5-HT1型受体mRNAs在大鼠感觉神经节的表达
作者：武胜昔 朱敏 王亚云 王文 李云庆
单位：第四军医大学基础部解剖学教研室，梁NB022琚脑研究中心，西安 710032
关键词：5-HT1受体亚型；伤害性感受；感觉神经节；RT-PCR； 原位杂交组织化学；大鼠
解剖学报00zk14
【摘要】目的 观察大鼠感觉神经节内5-HT1受体亚型的 分布。 方法 反转 录PCR及原位杂交组织化学技术。 结果 1.用PCR方法观察到大鼠背根节 (DRG)、三叉神经节(T G)及结状节(NG)内存在5-HT1A、5-HT1B和5-HT1D受体亚型，这些亚 型的 电泳条带密度在不同神经节内有差异。2.原位杂交结果显示3种感觉神经节内均存在5-HT 1A、5-HT1B和5-HT1D 受体亚型mRNAs阳性细胞。各神经节内各受体亚 型m RNAs阳性细胞的百分比不同。DRG和TG中以5-HT1D最高，分别为28.8%和27.9%；NG 中 以5-HT1B最高，为23.1%。阳性细胞以中、小型节细胞为主。3.用PCR和原位杂交 技 术，在各神经节内均未观察到5-HT1F受体mRNA的表达。 结论 5 -HT1受体各亚型在大 鼠感觉神经节内具有不同的分布特点，它们在介导和调控伤害性信息方面可能起着重要的作用。
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【中图分类号】Q954.67 【文献标识码】A 【 文章编号】0529-1356(2000)-增-52
EXPRESSION OF 5-HT1 RECEPTOR SUBTYPE mRNAs IN THE RAT SENSORY GANGLIA
WU Sheng-xi,ZHU Min,WANG Ya-yun,WANG Wen,LI Yun-qing
(Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,the Fourth Military Medical University,Xian 710032,China)
【Abstract】Objective To observe the expression of 5-HT1 receptor subtype mRNAs in the rat sensory ganglia.Methods Re vers e t ranscript-polymerase chain reaction(RT-PCR)and in situ hybridization histo ch emical techniques were used.Results 1.The presence of mRNA f or 5-HT1A，5-HT1B and 5-HT1D receptor subtypes in the rat dorsal ro ot ganglion(DRG),trigeminal ganglion(TG)and nodose ganglion(NG)was detected by P CR.Positive band intensities for these receptor subtypes were different in above mentioned ganglia.2.Positive cells for 5-HT1A，5-HT1B and 5-HT 1 D receptor subtype mRNAs were observed in all of these three kinds of sensory g anglia.The percentage of positive cells for each 5-HT1 recepror subtype mRNA t o the total number of the counted cells in different kinds of ganglia was differ ent.The highest percentages of 5-HT1D receptor subtype mRNA in both DRG a nd TG were 28.8% and 27.9%,respectively.In NG,about 23.1% of total cells were a l beled with 5-HT1B receptor mRNA,higher than that labeled with 5-HT1A a nd 5-HT1D subtypes. The positive signals were mainly confined to a subpop ula tion of small and medium-sized cells.3.No expression of 5-HT1F receptor s ubtype mRNA was detected in all of these three kinds of ganglia.Concl usion[ WTBZ 5-HT1 receptor subtypes distributed heterogeneously in the rat sensory ga nglia,they may play important roles in the transmission and regulation of the no ciceptive information.
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【Key words】5-HT1 receptor;Nociception;Sensory gang lia;RT-PCR;in situ hybridization histochenistry;Rat 5-HT 参与神经系统的多种生理功能。通过其受体介导，它在外周可以 致痛，而在中枢则参与镇痛，因此在伤害性信息的传递和调节中起着重要作用。利用分子生 物学技术已发现了5-HT受体的7种类型14个亚型。由于缺乏高选择性5-HT受体亚型的激动 剂 和拮抗剂，使得介导5-HT致痛和/或镇痛作用的5-HT受体类型难以确定。另外，5-HT 受 体的 特异性抗体较少，也使得了解 5-HT 受体在外周分布的免疫组织化学研究难以实施。脊髓 背 根节(DRG)、三叉神经节(TG)和结状节(NG)均属于感觉神经节，前两者与躯体感觉信息的传 递有关，后者则参与内脏感觉信息的传递。这些神经节的假单极神经元的中枢突分别分布于 脊髓背角浅层、三叉神经脊束核尾侧亚核浅层和孤束核，而周围突则分布于外周。一般认为 DRG、TG和NG细胞合成蛋白后多运输至中枢突和/或周围突的末梢，因此通过研究某种神经活 性物质或受体在DRG、TG和NG中的存在，可以间接地判断其在中枢突及周围突末梢的分布。
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大鼠的 5-HT1型受体有4种亚型，即 5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D和 5-HT 1F受体亚型。既往虽有研究对5-HT1 受体亚型在神经节中的分布进行了观察 [ 1～3]，但对5-HT1受体各亚型在大鼠TG及NG中的分布状况尚未见到报道，对5-HT受 体 在DRG中的分布也存在争议，上述感觉神经节内表达5-HT1型受体亚型的细胞类型也不清 楚 。本研究旨在用PCR及原位杂交方法观察5-HT1型受体各亚型在大鼠DRG、TG和NG中的分布 状况，从而为确定在外周存在的5-HT受体的类型提供依据。
材料和方法
1.动物及组织准备
成年SD大鼠10只，体重250～300g，随机分成2组。用于RT-PCR法研究的大鼠(n＝6)在戊 巴比妥钠麻醉下，以DEPC处理的0.01mol/L PBS 经左心室灌流冲血，快速取双侧腰段(L[ HT6SS〗 4～L6)DRG、TG及NG，立即在干冰上冷冻，随之进行总RNA提取 。用于原位杂交法研究的大 鼠(n＝4)在戊巴比妥钠麻醉下，断头后快速取脊髓腰段DRG、TG和NG，置 于 干冰粉末中。恒冷箱切片(14μm)，贴于明胶处理的载玻片上，置-70℃冰箱中保存备用。
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2.总RNA提取
利用 TRIzol试剂盒(GIBCO)，按操作说明提取组织总RNA。分光光度计(Hitachi U-2001)测 定RNA纯度及含量。
3.反转录合成cDNA
在50μl的反应体积中加入5μg总RNA，10μl 5×反应缓冲液，5μl 10mmol/L dNTPs ，20IU RNasin，0.25 μg Oligo(dT)12～18，600IU M-MLV反转录酶(GIBCO)和0 .5 μl 0.1 mol/L DTT，37℃孵育1h。65℃加热5min终止反应。
4.引物设计及合成
按照已报道的5-HT1受体各亚型的 cDNA序列设计其相应的特异性引物。各引物序列见表1 。
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5.PCR扩增
在25μl 的反应体积中加入合成的0.1μg cDNA,2.5μl 10ⅹPCR缓冲液，2.5μl dNTP s(2mmol/L)2.5μl MgCl2(25mmol/L)，各引物(20μ mol/L)1μl，2.5IU Taq 酶(Takara)。使用PTC-100 PCR仪(MJ Research)进行热循环。循 环条 件：93℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min,35个循环。取各扩增产物10μl，经3%琼脂糖凝胶电 泳，溴化乙锭染色后，用UVP凝胶成像系统及 Labworks 软件进行检测和分析。
6.序列分析
利用 Geneclean 试剂盒(Bio 101)将PCR产物从凝胶上回收，进一步克隆至pCRII载体，经转 化JM109感受态细胞、筛选、小量制备质粒DNA后，用Sanger双脱氧链终止法及测序试剂盒(A mersham)进行序列测定。
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7.原位杂交组织化学步骤
实验所用5-HT1受体各亚型的探针均为寡核苷酸探针(上海 Sangon 公司)。5-HT1A 、5-HT1B、5-HT1D和5-HT1F探针分别含42、45、41和39个碱基，其 序列 分别与大鼠脑内各自mRNA的一部分(204～245、410～454、1061～1101和702～740号碱基)相 互补[4～7]。探针用3′末端标记法及[α-35S]dATP(>1000 C i/mmol,Ame rsham)标记。标记探针的特异放射活性为1.0～1.4×109dpm/μg。切片快速干燥后依次 用4%多聚甲醛、0.1mol/L PB及杂交前处理液(含0.9%氯化钠、1.5%三乙醇胺和0.25%乙 酸 酐)进行处理。杂交时将200μl杂交液[含4×SSC、50%甲酰胺、0.025% tRNA、10%硫酸苏 糖、1×Denhardt液、15μl 0.1 mol/L DTT及标记探针(6～9×106dpm/载玻片)]滴于切 片表面，置湿盒中孵育(40℃)48h。杂交后，用1×SSC冲洗(55℃，3×20min)，最后将 LM- 1 型乳胶(Amersham)涂于切片表面，暗盒中曝光(4℃)。4周后，进行显影、定影。1%硫堇复染 、脱水、透明、封片后，光镜下明、暗视野观察。
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9.竞争性对照实验
部分切片经常规杂交前处理后，用既含标记探针又含过量的未标记探针的杂交液进行孵育， 其他过程上同。结果未发现阳性标记细胞，说明本实验所用探针能特异性地与组织中相应的 5-HT1受体亚型 mRNA 结合。
表1 PCR扩增反应中所用的5-HT受体各亚型的引物
Table 1 Primers for 5-HT receptor subtypes in PCR 受体亚型
receptors
引物序列
primer sequences
位 置(bp)
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position(bp)
扩增产物长度(bp)
length(bp)
参考文献
reference
5-HT1A
5＇-TCA CCTGCGACCTGTTTATC-3＇
320～339
394
4
5＇-GCTCCCTTCTTTTCCACCTT-3＇
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694～713
5-HT1B
5＇-CGTGCTGGTGTGGGTCTTCTC-3＇
534～554
262
5
5＇-TATCAACTGGGCTCGGGTCAA-3＇
775～795
5-HT1D
5＇-TGAATGCTACAGGGGCTTGG-3＇
59～78
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452
6
5＇-CGGTGGGATGGAGATACAGA-3＇
491～510
5-HT1F
5＇-ACCTTTGGCTGAGTGTTGAC-3＇
290～309
591
7
5＇-TAGTGGCTGCTTTGCGTTCT-3＇
861～880
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β-Actin
5＇-TGGTGGGTATGGGTCAGAAG
131～155
265
8
GACTC-3＇
5＇-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGT
372～396
CTCA-3＇
结 果
1.PCR结果
按设计引物所扩增的5-HT1受体各亚型的PCR产物的大小分别为：394bp(5-HT1A) 、2 62bp(5-HT1B)、452bp(5-HT1D)、591bp(5-HT1F)。作为内对照的β -act in的扩增产物为265bp。以大鼠DRG cDNA为模板的4种5-HT1受体亚型及β-actin 的 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D 和β -actin呈现阳性条带，各阳性条带的位置分别与预期的 PCR 产物的大小相符。将各亚型PC R产物进一步克隆入 pCRII 载体，然后进行序列检测，测得的序列分别与已知的各 5-HT 1受体亚型的 cDNA 序列一致。凝胶电泳未检测到 5-HT1F 受体亚型的阳性条带。
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图1 凝胶电泳示5-HT1受体各亚型及β-actin PCR 产物的大小
1.1 kb Plus DNA Ladder;2.5-HT1A；3.5-HT1B；4.5-HT1D； 5.5-HT1F；6.β-actin。以 DRG cDNA 为模板
Fig.1 Agarose gel electrophoresis showing the size of 5-HT1receptor subtypes and β-actin PCR products.1,1 kb plus DNA ladder;2,5-HT1A；3，5-HT1 B ；4，5-HT1D；5，5-HT1F；6，β-actin.DRG cDNA was used as the temp late.3% agarose gel
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图2 凝胶电泳示5-HT1受体各亚型在各感觉神经节 的 PCR 扩增结果。1.DRG；2.TG；3.NG；4.未加模板 cDNA 的 PCR 产物
Fig.2 Agarose gel electrophoresis showing PCR amplication of 5-HT1 re ceptor s ubtypes from rat sensory gangia.1，DRG；2，TG；3，NG；4，PCR products without te mplate cDNA
图3 5-HT1受体各亚型阳性条带的相对密度 分析。以各神经节β-actin 阳性条带的密度作为100
Fig.3 Relative density level of each positive band for 5-HT1receptor subtype s.The density level of the band for β-actin is regarded as 100.
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凝胶电泳结果显示5-HT1A、5-HT1B和5-HT1D受体亚型均存在于 DRG 、T G 和 NG 中，但在3种神经节中均未检测到 5-HT1F 受体亚型(图2)。我们使用了另 外 一套引物及模板重新进行了 PCR 扩增，得到了相同的结果。利用Labworks 软件所做的分析 表明，5-HT1A、5-HT1B和 5-HT1D 受体亚型在3种神经节中的阳性条 带 的密度有差异(图3)。β-actin 3个条带的密度基本一致，表明各 PCR 反应中所加的模板 cDNA 的量基本相等。
2.原位杂交结果
胞浆内银颗粒密度高于本底5倍以上的神经元被认为是阳性神经元。在DRG、TG和NG中均观察 到了5-HT1A、5-HT1B和5-HT1D受体亚型mRNAs阳性细胞(图4)，但3种 神经 节内各受体亚型 mRNAs 阳性细胞的数量不同(表2)。同一神经节表达各受体亚型 mRNAs 的 阳性细胞数量存在着差异，与 PCR 的半定量结果基本一致。上述受体亚型 mRNAs 在3种神 经节中的阳性细胞均以中(26～35μm)、小型(≤25μm)细胞为主。原位杂交方法亦未能检测 到3种神经节细胞表达5-HT1F受体 mRNA。
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表2 DRG、TG 和 NG 中5-HT1受体亚型 mRNAs 阳性细 胞的百分比
Table 2 Percentage of 5-HT1receptor subtype mRNAs positive neurons with in DRG,TG and NG
DRG
TG
NG
受体亚型
细胞总数
阳性细胞数(%)*
细胞总数
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阳性细胞数(%)*
细胞总数
阳性细胞数(%)*
receptor subtype
counted cells
positive cells(%)
counted cells[ 〗positive cells(%)
counted cells
positive cells(%)
5-HT1A
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1124
117(10.4)
2568
573(22.3)
1049
1 23(11.7)
5-HT1B
1265
309(24.4)
2147
376(17.5)
997
, 百拇医药
2 30(23.1)
5-HT1D
1303
375(28.8)
2109
588(27.9)
1152
260(22.6)
* 阳性细胞占计数细胞总数的百分比 (The percentage of the number of positive ce lls to the total number of counted cells)
讨 论
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本研究用 RT-PCR 和原位杂交组织化学方法检测到大鼠 DRG、TG 和 NG 中有 5-HT1A 、5-HT1B和 5-HT1D受体亚型，提示上述 5-HT 受体亚型可能既存在于 3 种神 经节细胞的中枢突末梢，也存在于周围突末梢。在上述神经节中没有检测到 5-HT1F 受体亚型。虽然用另一套引物和模板进行了重复，仍为阴性结果，提示3种神经节中可能不 存在此种亚型，但尚不能排除该亚型在上述3种神经节中含量很低的可能性。
Bouchelet 等[2]用 PCR 方法检测到人 TG 中存在 5-HT1Dα、 5-HT 1Dβ和5-HT1F 亚型；Pierce等[1，9]观察到5-HT1A、5-HT1Dα、5-HT1D β 和5-HT1F存在于人 DRG 中，5-HT1B和5-HT1D存在于大鼠DRG中， 从 人与大鼠得到的结果不同，提示人和大鼠感觉神经元中的 5-HT 受体类型有一定的差异， 它 们的作用可能不同。与 Pierce 等在大鼠 DRG 中的结果相比，我们不仅检测到了 5-HT 1B 和 5-HT1D，而且还检测到了 5-HT1A 受体亚型的表达。结果的差异可 能是由于大鼠类型、引物序列及实验条件的不同所致，但仍需进一步研究。
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在 DRG 和 TG 中表达的 5-HT1受体亚型，其相对应的电泳条带的密度存在差异，阳性细 胞的百分比也不尽相同，在一定程度上反映了这些亚型在 TG 和 DRG 中的含量不同，提示 它们在 TG 和 DRG 中所发挥的作用可能有一定的差异。DRG 和 TG 中的5-HT1A、5 - HT1B和 5-HT1D受体亚型 mRNAs 阳性细胞均以中、小型细胞为主，提示这些 受 体亚型可能介导 5-HT 在外周传递伤害性信息和在中枢调控伤害性信息的作用，这与药理 学 、电生理学等的研究结果相符。既往电生理及药理学研究证明大鼠 DRG 中存在 5-HT1 A受体，位于外周感觉神经末梢的 5-HT1A受体可介导外周给予 5-HT 所产生的痛 觉 过敏，其作用由第二信使系统 cAMP 介导[10]。药理学研究观察到 5-HT1B 和 5-HT1D受体激动剂 Sumatriptan 能抑制三叉神经 C 纤维释放神经肽，从而抑制 神经性炎症的发生[11]，提示5-HT1B和/或5-HT1D受体的激活在抑 制神经性炎症的过程中有重要作用。
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本研究未检测到 5-HT1F 亚型在 DRG 和 TG 中表达，与以往的研究结果一致。但有 研究观察到 5-HT1F存在于人及豚鼠的 DRG 和/或 TG 中。提示 5-HT1F在 D RG 和 TG 中的分布具有种属差异。关于 5-HT1F 亚型在感觉信息传递和调节中的作用 还 知之甚少。Johnson 等[12]观察到 5-HT1F 亚型 mRNA 在豚鼠 TG 细胞表 达，其激动剂 LY334370 能抑制豚鼠脑膜炎症的产生。
NG 属内脏感觉神经节，有关 5-HT 受体在 NG 内分布的报道很少。研究表明，5-HT 参与 内 脏痛觉过敏产生的外周敏化机制。但是介导 5-HT 这一作用的受体亚型还不清楚。本研究 观 察到 5-HT1A、5-HT1B和 5-HT1D受体亚型在 NG 中表达，提示这些 亚型 存在于内脏感觉传入末梢，可能参与介导 5-HT 引起的内脏痛觉过敏。Coelho等[13 ]的研究表明，5-HT参与了BrX-537A 诱导的内脏痛觉过敏，且 这一过程由 5-HT1A受体介导。对 5-HT1B和 5-HT1D亚型在内脏感觉 信息传递中的作用的研究尚缺乏生理学和药理学依据。
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综上所述，5-HT1A、5-HT1B 和 5-HT1D受体亚型既存在于 DRG 和 T G， 又存在于 NG 中，提示它们在介导 5-HT 的外周致痛作用中扮演着重要的角色。对这些受 体及其他受体亚型的进一步研究，将有助于我们深入了解 5-HT 的作用途径及机制。
本文照片的制作得到了原悦萍同志的协助，谨致谢意。
图4 明、暗视野示DRG(A，B，C)、TG(D，E，F)和NG(G，H，I)内的5-HT1A( A，D，G)、5 -HT1B(B，E，H)和5-HT1D(C，F，I)受体亚型mRNAs阳性神经元。标尺示50 μm
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Fig.4 Bright-and dark-field microphotography showing 5-HT1A(A,D ,G),5-HT1B(B，E，H)and 5-HT1D(C,F,I)receptor subtype mRNAs posi tive neurons in the DRG(A,B,C ),TG(D,E,F)and NG(G,H,I),respectively.Bar＝50μm
【基金项目】国家杰出青年科学基金资助项目(39625011)、高等院校骨干 教师资助项目
【作者简介】武胜昔(1967—)，男(汉族)，河北省高邑人，博士，讲师
参考文献
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【收稿日期】2000-06-25 【修回日期】2000-07-21, http://www.100md.com
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WU Sheng-xi,ZHU Min,WANG Ya-yun,WANG Wen,LI Yun-qing
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【Abstract】Objective To observe the expression of 5-HT1 receptor subtype mRNAs in the rat sensory ganglia.Methods Re vers e t ranscript-polymerase chain reaction(RT-PCR)and in situ hybridization histo ch emical techniques were used.Results 1.The presence of mRNA f or 5-HT1A，5-HT1B and 5-HT1D receptor subtypes in the rat dorsal ro ot ganglion(DRG),trigeminal ganglion(TG)and nodose ganglion(NG)was detected by P CR.Positive band intensities for these receptor subtypes were different in above mentioned ganglia.2.Positive cells for 5-HT1A，5-HT1B and 5-HT 1 D receptor subtype mRNAs were observed in all of these three kinds of sensory g anglia.The percentage of positive cells for each 5-HT1 recepror subtype mRNA t o the total number of the counted cells in different kinds of ganglia was differ ent.The highest percentages of 5-HT1D receptor subtype mRNA in both DRG a nd TG were 28.8% and 27.9%,respectively.In NG,about 23.1% of total cells were a l beled with 5-HT1B receptor mRNA,higher than that labeled with 5-HT1A a nd 5-HT1D subtypes. The positive signals were mainly confined to a subpop ula tion of small and medium-sized cells.3.No expression of 5-HT1F receptor s ubtype mRNA was detected in all of these three kinds of ganglia.Concl usion[ WTBZ 5-HT1 receptor subtypes distributed heterogeneously in the rat sensory ga nglia,they may play important roles in the transmission and regulation of the no ciceptive information.
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【Key words】5-HT1 receptor;Nociception;Sensory gang lia;RT-PCR;in situ hybridization histochenistry;Rat 5-HT 参与神经系统的多种生理功能。通过其受体介导，它在外周可以 致痛，而在中枢则参与镇痛，因此在伤害性信息的传递和调节中起着重要作用。利用分子生 物学技术已发现了5-HT受体的7种类型14个亚型。由于缺乏高选择性5-HT受体亚型的激动 剂 和拮抗剂，使得介导5-HT致痛和/或镇痛作用的5-HT受体类型难以确定。另外，5-HT 受 体的 特异性抗体较少，也使得了解 5-HT 受体在外周分布的免疫组织化学研究难以实施。脊髓 背 根节(DRG)、三叉神经节(TG)和结状节(NG)均属于感觉神经节，前两者与躯体感觉信息的传 递有关，后者则参与内脏感觉信息的传递。这些神经节的假单极神经元的中枢突分别分布于 脊髓背角浅层、三叉神经脊束核尾侧亚核浅层和孤束核，而周围突则分布于外周。一般认为 DRG、TG和NG细胞合成蛋白后多运输至中枢突和/或周围突的末梢，因此通过研究某种神经活 性物质或受体在DRG、TG和NG中的存在，可以间接地判断其在中枢突及周围突末梢的分布。
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大鼠的 5-HT1型受体有4种亚型，即 5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D和 5-HT 1F受体亚型。既往虽有研究对5-HT1 受体亚型在神经节中的分布进行了观察 [ 1～3]，但对5-HT1受体各亚型在大鼠TG及NG中的分布状况尚未见到报道，对5-HT受 体 在DRG中的分布也存在争议，上述感觉神经节内表达5-HT1型受体亚型的细胞类型也不清 楚 。本研究旨在用PCR及原位杂交方法观察5-HT1型受体各亚型在大鼠DRG、TG和NG中的分布 状况，从而为确定在外周存在的5-HT受体的类型提供依据。
材料和方法
1.动物及组织准备
成年SD大鼠10只，体重250～300g，随机分成2组。用于RT-PCR法研究的大鼠(n＝6)在戊 巴比妥钠麻醉下，以DEPC处理的0.01mol/L PBS 经左心室灌流冲血，快速取双侧腰段(L[ HT6SS〗 4～L6)DRG、TG及NG，立即在干冰上冷冻，随之进行总RNA提取 。用于原位杂交法研究的大 鼠(n＝4)在戊巴比妥钠麻醉下，断头后快速取脊髓腰段DRG、TG和NG，置 于 干冰粉末中。恒冷箱切片(14μm)，贴于明胶处理的载玻片上，置-70℃冰箱中保存备用。
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2.总RNA提取
利用 TRIzol试剂盒(GIBCO)，按操作说明提取组织总RNA。分光光度计(Hitachi U-2001)测 定RNA纯度及含量。
3.反转录合成cDNA
在50μl的反应体积中加入5μg总RNA，10μl 5×反应缓冲液，5μl 10mmol/L dNTPs ，20IU RNasin，0.25 μg Oligo(dT)12～18，600IU M-MLV反转录酶(GIBCO)和0 .5 μl 0.1 mol/L DTT，37℃孵育1h。65℃加热5min终止反应。
4.引物设计及合成
按照已报道的5-HT1受体各亚型的 cDNA序列设计其相应的特异性引物。各引物序列见表1 。
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5.PCR扩增
在25μl 的反应体积中加入合成的0.1μg cDNA,2.5μl 10ⅹPCR缓冲液，2.5μl dNTP s(2mmol/L)2.5μl MgCl2(25mmol/L)，各引物(20μ mol/L)1μl，2.5IU Taq 酶(Takara)。使用PTC-100 PCR仪(MJ Research)进行热循环。循 环条 件：93℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min,35个循环。取各扩增产物10μl，经3%琼脂糖凝胶电 泳，溴化乙锭染色后，用UVP凝胶成像系统及 Labworks 软件进行检测和分析。
6.序列分析
利用 Geneclean 试剂盒(Bio 101)将PCR产物从凝胶上回收，进一步克隆至pCRII载体，经转 化JM109感受态细胞、筛选、小量制备质粒DNA后，用Sanger双脱氧链终止法及测序试剂盒(A mersham)进行序列测定。
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7.原位杂交组织化学步骤
实验所用5-HT1受体各亚型的探针均为寡核苷酸探针(上海 Sangon 公司)。5-HT1A 、5-HT1B、5-HT1D和5-HT1F探针分别含42、45、41和39个碱基，其 序列 分别与大鼠脑内各自mRNA的一部分(204～245、410～454、1061～1101和702～740号碱基)相 互补[4～7]。探针用3′末端标记法及[α-35S]dATP(>1000 C i/mmol,Ame rsham)标记。标记探针的特异放射活性为1.0～1.4×109dpm/μg。切片快速干燥后依次 用4%多聚甲醛、0.1mol/L PB及杂交前处理液(含0.9%氯化钠、1.5%三乙醇胺和0.25%乙 酸 酐)进行处理。杂交时将200μl杂交液[含4×SSC、50%甲酰胺、0.025% tRNA、10%硫酸苏 糖、1×Denhardt液、15μl 0.1 mol/L DTT及标记探针(6～9×106dpm/载玻片)]滴于切 片表面，置湿盒中孵育(40℃)48h。杂交后，用1×SSC冲洗(55℃，3×20min)，最后将 LM- 1 型乳胶(Amersham)涂于切片表面，暗盒中曝光(4℃)。4周后，进行显影、定影。1%硫堇复染 、脱水、透明、封片后，光镜下明、暗视野观察。
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9.竞争性对照实验
部分切片经常规杂交前处理后，用既含标记探针又含过量的未标记探针的杂交液进行孵育， 其他过程上同。结果未发现阳性标记细胞，说明本实验所用探针能特异性地与组织中相应的 5-HT1受体亚型 mRNA 结合。
表1 PCR扩增反应中所用的5-HT受体各亚型的引物
Table 1 Primers for 5-HT receptor subtypes in PCR 受体亚型
receptors
引物序列
primer sequences
位 置(bp)
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position(bp)
扩增产物长度(bp)
length(bp)
参考文献
reference
5-HT1A
5＇-TCA CCTGCGACCTGTTTATC-3＇
320～339
394
4
5＇-GCTCCCTTCTTTTCCACCTT-3＇
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694～713
5-HT1B
5＇-CGTGCTGGTGTGGGTCTTCTC-3＇
534～554
262
5
5＇-TATCAACTGGGCTCGGGTCAA-3＇
775～795
5-HT1D
5＇-TGAATGCTACAGGGGCTTGG-3＇
59～78
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452
6
5＇-CGGTGGGATGGAGATACAGA-3＇
491～510
5-HT1F
5＇-ACCTTTGGCTGAGTGTTGAC-3＇
290～309
591
7
5＇-TAGTGGCTGCTTTGCGTTCT-3＇
861～880
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β-Actin
5＇-TGGTGGGTATGGGTCAGAAG
131～155
265
8
GACTC-3＇
5＇-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGT
372～396
CTCA-3＇
结 果
1.PCR结果
按设计引物所扩增的5-HT1受体各亚型的PCR产物的大小分别为：394bp(5-HT1A) 、2 62bp(5-HT1B)、452bp(5-HT1D)、591bp(5-HT1F)。作为内对照的β -act in的扩增产物为265bp。以大鼠DRG cDNA为模板的4种5-HT1受体亚型及β-actin 的 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D 和β -actin呈现阳性条带，各阳性条带的位置分别与预期的 PCR 产物的大小相符。将各亚型PC R产物进一步克隆入 pCRII 载体，然后进行序列检测，测得的序列分别与已知的各 5-HT 1受体亚型的 cDNA 序列一致。凝胶电泳未检测到 5-HT1F 受体亚型的阳性条带。
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图1 凝胶电泳示5-HT1受体各亚型及β-actin PCR 产物的大小
1.1 kb Plus DNA Ladder;2.5-HT1A；3.5-HT1B；4.5-HT1D； 5.5-HT1F；6.β-actin。以 DRG cDNA 为模板
Fig.1 Agarose gel electrophoresis showing the size of 5-HT1receptor subtypes and β-actin PCR products.1,1 kb plus DNA ladder;2,5-HT1A；3，5-HT1 B ；4，5-HT1D；5，5-HT1F；6，β-actin.DRG cDNA was used as the temp late.3% agarose gel
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图2 凝胶电泳示5-HT1受体各亚型在各感觉神经节 的 PCR 扩增结果。1.DRG；2.TG；3.NG；4.未加模板 cDNA 的 PCR 产物
Fig.2 Agarose gel electrophoresis showing PCR amplication of 5-HT1 re ceptor s ubtypes from rat sensory gangia.1，DRG；2，TG；3，NG；4，PCR products without te mplate cDNA
图3 5-HT1受体各亚型阳性条带的相对密度 分析。以各神经节β-actin 阳性条带的密度作为100
Fig.3 Relative density level of each positive band for 5-HT1receptor subtype s.The density level of the band for β-actin is regarded as 100.
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凝胶电泳结果显示5-HT1A、5-HT1B和5-HT1D受体亚型均存在于 DRG 、T G 和 NG 中，但在3种神经节中均未检测到 5-HT1F 受体亚型(图2)。我们使用了另 外 一套引物及模板重新进行了 PCR 扩增，得到了相同的结果。利用Labworks 软件所做的分析 表明，5-HT1A、5-HT1B和 5-HT1D 受体亚型在3种神经节中的阳性条 带 的密度有差异(图3)。β-actin 3个条带的密度基本一致，表明各 PCR 反应中所加的模板 cDNA 的量基本相等。
2.原位杂交结果
胞浆内银颗粒密度高于本底5倍以上的神经元被认为是阳性神经元。在DRG、TG和NG中均观察 到了5-HT1A、5-HT1B和5-HT1D受体亚型mRNAs阳性细胞(图4)，但3种 神经 节内各受体亚型 mRNAs 阳性细胞的数量不同(表2)。同一神经节表达各受体亚型 mRNAs 的 阳性细胞数量存在着差异，与 PCR 的半定量结果基本一致。上述受体亚型 mRNAs 在3种神 经节中的阳性细胞均以中(26～35μm)、小型(≤25μm)细胞为主。原位杂交方法亦未能检测 到3种神经节细胞表达5-HT1F受体 mRNA。
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表2 DRG、TG 和 NG 中5-HT1受体亚型 mRNAs 阳性细 胞的百分比
Table 2 Percentage of 5-HT1receptor subtype mRNAs positive neurons with in DRG,TG and NG
DRG
TG
NG
受体亚型
细胞总数
阳性细胞数(%)*
细胞总数
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阳性细胞数(%)*
细胞总数
阳性细胞数(%)*
receptor subtype
counted cells
positive cells(%)
counted cells[ 〗positive cells(%)
counted cells
positive cells(%)
5-HT1A
, 百拇医药
1124
117(10.4)
2568
573(22.3)
1049
1 23(11.7)
5-HT1B
1265
309(24.4)
2147
376(17.5)
997
, 百拇医药
2 30(23.1)
5-HT1D
1303
375(28.8)
2109
588(27.9)
1152
260(22.6)
* 阳性细胞占计数细胞总数的百分比 (The percentage of the number of positive ce lls to the total number of counted cells)
讨 论
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本研究用 RT-PCR 和原位杂交组织化学方法检测到大鼠 DRG、TG 和 NG 中有 5-HT1A 、5-HT1B和 5-HT1D受体亚型，提示上述 5-HT 受体亚型可能既存在于 3 种神 经节细胞的中枢突末梢，也存在于周围突末梢。在上述神经节中没有检测到 5-HT1F 受体亚型。虽然用另一套引物和模板进行了重复，仍为阴性结果，提示3种神经节中可能不 存在此种亚型，但尚不能排除该亚型在上述3种神经节中含量很低的可能性。
Bouchelet 等[2]用 PCR 方法检测到人 TG 中存在 5-HT1Dα、 5-HT 1Dβ和5-HT1F 亚型；Pierce等[1，9]观察到5-HT1A、5-HT1Dα、5-HT1D β 和5-HT1F存在于人 DRG 中，5-HT1B和5-HT1D存在于大鼠DRG中， 从 人与大鼠得到的结果不同，提示人和大鼠感觉神经元中的 5-HT 受体类型有一定的差异， 它 们的作用可能不同。与 Pierce 等在大鼠 DRG 中的结果相比，我们不仅检测到了 5-HT 1B 和 5-HT1D，而且还检测到了 5-HT1A 受体亚型的表达。结果的差异可 能是由于大鼠类型、引物序列及实验条件的不同所致，但仍需进一步研究。
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在 DRG 和 TG 中表达的 5-HT1受体亚型，其相对应的电泳条带的密度存在差异，阳性细 胞的百分比也不尽相同，在一定程度上反映了这些亚型在 TG 和 DRG 中的含量不同，提示 它们在 TG 和 DRG 中所发挥的作用可能有一定的差异。DRG 和 TG 中的5-HT1A、5 - HT1B和 5-HT1D受体亚型 mRNAs 阳性细胞均以中、小型细胞为主，提示这些 受 体亚型可能介导 5-HT 在外周传递伤害性信息和在中枢调控伤害性信息的作用，这与药理 学 、电生理学等的研究结果相符。既往电生理及药理学研究证明大鼠 DRG 中存在 5-HT1 A受体，位于外周感觉神经末梢的 5-HT1A受体可介导外周给予 5-HT 所产生的痛 觉 过敏，其作用由第二信使系统 cAMP 介导[10]。药理学研究观察到 5-HT1B 和 5-HT1D受体激动剂 Sumatriptan 能抑制三叉神经 C 纤维释放神经肽，从而抑制 神经性炎症的发生[11]，提示5-HT1B和/或5-HT1D受体的激活在抑 制神经性炎症的过程中有重要作用。
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本研究未检测到 5-HT1F 亚型在 DRG 和 TG 中表达，与以往的研究结果一致。但有 研究观察到 5-HT1F存在于人及豚鼠的 DRG 和/或 TG 中。提示 5-HT1F在 D RG 和 TG 中的分布具有种属差异。关于 5-HT1F 亚型在感觉信息传递和调节中的作用 还 知之甚少。Johnson 等[12]观察到 5-HT1F 亚型 mRNA 在豚鼠 TG 细胞表 达，其激动剂 LY334370 能抑制豚鼠脑膜炎症的产生。
NG 属内脏感觉神经节，有关 5-HT 受体在 NG 内分布的报道很少。研究表明，5-HT 参与 内 脏痛觉过敏产生的外周敏化机制。但是介导 5-HT 这一作用的受体亚型还不清楚。本研究 观 察到 5-HT1A、5-HT1B和 5-HT1D受体亚型在 NG 中表达，提示这些 亚型 存在于内脏感觉传入末梢，可能参与介导 5-HT 引起的内脏痛觉过敏。Coelho等[13 ]的研究表明，5-HT参与了BrX-537A 诱导的内脏痛觉过敏，且 这一过程由 5-HT1A受体介导。对 5-HT1B和 5-HT1D亚型在内脏感觉 信息传递中的作用的研究尚缺乏生理学和药理学依据。
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综上所述，5-HT1A、5-HT1B 和 5-HT1D受体亚型既存在于 DRG 和 T G， 又存在于 NG 中，提示它们在介导 5-HT 的外周致痛作用中扮演着重要的角色。对这些受 体及其他受体亚型的进一步研究，将有助于我们深入了解 5-HT 的作用途径及机制。
本文照片的制作得到了原悦萍同志的协助，谨致谢意。
图4 明、暗视野示DRG(A，B，C)、TG(D，E，F)和NG(G，H，I)内的5-HT1A( A，D，G)、5 -HT1B(B，E，H)和5-HT1D(C，F，I)受体亚型mRNAs阳性神经元。标尺示50 μm
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Fig.4 Bright-and dark-field microphotography showing 5-HT1A(A,D ,G),5-HT1B(B，E，H)and 5-HT1D(C,F,I)receptor subtype mRNAs posi tive neurons in the DRG(A,B,C ),TG(D,E,F)and NG(G,H,I),respectively.Bar＝50μm
【基金项目】国家杰出青年科学基金资助项目(39625011)、高等院校骨干 教师资助项目
【作者简介】武胜昔(1967—)，男(汉族)，河北省高邑人，博士，讲师
参考文献
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【收稿日期】2000-06-25 【修回日期】2000-07-21, http://www.100md.com