分析纯试剂。
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1.4 PCR 反应体系及扩增条件：取逆转录产物，加入上游及下游引物(10pmol/L)用pfu DNA 聚合酶扩增bFGF cDNA。扩增条件：94℃4min; 94℃ 45s, 60℃1min, 72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
2.bFGF cDNA 的克隆
收集培养的BT325细胞约107个，用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法提取其总RNA[6]。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA没有明显降解后，Superscript II 逆转录酶作用下进行逆转录反应。取逆转录产物用上述条件进行 PCR 扩增。取pGEM-3zf(+)质粒，Sma I 单酶切，电泳分离纯化回收酶切产物，制备平端连接载体。PCR扩增产物经电泳回收纯化目的片段，用T4多核苷酸激酶磷酸化其两平齐末端后，与pGEM-3zf(+)栽体于16℃连接20h，转化E.coli JM109，挑取白色菌落筛选重组质粒。重组质粒经筛选鉴定后送北京六合通技术发展有限公司进行序列测定。
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3.bFGF 真核表达载休的构建
分别小量提取质粒pGEM-bFGF、pCI-neo，用限制性内切酶 EcoR I、 Xba I 双酶切，电泳分离，玻璃奶纯化回收 bFGF 片段和线性质粒 pCI-neo，T4 DNA 连接酶连接两片段，连接产物转化大肠杆菌 JM109，随机挑取4个菌落，小量提取质粒，用限制性内切酶 EcoR I、 Xba I 作酶切鉴定。
4.bFGF在COS-7细胞中的表达
4.1 电穿孔转染：复苏猴肾成纤维细胞系COS-7，培养于含10%FBS的DMEM培养液中。当细胞数目达106个时，收集细胞，加入400μl电转液(hypoosmolar electroporation buffer)重悬细胞。加入5μg质粒pCI-neo-bFGF，混匀。将400μl混悬液加入电转槽(electroporation cuvettes)，确认没有气泡。设定电压为450V，脉冲时间为110ms，脉冲次数为1；进行电穿孔转染。电转后将槽内的混合物转入预先加入DMEM+10%FBS的55mm和35mm培养皿各一部分。
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4.2 Western Blot 检测：转染72h后，分别收集COS-7细胞和转染bFGF的COS-7细胞各106及其培养上清液。SDS煮沸法裂解细胞并收集上清，与细胞培养上清液合并真空冷冻干燥，浓缩至1/3体积。制备10%丙烯酰胺电泳凝胶。分别上样，200V恒压电泳40min。电泳结束取出凝胶，100V恒压转膜60min，将蛋白印迹于硝酸纤维素滤膜。用兔抗bFGF多抗进行免疫染色，DAB显色。
5.bFGF活性测定
复苏PC12细胞，培养于含10%FBS和5%马血清的DMEM中。48h后将COS-7细胞和转染bFGF的COS-7细胞上清液与培养液按1:1的比例加入PC12中，观察其生长状况。
结 果
1.RT-PCR扩增产物的获得
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提取人胶质母细胞瘤细胞系BT325总RNA，逆转录得到cDNA第1链，用合成的bFGF上、下游引物进行PCR反应，得到约 480bp 的特异性片段(图1)。图1 RT-PCR产物的电泳分析结果
1.bFGF cDNA 2.pBR322/Hinf I 分子量标准(bp)
Fig.1 Electrophoresis analysis of RT-PCR product.
1.bFGF cDNA 2.pBR322/Hinf I marker(bp)图2 pGEM-bFGF 酶切产物的电泳分析结果
1.pBR322/Hinf I 分子量标准(bp);2～5.pGEM-bFGF/EcoR I、Xba I
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Fig.2 Electrophoresis analysis of enzymatic result of pGEM-bFGF.
1.pBR322/Hinf I marker(bp);2-5.pGEM-bFGF/EcoR I，Xba l图3 pCI-neo-bFGF 酶切产物的电泳分析结果
1～3.pCI-neo-bFGF/EcoR I Xba I;
4.pBR322/Hinf I分子量标准(bp)
Fig.3 Electrophoresis analysis of enzymatic result of pCI-neo-bFGF.
1-3,pCI-neo-bFGF/EcoRI; 4,pBR322/Hinf I molecular marker(bp) 2.PCR产物的克隆
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PCR产物经1.5%琼脂糖电泳，分离480bp片段，glassmilk纯化回收，与预先制备的pGEM-3zf(+)载体连接，转化感受态JM109，经蓝/白斑筛选，挑选白色菌落，提取质粒，用EcoR I、 Xba I进行初步酶切鉴定，提示有bFGF cDNA 的插入(图2)。挑选阳性克隆进行测序，结果证实插入片段为全长468bp的bFGF cDNA，其序列与GenBank (J04513)报道的完全一样。
3.真核表达载体的构建
回收测序正确质粒pGEM-bFGF的插入片段，与经EcoR I、 Xba I 酶切的线性pCI-neo质粒片段连接，转化、涂布于平板上培养，随机挑取菌落，提取质粒，酶切鉴定，均有480bp左右的条带(图3)，说明pCI-neo-bFGF载体构建成功(图4)。
, 百拇医药 图4 bFGF 真核表达质粒 pCI-neo-bFGF 图谱
Fig.4 Map of bFGF expression plasmid pCI-neo-bFGF.
4.Western blot 检测结果
Western blot 显示，转染bFGF的COS-7的细胞裂解物和细胞培养上清液发现有约18kD的特异性条带，而正常COS-7的细胞裂解物和细胞培养上清液均未发现相应条带(图5)。
5.活性测定结果
加入COS-7细胞上清液的PC12细胞呈梭形，密度较低，没有明显的突起(图6)。加入转染bFGF的COS-7细胞上清液的PC12细胞细长者较多，密度较高，并且多数细胞有细长的突起(图7)。
, 百拇医药 讨 论
本实验采用RT-PCR方法扩增人bFGF的cDNA 片段，并构建其真核表达载体，应用电穿孔方法转染真核细胞，Western Blot 检测表达，获得了肯定的结果。从本研究采用的实验系列看，RT-PCR 的敏感性和特异性很高，可以从微量的mRNA 逆转录扩增到特异性的目的片段；bFGF 一般在胶质细胞表达丰富[7]，故在脑胶质瘤细胞系BT325中应能扩增到bFGF cDNA; COS-7 细胞可表达SV40大T抗原，被含有SV40复制起始位点的真核表达质粒转染后，可大量扩增质粒，瞬时表达大量外源蛋白；转染后的COS-7细胞培养液又表现出促进PC-12细胞的存活，促进细胞突起生长的作用[8]。因此可以认为，本研究采用的一系列实验方法是可行、可靠的。
人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的 mRNA 不稳定，在有些组织中用RT-PCR的方法不能得到该因子的 cDNA 片段。Abraham 等[9]报道，在乳腺癌、肾脏、胎盘、胚胎肝脏和胚胎心脏等部位都只能克隆到其部分序列。Prats[10]和 Kurokawa 等[11]分别从肝癌细胞系 SK-HEP-1 及人包皮成纤维细胞的 cDNA 文库中筛选到 bFGF cDNA。刘飞鹏等[12]用 PCR- 四步两段扩增法从人胎盘 cDNA 文库(Promega 公司)筛选到 bFGF cDNA。本实验从国人脑胶质母细胞瘤细胞系 BT325 中扩增到序列完全正确的 bFGF cDNA，应该说是提供了获取 bFGF 的一条新的有效途径。
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本实验克隆到了序列完全正确的人 bFGF cDNA, 并且在起始密码 ATG 的上游添加了外源性 Kozak 序列 (CCACC)，该序列和起始密码子共同构成 CCACCATGG，这符合脊椎动物细胞 mRNA 表达的共有序列 (consensus sequence)[13]，在真核细胞表达时，可以使表达效率增高。
本实验扩增到的特异性片段约为 480bp，与预期片段大小相符；测序结果表明该片段与文献[14]及 GenBank(J04513)报道完全一致。bFGF 有3种分子量形式即 18kD、21kD、 23kD [10]。其中468bp 的 cDNA 翻译后为18kD，定位于细胞质和细胞膜上；该基因没有分泌出细胞的信号肽序列，但可以能过不依赖粗面内质网和高尔基复合体的胞吐方式分泌于胞外[15]。本实验 Western Blot 结果表明，转染 bFGF 的 COS-7 细胞的上清液和细胞裂解液均有18kD 的特异性条带，而正常 COS-7细胞中却只有非特异性的弥散着色，说明在 COS-7中表达了18kD的bFGF 并且能出现在细胞外。有实验证明[14]，添加了信号肽的 bFGF 可以分泌至胞外，但由于糖基化的作用其分子量增大达35kD，其生物活性反而比没有信号肽的要小。本实验中，加入转染了 bFGF 的 COS-7 细胞上清液的 PC-12细胞密度较大，突起较多。说明体外重组的 bFGF 确实具有刺激 PC-12 细胞存活、促进突起生长作用。
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为了进一步证实本研究获得的 bFGF 生物学活性，还必须将之与胚胎神经元共培养，以观察其对神经元的营养作用；还须将表达 bFGF 的工程细胞用于帕金森病动物模型的治疗实验。目前，这些实验正在进行中。
图5 重组的bFGF 基因在COS-7细胞中特异性18kD蛋白的表达
1.预染的蛋子量标准(kD)
2、4.分别为pCI-neo-bFGF 转染细胞的培养上清液和细胞裂解物
3、5.分别为未转染细胞的培养上清液和细胞裂解物
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图6 COS-7细胞上清液对PC12细胞生长没有明显影响
图7 bFGF转染COS-7细胞上清液对PC12细胞生长密度、突起的影响
Fig.5 18kD protein expression of recombinant bFGF gene in COS-7 cell.
1,Prestained molecular weight marker(kD);
2,4,Sample taken from supernatant and lysate of cell transfected with pCI-neo-bFGF,respectively;
3,5,Sample taken from supernatant and lysate of untransfected cell, respectively
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Fig.6 No obvious effects of supernatant harvested from COS-7 cell cultures on PC12 cell growth were observed.
Fig.7 Effects of supernatant harvested from bFGF-transfected COS-7 cell cultures on PC12 cell growth and cell protrusion.
【作者简介】于凤山(1970-)，男(汉族)，河北省唐山人，硕士，讲师
参考文献
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, 百拇医药
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【收稿日期】2000-07-27 【修回日期】2000-08-31, 百拇医药
单位：首都医科大学北京神经科学研空所，北京100054
关键词：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；RT-PCR；cDNA克隆；Western Blot
解剖学报00zk20
【摘要】目的 获得人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，用于治疗 神经系统 疾病；克隆添加Kozak序列的bFGF cDNA序列，用于真核细胞表达。 方法 提取国人脑胶质瘤细 胞系BT325总RNA，RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段，重组于pGEM-3zf(+)载体，测序正确后构 建 表达载体，转染猴肾成纤维细胞系COS-7，Western Blot 检测表达，收集培养上清用PC-1 2进行活性检测。 结果 RT-PCR扩增到473bp的带有Kozak序列的cDNA片 段；成功构建了真核表达 载体；在COS-7得到了表达，并有一定的生物活性。 结论 由克隆到的b FGF cDNA片段构建的真核表达载体能在COS-7中表达、分泌，并具有生物活性。
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【中图分类号】Q189 [文献标识码]A [文章编号]0529-1356(2000)-增-76
THE EXPRESSION AND ACTIVITY OF NEWLY-CLONED HUMAN BASLC FIBROBLAST GROWTH FACTOR GENE IN COS-7 CELL
YU Feng-shan, DUAN De-yi, JIANG Chuan-tao, CHEN li-nan, QIN Li-hua , XU Qun-Yuan
(Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Scie nces, Beijing 100054,China)
【Abstract】 Objective The cDNA fragment of human basic fibr oblast growth factor (bFGF) with additional Kozak sequence was cloned and was th en expressed in eukaryotic cells in order to investigate the roles of bFGF in tr eatment of diseases in the nervous system. Methods T otal cellular RNA of glioma BT325 was isolated and RT-PCR amplification of the c DNA fragments was performed. The fragment was cloned into pGEM-3zf(+) vector an d sequenced. The eukaryotic expression vector was recombined and transfected into fibroblast cell line COS-7. bFGF expression was analysized using Western blot. The effect of bFGF on cultured PC-12 was observed. Results The DNA fragment of 473bp with additional Kozak sequence was amplified from reverse transcription mixture. Eukaryotic expression vector pCI-bFGF was r e combined and expressed in COS-7. The biological activity was shown on the cultu red PC-12 cell.Conclusion Full-length of cDNA of hu man bFGF with additional Kozak sequence was cloned and expressed in COS-7. This expressed product showed biological activity on certain cultured cell.
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【Key words】Basic fibroblast growrh factor(bFGF); RT -PCR; cDNA cloning; Western blot 各种体内外实验均证实，某些神经营养因子能够促进神经元的存活，抑制凋亡，既能保护神经元免受疾病损伤，又能在进行细胞移植治疗时提高移植细胞的存活率，故在神经系统疾病(如帕金森病、老年性痴呆等)的治疗中有重要的应用前景[1，2]。
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是一种具有广泛生物学作用的生长因子，对多种来源于中胚层和外胚层的细胞具有促进生长、促进有丝分裂的作用。实验证实，bFGF 是一种重要的神经营养因子，有促进多种神经元的存活和抑制凋亡的作用[3]；对中脑多巴胺能神经元还有促进轴突生长、提高酪氨酸羟化酶活性、促进对多巴胺的摄取和提高其对抗神经毒性的作用[4，5]。另外，也有实验证明，bFGF在黑质-纹状体系统中的作用至少部分是由星形胶质细胞介导的[5]。因此，bFGF基因在当前帕金森病基因治疗研究中应具有重要的价值。
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当前国内使用的bFGF基因尤其是人的bFGF基因多来自国外，应用受到诸多限制。为此，本实验拟克隆中国人bFGF cDNA，并构建其真核表达载体，以进一步研究该营养因子在中枢神经系统神经元变性修复中的作用。
材料和方法
1.材料
1.1 细胞：人胶质母细胞瘤细胞系BT325，购自北京天坛医院细胞生物室；猴肾成纤维细胞系COS-7，本室冻存；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12，本室冻存。
1.2 PCR 引物：参考GenBank登录的bFGF cDNA 序列(J04513)进行设计，由上海生物工程有限公司合成。其序列如下：
上游引物序列为：5'-GAATTCCACCATGGCAGCCGGGAGCATCA-3'，上游引物从起始密码子ATG开始。
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下游引物序列为：5'-TCTAGATCAGCTCTTAGCAGACATTGG-3'，终止于终止密码子TGA，即该序列中的TCA。
分别在上游引物5'端、下游引物3'端引入EcoR I和Xba I 的酶切位点(下画线碱基)，框内所示CCACC为Kozak序列，预期扩增产物长度为485bp。
1.3 主要试剂及工具酶：异硫氰酸胍(Gibco),Superscript ll 逆转录酶(Gibco)，pfu DNA 聚合酶(Promega)，dNTPs(Promega),T4多核苷酸激酶(Promega),T4 DNA 连接酶(Promega),pCI-neo(Promega)，核酸内切酶EcoR I、 Xba I、 Sma I、 BamH I和Hinc II (华美)，DMEM(Gibco)，FBS(Gibco),兔抗bFGF 多抗(Santz Cruz)，生物素化山羊抗兔IgG(ZYMED)，预染蛋白分子量标准(Gibco),DAB(Sigma)，其他为国产或进口分析纯试剂。
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1.4 PCR 反应体系及扩增条件：取逆转录产物，加入上游及下游引物(10pmol/L)用pfu DNA 聚合酶扩增bFGF cDNA。扩增条件：94℃4min; 94℃ 45s, 60℃1min, 72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
2.bFGF cDNA 的克隆
收集培养的BT325细胞约107个，用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法提取其总RNA[6]。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA没有明显降解后，Superscript II 逆转录酶作用下进行逆转录反应。取逆转录产物用上述条件进行 PCR 扩增。取pGEM-3zf(+)质粒，Sma I 单酶切，电泳分离纯化回收酶切产物，制备平端连接载体。PCR扩增产物经电泳回收纯化目的片段，用T4多核苷酸激酶磷酸化其两平齐末端后，与pGEM-3zf(+)栽体于16℃连接20h，转化E.coli JM109，挑取白色菌落筛选重组质粒。重组质粒经筛选鉴定后送北京六合通技术发展有限公司进行序列测定。
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3.bFGF 真核表达载休的构建
分别小量提取质粒pGEM-bFGF、pCI-neo，用限制性内切酶 EcoR I、 Xba I 双酶切，电泳分离，玻璃奶纯化回收 bFGF 片段和线性质粒 pCI-neo，T4 DNA 连接酶连接两片段，连接产物转化大肠杆菌 JM109，随机挑取4个菌落，小量提取质粒，用限制性内切酶 EcoR I、 Xba I 作酶切鉴定。
4.bFGF在COS-7细胞中的表达
4.1 电穿孔转染：复苏猴肾成纤维细胞系COS-7，培养于含10%FBS的DMEM培养液中。当细胞数目达106个时，收集细胞，加入400μl电转液(hypoosmolar electroporation buffer)重悬细胞。加入5μg质粒pCI-neo-bFGF，混匀。将400μl混悬液加入电转槽(electroporation cuvettes)，确认没有气泡。设定电压为450V，脉冲时间为110ms，脉冲次数为1；进行电穿孔转染。电转后将槽内的混合物转入预先加入DMEM+10%FBS的55mm和35mm培养皿各一部分。
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4.2 Western Blot 检测：转染72h后，分别收集COS-7细胞和转染bFGF的COS-7细胞各106及其培养上清液。SDS煮沸法裂解细胞并收集上清，与细胞培养上清液合并真空冷冻干燥，浓缩至1/3体积。制备10%丙烯酰胺电泳凝胶。分别上样，200V恒压电泳40min。电泳结束取出凝胶，100V恒压转膜60min，将蛋白印迹于硝酸纤维素滤膜。用兔抗bFGF多抗进行免疫染色，DAB显色。
5.bFGF活性测定
复苏PC12细胞，培养于含10%FBS和5%马血清的DMEM中。48h后将COS-7细胞和转染bFGF的COS-7细胞上清液与培养液按1:1的比例加入PC12中，观察其生长状况。
结 果
1.RT-PCR扩增产物的获得
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提取人胶质母细胞瘤细胞系BT325总RNA，逆转录得到cDNA第1链，用合成的bFGF上、下游引物进行PCR反应，得到约 480bp 的特异性片段(图1)。图1 RT-PCR产物的电泳分析结果
1.bFGF cDNA 2.pBR322/Hinf I 分子量标准(bp)
Fig.1 Electrophoresis analysis of RT-PCR product.
1.bFGF cDNA 2.pBR322/Hinf I marker(bp)图2 pGEM-bFGF 酶切产物的电泳分析结果
1.pBR322/Hinf I 分子量标准(bp);2～5.pGEM-bFGF/EcoR I、Xba I
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Fig.2 Electrophoresis analysis of enzymatic result of pGEM-bFGF.
1.pBR322/Hinf I marker(bp);2-5.pGEM-bFGF/EcoR I，Xba l图3 pCI-neo-bFGF 酶切产物的电泳分析结果
1～3.pCI-neo-bFGF/EcoR I Xba I;
4.pBR322/Hinf I分子量标准(bp)
Fig.3 Electrophoresis analysis of enzymatic result of pCI-neo-bFGF.
1-3,pCI-neo-bFGF/EcoRI; 4,pBR322/Hinf I molecular marker(bp) 2.PCR产物的克隆
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PCR产物经1.5%琼脂糖电泳，分离480bp片段，glassmilk纯化回收，与预先制备的pGEM-3zf(+)载体连接，转化感受态JM109，经蓝/白斑筛选，挑选白色菌落，提取质粒，用EcoR I、 Xba I进行初步酶切鉴定，提示有bFGF cDNA 的插入(图2)。挑选阳性克隆进行测序，结果证实插入片段为全长468bp的bFGF cDNA，其序列与GenBank (J04513)报道的完全一样。
3.真核表达载体的构建
回收测序正确质粒pGEM-bFGF的插入片段，与经EcoR I、 Xba I 酶切的线性pCI-neo质粒片段连接，转化、涂布于平板上培养，随机挑取菌落，提取质粒，酶切鉴定，均有480bp左右的条带(图3)，说明pCI-neo-bFGF载体构建成功(图4)。
, 百拇医药 图4 bFGF 真核表达质粒 pCI-neo-bFGF 图谱
Fig.4 Map of bFGF expression plasmid pCI-neo-bFGF.
4.Western blot 检测结果
Western blot 显示，转染bFGF的COS-7的细胞裂解物和细胞培养上清液发现有约18kD的特异性条带，而正常COS-7的细胞裂解物和细胞培养上清液均未发现相应条带(图5)。
5.活性测定结果
加入COS-7细胞上清液的PC12细胞呈梭形，密度较低，没有明显的突起(图6)。加入转染bFGF的COS-7细胞上清液的PC12细胞细长者较多，密度较高，并且多数细胞有细长的突起(图7)。
, 百拇医药 讨 论
本实验采用RT-PCR方法扩增人bFGF的cDNA 片段，并构建其真核表达载体，应用电穿孔方法转染真核细胞，Western Blot 检测表达，获得了肯定的结果。从本研究采用的实验系列看，RT-PCR 的敏感性和特异性很高，可以从微量的mRNA 逆转录扩增到特异性的目的片段；bFGF 一般在胶质细胞表达丰富[7]，故在脑胶质瘤细胞系BT325中应能扩增到bFGF cDNA; COS-7 细胞可表达SV40大T抗原，被含有SV40复制起始位点的真核表达质粒转染后，可大量扩增质粒，瞬时表达大量外源蛋白；转染后的COS-7细胞培养液又表现出促进PC-12细胞的存活，促进细胞突起生长的作用[8]。因此可以认为，本研究采用的一系列实验方法是可行、可靠的。
人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的 mRNA 不稳定，在有些组织中用RT-PCR的方法不能得到该因子的 cDNA 片段。Abraham 等[9]报道，在乳腺癌、肾脏、胎盘、胚胎肝脏和胚胎心脏等部位都只能克隆到其部分序列。Prats[10]和 Kurokawa 等[11]分别从肝癌细胞系 SK-HEP-1 及人包皮成纤维细胞的 cDNA 文库中筛选到 bFGF cDNA。刘飞鹏等[12]用 PCR- 四步两段扩增法从人胎盘 cDNA 文库(Promega 公司)筛选到 bFGF cDNA。本实验从国人脑胶质母细胞瘤细胞系 BT325 中扩增到序列完全正确的 bFGF cDNA，应该说是提供了获取 bFGF 的一条新的有效途径。
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本实验克隆到了序列完全正确的人 bFGF cDNA, 并且在起始密码 ATG 的上游添加了外源性 Kozak 序列 (CCACC)，该序列和起始密码子共同构成 CCACCATGG，这符合脊椎动物细胞 mRNA 表达的共有序列 (consensus sequence)[13]，在真核细胞表达时，可以使表达效率增高。
本实验扩增到的特异性片段约为 480bp，与预期片段大小相符；测序结果表明该片段与文献[14]及 GenBank(J04513)报道完全一致。bFGF 有3种分子量形式即 18kD、21kD、 23kD [10]。其中468bp 的 cDNA 翻译后为18kD，定位于细胞质和细胞膜上；该基因没有分泌出细胞的信号肽序列，但可以能过不依赖粗面内质网和高尔基复合体的胞吐方式分泌于胞外[15]。本实验 Western Blot 结果表明，转染 bFGF 的 COS-7 细胞的上清液和细胞裂解液均有18kD 的特异性条带，而正常 COS-7细胞中却只有非特异性的弥散着色，说明在 COS-7中表达了18kD的bFGF 并且能出现在细胞外。有实验证明[14]，添加了信号肽的 bFGF 可以分泌至胞外，但由于糖基化的作用其分子量增大达35kD，其生物活性反而比没有信号肽的要小。本实验中，加入转染了 bFGF 的 COS-7 细胞上清液的 PC-12细胞密度较大，突起较多。说明体外重组的 bFGF 确实具有刺激 PC-12 细胞存活、促进突起生长作用。
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为了进一步证实本研究获得的 bFGF 生物学活性，还必须将之与胚胎神经元共培养，以观察其对神经元的营养作用；还须将表达 bFGF 的工程细胞用于帕金森病动物模型的治疗实验。目前，这些实验正在进行中。
图5 重组的bFGF 基因在COS-7细胞中特异性18kD蛋白的表达
1.预染的蛋子量标准(kD)
2、4.分别为pCI-neo-bFGF 转染细胞的培养上清液和细胞裂解物
3、5.分别为未转染细胞的培养上清液和细胞裂解物
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图6 COS-7细胞上清液对PC12细胞生长没有明显影响
图7 bFGF转染COS-7细胞上清液对PC12细胞生长密度、突起的影响
Fig.5 18kD protein expression of recombinant bFGF gene in COS-7 cell.
1,Prestained molecular weight marker(kD);
2,4,Sample taken from supernatant and lysate of cell transfected with pCI-neo-bFGF,respectively;
3,5,Sample taken from supernatant and lysate of untransfected cell, respectively
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Fig.6 No obvious effects of supernatant harvested from COS-7 cell cultures on PC12 cell growth were observed.
Fig.7 Effects of supernatant harvested from bFGF-transfected COS-7 cell cultures on PC12 cell growth and cell protrusion.
【作者简介】于凤山(1970-)，男(汉族)，河北省唐山人，硕士，讲师
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【收稿日期】2000-07-27 【修回日期】2000-08-31, 百拇医药