庆大霉素重组合异种骨复合体的制备及相关研究
作者：张超 胡蕴玉 孙怡群 张立红 李丹
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院骨科(张超、胡蕴玉、李丹)，检验科(孙怡群)；第四军医大学中心实验室(张立红)
关键词：骨移植；缓释作用；明胶；庆大霉素；高效液相色谱
中华外科杂志98z121 【摘要】 目的 探讨局部应用抗生素与骨移植结合，以改进感染性骨不连、骨缺损的治疗。 方法 用高效液相色谱法(HPLC)在不同时间内测定植入不同含量庆大霉素重组合异种骨(G-RBX)后小鼠肌袋内庆大霉素浓度,并在污染的兔桡骨骨缺损模型中观察其抗感染与骨修复功能。 结果 明胶包裹4 mg庆大霉素的G-RBX具有良好的药物缓释功能，在植入部位周围软组织中维持有效浓度可达17天，提高明胶浓度能进一步延缓药物释放度；G-RBX植入3×107 CFU金葡菌污染的兔桡骨干1.5cm骨缺损模型可有效抑制感染，16周后获得完全骨连接。 结论 庆大霉素重组合异种骨是一种既有抗感染能力又有较高成骨活性的新型骨移植材料。
, 百拇医药
Preparation and related study of gentamicin loaded reconstitued bone xenograft Zhang Chao,Hu Yunyu,Sun Yiqun,et al.Department of Orthopedic,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,Xi′an 710032.
【Abstract】 Objective To prepare a new kind of bone graft which has anti-infective function and high osteogenesis and to improve the treatment of infective bone nonunion and bone defect. Method The concentration of gentamicin in mice muscle was determined in different time by HPLC.The use of gentamicin loaded reconstitued bone xenograft (G-RBX) as a material for implantation in contaminated radial defect was investigated in a rabbit model. Result G-RBX encapsulated 4mg gentamicin has good function of sustained release.Effective release of antibiotics from G-RBX maintained for 17 days.The release rate was slowed down by increasing the concentration of gelatin.Primary implantation of G-RBX into osseous defect contaminated with 3×107 CFU staphylococcus aureus results in bone union without infection. Conclusion Local antibiotic supplementation of graft preparations may be useful in the treatment of infective bone nonunion and bone defect.
, 百拇医药
Key words】 Bone transplantation Sustained release Gelatin Gentamicin High performance liquid chromatography
我们以不同方法将重组合异种骨作为载体复合一定剂量的庆大霉素，用高效液相色谱法测定其在小鼠肌袋内的释放度，并在污染的兔桡骨节段性骨缺损模型中检验了其抗感染作用与成骨活性。
材料和方法
1.材料：雄性BALB/C小鼠、新西兰兔由第四军医大学实验动物中心提供；明胶购于Sigama公司；RP-HPLC系统为美国BECMAN公司产品；色谱柱购于中国科学院大连化学物理研究所；其他试剂均为国产AR级。
2.庆大霉素重组合异种骨(G-RBX)的制备：选取新鲜牛肱骨上端松质骨制成5 mm×5 mm×5 mm骨粒，以50℃温水冲洗干净，氯仿/甲醇(1∶1)脱脂10小时,300 ml/L过氧化氢脱蛋白48小时,0.06 mol/L盐酸表面脱钙,冻干,在0.08 Mpa负压下将bBMP(第四军医大学全军骨科研究所提供)与牛松质骨载体按1∶5重量比复合,蒸馏水透析72小时,冻干。浸泡法:以每个骨粒4 mg庆大霉素溶液浸泡RBX骨粒24小时(4℃),冻干。明胶包裹法:将庆大霉素溶于200 g/L和400 g/L明胶溶液中(每60 μl含4 mg庆大霉素),每个RBX骨粒用60 μl包裹,冻干。以上材料封装后用环氧乙烷消毒，4℃保存备用。
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3.小鼠体内释放实验：选用雄性BALB/C小鼠165只，体重为20～22 g，随机分成三组，每组55只，将复合后的三种G-RBX植入小鼠右侧股部肌袋中。浸泡组：植入庆大霉素溶液浸泡的骨粒；200 g/L明胶包裹组：植入200 g/L明胶包裹的G-RBX骨粒；400 g/L明胶包裹组：植入400 g/L明胶包裹的G-RBX骨粒。在手术后12小时和1、2、3、5、7、10、12、14、17、21天,11个时间点每次处死5只小鼠取材，取出植入骨粒周围2 cm的软组织，加入400 μl PBS缓冲液(pH 7.4),在无菌条件下匀浆，2500 g离心15 min，保留上清液待测药物浓度。
4.高效液相色谱法测定庆大霉素浓度：参照文献[1]方法进行。
5.污染伤口骨移植的动物实验研究：
(1)动物模型及实验分组：雄性新西兰大白兔40只,体重2.2～2.5 kg,麻醉后做右前肢前外侧切口,暴露桡骨,于桡骨中上1/3处用手持牙钻截断桡骨干-骨膜15 mm,切口部位滴加3×107 CFU的金黄色葡萄球菌(第四军医大学西京医院检验科提供)。放置45 min后取出游离的碎骨,用200 ml无菌生理盐水冲洗伤口。将以上处理后的动物随机分成4组:A组：取出截除的15 mm骨干,用生理盐水冲净后仍放回原处；B组：骨缺损部位植入3粒未包裹庆大霉素的 RBX；C组：处理同B组,术后肌注庆大霉素14天(10 mg*kg-1*d-1)；D组：骨缺损部位植入3粒400 g/L明胶包裹的G-RBX(含庆大霉素12 mg)。由于兔前肢尺桡骨间的骨性连接,植骨后无须固定,保持良好对位,逐层缝合。
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(2)观察指标：动物置于相同的饲养条件,术后即摄前肢X片,此后每隔2周在麻醉下行X线检查。术后1、3、5、7、10、14天分别取耳血计数白细胞。观察动物伤口局部反应,取分泌物进行细菌培养和鉴定。16周时空气栓塞法处死动物,取双侧桡骨在BLR多功能测力仪上测量其最大扭转强度和最大弯曲载荷，最后标本用100 ml/L福尔马林固定做组织形态学检查。
结果
1.庆大霉素重组合异种骨在小鼠体内的药物释放度：不同方法制备的G-RBX复合体植入小鼠肌袋后局部软组织中庆大霉素浓度如表1所示。
2.细菌培养与鉴定：A组和C组动物术后3天局部仍明显红肿,皮温较高,并有乳白色粘稠分泌物,经细菌培养和鉴定与接种的金黄色葡萄球菌相同。以后脓肿逐渐吸收,伤口愈合，B组有2只动物分别于术后20天及33天死亡，无菌条件下取心脏血培养,结果有金黄色葡萄球菌生长。16周后所有存活动物移植部位取小块骨及软组织与匀浆后细菌培养。结果表明,未获得骨性愈合的动物局部组织均有金葡菌生长,而G-RBX植入组细菌培养全部为阴性。
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表1 局部软组织中庆大霉素浓度(μg/ml，±s) 取材时间
例数
浸泡组
200g/L
明胶包裹组
400g/L
明胶包裹组
12小时
5
257.7±14.6
187.6±19.1
165.4±17.7
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1天
5
122.6±13.5
98.4±6.6
104.6±14.9
2天
5
47.4±7.2
70.3±8.1
98.1±8.9
3天
5
10.1±1.8
, 百拇医药
66.3±8.4
79.3±6.8
5天
5
2.3±0.6
41.7±4.2
60.7±7.5
7天
5
0
36.2±4.0
58.2±5.5
10天
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5
0
19.9±2.8
40.7±3.8
12天
5
0
11.5±2.1
26.4±3.2
14天
5
0
4.6±0.7
, 百拇医药
11.7±2.9
17天
5
0
1.8±0.4
5.3±0.8
21天
5
0
0
1.2±0.3
3.白细胞计数：术后2周内不同时间点各组动物外周血白细胞计数如表2所示,G-RBX植入组明显低于其他各组,基本处于正常生理范围之内(9×109/L～ 1.3×1010/L)。表2 各组动物外周血白细胞计数(1010/L,±s) 时间
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A组
B组
C组
D组
1天
1.49±0.14
1.77±0.14
1.47±0.18
1.37±0.17
3天
1.93±0.21
2.73±0.34
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1.34±0.10
1.26±0.09
5天
2.20±0.56
2.21±0.18
1.87±0.18
1.21±0.23
7天
1.85±0.22
1.98±0.19
1.74±0.19
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1.27±0.23
10天
1.61±0.25
1.42±0.12
1.65±0.19
1.08±0.12
14天
1.96±0.45
1.73±0.14
1.39±0.15
, 百拇医药
1.14±0.11
注：与D组相比，P<0.05
4.X线检查：A组和B组在2周时局部有明显软组织肿胀阴影,而后逐渐吸收。4周时A组中仅有1只动物骨折断端有少量骨痂,B组和C组移植物纹理模糊,密度降低,骨膜增生明显；8周时A、B、C 组中各有9只、8只和7只动物观察到骨髓炎表现,患区骨质破坏与增生并存,并有大小不一的死骨块。D组10只动物在4周时已有骨痂生长,16周骨缺损部已获骨性连接,密度均匀,并有部分髓腔再通,A组和C组各仅有1只和3只动物获得骨性连接。
5.生物力学测试：在BLR多功能测力仪和K50扭转试验机上测量D组实验侧与正常对侧桡骨的最大扭转强度和最大弯曲载荷(表3)。数据经配对均数t检验。结果显示，16周后G-RBX植入后形成新骨的扭转强度和最大弯曲载荷与正常桡骨比较差异无显著性意义(P>0.05)。
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表3 D组实验侧与正常对侧扭转强度
和最大弯曲载荷比较(±s) 标本
扭转强度(Nm)
最大弯曲载荷(N)
实验侧
0.776±0.054
163.9±10.6
正常对侧
0.819±0.044
165.8±11.7
6.组织形态学检查： 术后16周,D组(10只)可见大量新骨改建为成熟的板层骨,初期皮质骨形成,髓腔再通。A组9只、B组10只、C组7只未获得骨性连接。骨缺损区填充纤维结缔组织,并有大量中性白细胞浸润,骨缺损区上下端的桡骨骨髓腔呈脓液样,骨髓内骨小梁数量增多且致密,有的可见小块死皮质骨。讨论
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1.局部应用抗生素治疗感染性骨缺损：创伤后骨与软组织的感染是一个临床常见而又棘手的难题, 对于伴有骨缺损的开放性骨折,或病灶清除后的骨缺损,一期植骨通常是禁忌。往往要伤口愈合, 血管重建后二期修复骨缺损或骨不连[2，3]。应用抗生素时, 由于骨病变处血运较差、周围瘢痕组织多的特点,血清中抗生素浓度与病灶处并不平行,因而即使全身应用大剂量抗生素,在病灶局部亦难达到有效浓度。为使骨中达到有效浓度则需要极高的血药浓度,这就不可避免的出现药物的毒副作用,而局部应用抗生素则可在病灶局部获得较高且持久的抗生素浓度而血清中药物浓度极低，近年来得到了广泛的研究和应用。但迄今为止，绝大多数局部应用抗生素的载体系统都不具备成骨活性，难以为机体吸收，需再次手术取出。
2.庆大霉素重组合异种骨复合体的制备：重组合异种骨(RBX)是由牛骨形态发生蛋白(bBMP) 和部分脱蛋白牛松质骨组成，BMP有较高效成骨活性，去抗原处理的异种骨作为理想的多孔性支架，两者复合移植不仅避免了异种骨移植强烈的免疫排斥反应，而且浓缩了植骨的成骨活性物质。系列实验研究和临床应用均获得满意效果[4]。本研究应用组织相容性很好的明胶做为缓释剂,使其复合一定剂量的抗生素,一期植入到污染的开放性骨缺损模型中。结果表明,明胶包裹4 mg的G-RBX植入小鼠肌袋内12小时,可获得远远高于致病菌MIC的初始浓度,快速释药期持续12～24小时,在感染初期可以大量杀死细菌,而后抗生素释放速度减慢,能在17天内维持局部有效抗生素浓度,具有缓慢释药的特点。增加明胶的浓度,可以进一步减缓药物释放速度。
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3.庆大霉素重组合异种骨的抗感染与骨修复能力：金黄色葡萄球菌(金葡菌)是骨科感染疾病中最常见的致病菌[5],该菌分裂一次的时间为20～30分钟,在用定量金葡菌污染的兔桡骨骨缺损模型中伤口污染后延迟45分钟接受处理,可使细菌在伤口内至少繁殖一代。这较形象的模拟了临床常见的创伤后污染严重的开放性骨损伤。对照组未给予抗生素治疗,90%的动物发展为骨髓炎,说明感染的模型是有效的。未复合抗生素的RBX植入后10只动物全部出现严重的感染症状,白细胞计数明显升高,并有2只动物死于金葡菌败血症,16周后存活的8只动物发生骨髓炎,骨缺损处以炎性纤维组织连接。D组全部动物无一例发生骨髓炎，16周后骨缺损得以完全修复,新骨抗扭转与弯曲负荷与正常桡骨无明显差异。而全身应用庆大霉素的C组中仅有3只动物获得骨愈合，其余发展为慢性骨髓炎。这可能是由于全身应用抗生素尽管用量大但效率较低，病灶部位药物浓度不足以有效的控制感染。16周后骨缺损未修复的动物无一例外均在病灶处培养出金葡菌，亦提示感染是其直接原因。本实验结果表明以明胶复合12 mg庆大霉素的G-RBX不仅可在植入局部维持较长时间的有效抗生素浓度，而且复合的药物对bBMP的骨诱导活性无明显影响。作为一种既有抗感染能力又有高效成骨活性的新型骨移植材料，庆大霉素重组合异种骨可能在改进开放性骨折,骨缺损的治疗上有良好的应用前景。但其复合方法、药物种类及剂量仍需进一步研究。
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本研究为中国人民解放军“九五”指令性课题
参 考 文 献
1 Dlrk M,Johannes SF,Van Der Sandt,et al. Micro determination of gentamicin in serum by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection.J Chromatogrphy,1980,182:201-210.
2 Bowyer SW.Antibiotic impregnated beads- open fractures.Army Med Corps,1993,193:100-104.
3 Stephen L,Peter AH,Ostermann W,et al.The antibiotic therapy head pouch technique: the management of sever compound fractures. Clin Orthop,1993,295:54-58.
4 胡蕴玉, 陆裕朴,刘玮,等.重组合异种骨的室验研究与临床应用.中华外科杂志,1993,31:709-712.
5 Garrin KL.Infection after total arthroplasty.J Bone Joint Surg(Am),1995,77:1580-1582.
(收稿：1998-07-30 修回：1998-10-20), 百拇医药
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院骨科(张超、胡蕴玉、李丹)，检验科(孙怡群)；第四军医大学中心实验室(张立红)
关键词：骨移植；缓释作用；明胶；庆大霉素；高效液相色谱
中华外科杂志98z121 【摘要】 目的 探讨局部应用抗生素与骨移植结合，以改进感染性骨不连、骨缺损的治疗。 方法 用高效液相色谱法(HPLC)在不同时间内测定植入不同含量庆大霉素重组合异种骨(G-RBX)后小鼠肌袋内庆大霉素浓度,并在污染的兔桡骨骨缺损模型中观察其抗感染与骨修复功能。 结果 明胶包裹4 mg庆大霉素的G-RBX具有良好的药物缓释功能，在植入部位周围软组织中维持有效浓度可达17天，提高明胶浓度能进一步延缓药物释放度；G-RBX植入3×107 CFU金葡菌污染的兔桡骨干1.5cm骨缺损模型可有效抑制感染，16周后获得完全骨连接。 结论 庆大霉素重组合异种骨是一种既有抗感染能力又有较高成骨活性的新型骨移植材料。
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Preparation and related study of gentamicin loaded reconstitued bone xenograft Zhang Chao,Hu Yunyu,Sun Yiqun,et al.Department of Orthopedic,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,Xi′an 710032.
【Abstract】 Objective To prepare a new kind of bone graft which has anti-infective function and high osteogenesis and to improve the treatment of infective bone nonunion and bone defect. Method The concentration of gentamicin in mice muscle was determined in different time by HPLC.The use of gentamicin loaded reconstitued bone xenograft (G-RBX) as a material for implantation in contaminated radial defect was investigated in a rabbit model. Result G-RBX encapsulated 4mg gentamicin has good function of sustained release.Effective release of antibiotics from G-RBX maintained for 17 days.The release rate was slowed down by increasing the concentration of gelatin.Primary implantation of G-RBX into osseous defect contaminated with 3×107 CFU staphylococcus aureus results in bone union without infection. Conclusion Local antibiotic supplementation of graft preparations may be useful in the treatment of infective bone nonunion and bone defect.
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Key words】 Bone transplantation Sustained release Gelatin Gentamicin High performance liquid chromatography
我们以不同方法将重组合异种骨作为载体复合一定剂量的庆大霉素，用高效液相色谱法测定其在小鼠肌袋内的释放度，并在污染的兔桡骨节段性骨缺损模型中检验了其抗感染作用与成骨活性。
材料和方法
1.材料：雄性BALB/C小鼠、新西兰兔由第四军医大学实验动物中心提供；明胶购于Sigama公司；RP-HPLC系统为美国BECMAN公司产品；色谱柱购于中国科学院大连化学物理研究所；其他试剂均为国产AR级。
2.庆大霉素重组合异种骨(G-RBX)的制备：选取新鲜牛肱骨上端松质骨制成5 mm×5 mm×5 mm骨粒，以50℃温水冲洗干净，氯仿/甲醇(1∶1)脱脂10小时,300 ml/L过氧化氢脱蛋白48小时,0.06 mol/L盐酸表面脱钙,冻干,在0.08 Mpa负压下将bBMP(第四军医大学全军骨科研究所提供)与牛松质骨载体按1∶5重量比复合,蒸馏水透析72小时,冻干。浸泡法:以每个骨粒4 mg庆大霉素溶液浸泡RBX骨粒24小时(4℃),冻干。明胶包裹法:将庆大霉素溶于200 g/L和400 g/L明胶溶液中(每60 μl含4 mg庆大霉素),每个RBX骨粒用60 μl包裹,冻干。以上材料封装后用环氧乙烷消毒，4℃保存备用。
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3.小鼠体内释放实验：选用雄性BALB/C小鼠165只，体重为20～22 g，随机分成三组，每组55只，将复合后的三种G-RBX植入小鼠右侧股部肌袋中。浸泡组：植入庆大霉素溶液浸泡的骨粒；200 g/L明胶包裹组：植入200 g/L明胶包裹的G-RBX骨粒；400 g/L明胶包裹组：植入400 g/L明胶包裹的G-RBX骨粒。在手术后12小时和1、2、3、5、7、10、12、14、17、21天,11个时间点每次处死5只小鼠取材，取出植入骨粒周围2 cm的软组织，加入400 μl PBS缓冲液(pH 7.4),在无菌条件下匀浆，2500 g离心15 min，保留上清液待测药物浓度。
4.高效液相色谱法测定庆大霉素浓度：参照文献[1]方法进行。
5.污染伤口骨移植的动物实验研究：
(1)动物模型及实验分组：雄性新西兰大白兔40只,体重2.2～2.5 kg,麻醉后做右前肢前外侧切口,暴露桡骨,于桡骨中上1/3处用手持牙钻截断桡骨干-骨膜15 mm,切口部位滴加3×107 CFU的金黄色葡萄球菌(第四军医大学西京医院检验科提供)。放置45 min后取出游离的碎骨,用200 ml无菌生理盐水冲洗伤口。将以上处理后的动物随机分成4组:A组：取出截除的15 mm骨干,用生理盐水冲净后仍放回原处；B组：骨缺损部位植入3粒未包裹庆大霉素的 RBX；C组：处理同B组,术后肌注庆大霉素14天(10 mg*kg-1*d-1)；D组：骨缺损部位植入3粒400 g/L明胶包裹的G-RBX(含庆大霉素12 mg)。由于兔前肢尺桡骨间的骨性连接,植骨后无须固定,保持良好对位,逐层缝合。
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(2)观察指标：动物置于相同的饲养条件,术后即摄前肢X片,此后每隔2周在麻醉下行X线检查。术后1、3、5、7、10、14天分别取耳血计数白细胞。观察动物伤口局部反应,取分泌物进行细菌培养和鉴定。16周时空气栓塞法处死动物,取双侧桡骨在BLR多功能测力仪上测量其最大扭转强度和最大弯曲载荷，最后标本用100 ml/L福尔马林固定做组织形态学检查。
结果
1.庆大霉素重组合异种骨在小鼠体内的药物释放度：不同方法制备的G-RBX复合体植入小鼠肌袋后局部软组织中庆大霉素浓度如表1所示。
2.细菌培养与鉴定：A组和C组动物术后3天局部仍明显红肿,皮温较高,并有乳白色粘稠分泌物,经细菌培养和鉴定与接种的金黄色葡萄球菌相同。以后脓肿逐渐吸收,伤口愈合，B组有2只动物分别于术后20天及33天死亡，无菌条件下取心脏血培养,结果有金黄色葡萄球菌生长。16周后所有存活动物移植部位取小块骨及软组织与匀浆后细菌培养。结果表明,未获得骨性愈合的动物局部组织均有金葡菌生长,而G-RBX植入组细菌培养全部为阴性。
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表1 局部软组织中庆大霉素浓度(μg/ml，±s) 取材时间
例数
浸泡组
200g/L
明胶包裹组
400g/L
明胶包裹组
12小时
5
257.7±14.6
187.6±19.1
165.4±17.7
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1天
5
122.6±13.5
98.4±6.6
104.6±14.9
2天
5
47.4±7.2
70.3±8.1
98.1±8.9
3天
5
10.1±1.8
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79.3±6.8
5天
5
2.3±0.6
41.7±4.2
60.7±7.5
7天
5
0
36.2±4.0
58.2±5.5
10天
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5
0
19.9±2.8
40.7±3.8
12天
5
0
11.5±2.1
26.4±3.2
14天
5
0
4.6±0.7
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11.7±2.9
17天
5
0
1.8±0.4
5.3±0.8
21天
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0
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1.2±0.3
3.白细胞计数：术后2周内不同时间点各组动物外周血白细胞计数如表2所示,G-RBX植入组明显低于其他各组,基本处于正常生理范围之内(9×109/L～ 1.3×1010/L)。表2 各组动物外周血白细胞计数(1010/L,±s) 时间
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A组
B组
C组
D组
1天
1.49±0.14
1.77±0.14
1.47±0.18
1.37±0.17
3天
1.93±0.21
2.73±0.34
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1.34±0.10
1.26±0.09
5天
2.20±0.56
2.21±0.18
1.87±0.18
1.21±0.23
7天
1.85±0.22
1.98±0.19
1.74±0.19
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1.27±0.23
10天
1.61±0.25
1.42±0.12
1.65±0.19
1.08±0.12
14天
1.96±0.45
1.73±0.14
1.39±0.15
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注：与D组相比，P<0.05
4.X线检查：A组和B组在2周时局部有明显软组织肿胀阴影,而后逐渐吸收。4周时A组中仅有1只动物骨折断端有少量骨痂,B组和C组移植物纹理模糊,密度降低,骨膜增生明显；8周时A、B、C 组中各有9只、8只和7只动物观察到骨髓炎表现,患区骨质破坏与增生并存,并有大小不一的死骨块。D组10只动物在4周时已有骨痂生长,16周骨缺损部已获骨性连接,密度均匀,并有部分髓腔再通,A组和C组各仅有1只和3只动物获得骨性连接。
5.生物力学测试：在BLR多功能测力仪和K50扭转试验机上测量D组实验侧与正常对侧桡骨的最大扭转强度和最大弯曲载荷(表3)。数据经配对均数t检验。结果显示，16周后G-RBX植入后形成新骨的扭转强度和最大弯曲载荷与正常桡骨比较差异无显著性意义(P>0.05)。
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表3 D组实验侧与正常对侧扭转强度
和最大弯曲载荷比较(±s) 标本
扭转强度(Nm)
最大弯曲载荷(N)
实验侧
0.776±0.054
163.9±10.6
正常对侧
0.819±0.044
165.8±11.7
6.组织形态学检查： 术后16周,D组(10只)可见大量新骨改建为成熟的板层骨,初期皮质骨形成,髓腔再通。A组9只、B组10只、C组7只未获得骨性连接。骨缺损区填充纤维结缔组织,并有大量中性白细胞浸润,骨缺损区上下端的桡骨骨髓腔呈脓液样,骨髓内骨小梁数量增多且致密,有的可见小块死皮质骨。讨论
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1.局部应用抗生素治疗感染性骨缺损：创伤后骨与软组织的感染是一个临床常见而又棘手的难题, 对于伴有骨缺损的开放性骨折,或病灶清除后的骨缺损,一期植骨通常是禁忌。往往要伤口愈合, 血管重建后二期修复骨缺损或骨不连[2，3]。应用抗生素时, 由于骨病变处血运较差、周围瘢痕组织多的特点,血清中抗生素浓度与病灶处并不平行,因而即使全身应用大剂量抗生素,在病灶局部亦难达到有效浓度。为使骨中达到有效浓度则需要极高的血药浓度,这就不可避免的出现药物的毒副作用,而局部应用抗生素则可在病灶局部获得较高且持久的抗生素浓度而血清中药物浓度极低，近年来得到了广泛的研究和应用。但迄今为止，绝大多数局部应用抗生素的载体系统都不具备成骨活性，难以为机体吸收，需再次手术取出。
2.庆大霉素重组合异种骨复合体的制备：重组合异种骨(RBX)是由牛骨形态发生蛋白(bBMP) 和部分脱蛋白牛松质骨组成，BMP有较高效成骨活性，去抗原处理的异种骨作为理想的多孔性支架，两者复合移植不仅避免了异种骨移植强烈的免疫排斥反应，而且浓缩了植骨的成骨活性物质。系列实验研究和临床应用均获得满意效果[4]。本研究应用组织相容性很好的明胶做为缓释剂,使其复合一定剂量的抗生素,一期植入到污染的开放性骨缺损模型中。结果表明,明胶包裹4 mg的G-RBX植入小鼠肌袋内12小时,可获得远远高于致病菌MIC的初始浓度,快速释药期持续12～24小时,在感染初期可以大量杀死细菌,而后抗生素释放速度减慢,能在17天内维持局部有效抗生素浓度,具有缓慢释药的特点。增加明胶的浓度,可以进一步减缓药物释放速度。
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3.庆大霉素重组合异种骨的抗感染与骨修复能力：金黄色葡萄球菌(金葡菌)是骨科感染疾病中最常见的致病菌[5],该菌分裂一次的时间为20～30分钟,在用定量金葡菌污染的兔桡骨骨缺损模型中伤口污染后延迟45分钟接受处理,可使细菌在伤口内至少繁殖一代。这较形象的模拟了临床常见的创伤后污染严重的开放性骨损伤。对照组未给予抗生素治疗,90%的动物发展为骨髓炎,说明感染的模型是有效的。未复合抗生素的RBX植入后10只动物全部出现严重的感染症状,白细胞计数明显升高,并有2只动物死于金葡菌败血症,16周后存活的8只动物发生骨髓炎,骨缺损处以炎性纤维组织连接。D组全部动物无一例发生骨髓炎，16周后骨缺损得以完全修复,新骨抗扭转与弯曲负荷与正常桡骨无明显差异。而全身应用庆大霉素的C组中仅有3只动物获得骨愈合，其余发展为慢性骨髓炎。这可能是由于全身应用抗生素尽管用量大但效率较低，病灶部位药物浓度不足以有效的控制感染。16周后骨缺损未修复的动物无一例外均在病灶处培养出金葡菌，亦提示感染是其直接原因。本实验结果表明以明胶复合12 mg庆大霉素的G-RBX不仅可在植入局部维持较长时间的有效抗生素浓度，而且复合的药物对bBMP的骨诱导活性无明显影响。作为一种既有抗感染能力又有高效成骨活性的新型骨移植材料，庆大霉素重组合异种骨可能在改进开放性骨折,骨缺损的治疗上有良好的应用前景。但其复合方法、药物种类及剂量仍需进一步研究。
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本研究为中国人民解放军“九五”指令性课题
参 考 文 献
1 Dlrk M,Johannes SF,Van Der Sandt,et al. Micro determination of gentamicin in serum by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection.J Chromatogrphy,1980,182:201-210.
2 Bowyer SW.Antibiotic impregnated beads- open fractures.Army Med Corps,1993,193:100-104.
3 Stephen L,Peter AH,Ostermann W,et al.The antibiotic therapy head pouch technique: the management of sever compound fractures. Clin Orthop,1993,295:54-58.
4 胡蕴玉, 陆裕朴,刘玮,等.重组合异种骨的室验研究与临床应用.中华外科杂志,1993,31:709-712.
5 Garrin KL.Infection after total arthroplasty.J Bone Joint Surg(Am),1995,77:1580-1582.
(收稿：1998-07-30 修回：1998-10-20), 百拇医药