L-NNA治疗大鼠急性脊髓损伤的实验研究
作者：刘德明 彭福宁 杨世明
单位：华中科技大学同济医学院组织学与胚胎学教研室，武汉 430030
关键词：L-NNA；一氧化氮合酶(NOS)；Nissl体；超微结构；大鼠
解剖学报00zk10
【摘要】目的 观测L-NNA治疗大鼠急性脊髓损伤后的行为 学、脊髓神 经元一氧化氮合酶(NOS)、Nissl体及其超微结构变化。方法 用运动 评分和倾斜板评分法；NADPHd组织化学技术、Nissl法和透射电镜方法。结果1.行为学变化：L-NNA治疗组大鼠的后肢运动能力及倾斜板评分均较生理 盐水对照组 增强(P<0.01)；2.脊髓NOS阳性神经元染色较生理盐水对照组浅，两 组光密度比较P<0.05；3.脊髓神经元Nissl染色，生理盐水对照组显示 Nissl体移位、减少，甚至消失等现象，这些改变在L-NNA治疗组较轻；4.超微结构观察， 生理盐水对照组脊髓神经元胞质呈空泡样变，线粒体等细胞器变性，髓鞘严重变形，少数髓 鞘呈线团状改变，常伴有高电子密度的块状沉积物。但L-NNA治疗组脊髓神经元及大部分神 经纤维的髓鞘结构清晰。结论 大鼠急性脊髓损伤可诱导 神经元NOS表达，L-NNA可对其损伤修复起促进作用。
, 百拇医药
【中图分类号】R651.2 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-39
EXPERIMENTAL STUDY OF L-NNA FOR TREATING ACUTE SPINAL CORD INJURY OF RATS
LIU De-ming,PENG Fu-ning,YANG Shi-ming
(Department of Histology and Embryology,Tongji Medical College,Huazho ng
University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)
【Abstract】Objective To observe the changes of behaviour,NOS neurons,Nissl bodies and ultrastructure after L-NNA treatment of acute sp inal cord injury in rats.Methods Using movement and incline pla ne(IP) score to observe hindlimbs movement of rats with spinal cord injury;NAD PHd histochemistry,Nissl method and electron microscopy were used for obs erv ation of changes of neuronal NOS,Nissl bodies and ultrastructure of thre e groups(normal control group,saline solution(NS)control group and L-NNA group) .Results 1.Changes of behaviour:Hindlimbs movement and IP score in L-N NA group is more potent than that in NS group(P<0.01);2.The photosensity of NOS po sitive neurons of spinal cord in L-NNA group were lower than that in NS group( P <0.05);3.Niss stain:Translocation,decreasing or vanish of neuronal Nissl bodi es were showed in NS group.All these changes were much less in L-NNA group;4.Ultr as tructure observation: The sturcture of the spinal cord neurons in NS group were changed.Fox example,cytoplasm vacuolation,mitochondrias and myelin sheath degen e ration and so on.But all these abnormal changes were showed less in L-NNA group . Conclusion:Acute spinal cord injury of rat could induce expressi on o f neuronal NOS. Continuous application of L-NNA might promote the repair of incomplete spinal cord trauma.
, 百拇医药
【Key words】 L-NNA； NOS； Niss bodies； Ultrastructure; Rat 近年来，随着对一氧化氮(NO)研究的深入，NO在中枢神经系统(CNS)的作 用倍受关注。有研 究表明，缺血和创伤等引起的CNS损伤可引起神经元一氧化氮合酶(NOS)大量和持续表达，合 成过量的NO，具有直接的神经毒性作用[1～3]。NOS抑制剂则可对抗这一过程而发 挥神经保护作用。本实验采用Allen法制成大鼠不完全性(218 gcf)急性脊髓损伤模型，再用 NOS抑制剂L-NNA治疗。应用运动评分和倾斜板评分，观测脊髓损伤大鼠的后肢运动能力； 以 组织化学和透射电镜方法分别观测不同实验组脊髓神经元NOS、Nissl体及超微结构的变化， 为L-NNA治疗大鼠急性脊髓损伤提供理论和实验依据。
材料和方法
1.实验动物及分组
雌性 Wistar 大鼠41只，体重250～280g，分为正常对照组(NC组，n=9)、生 理盐水对照组(NS组，n=16)和L-NNA治疗组(L-NNA组，n=1 6)。
, 百拇医药
2.运动评分和倾斜板(IP)评分
按开阔地行走(OFW)标准对双后肢运动能力打分，重复3次，求均值后记录。评分标准：O 为看不到后肢运动；1为仅有可感觉到的后肢运动；2为经常出现或有较多的运动，不能持重 ；3为能用后肢支持体重，可行走1～2步；4为能用后肢行走，但伴有轻度障碍；5为正常行 走。NS组和L-NNA组于术后每周测试1次，重复3次，连续4周。
将大鼠头朝左或右置于按Rivlin法自制的倾斜板角度从小到大渐增，以其停留5s而不跌落的 最 大角度对双后肢评分，重复3次取均值。测试时间于术后动物清醒时开始，以后每周1次，重 复4周。
3.急性脊髓损伤动物模型制备
用Allen法造成大鼠第10胸髓节段脊髓损伤。(1)椎板切除：7%水合氯醛腹腔注射麻醉后， 在 大鼠背部中线作一切口，暴露T8～12椎骨椎板和棘突，清除附着于 T11～12棘突的肌肉，切除T10～11棘突，从第T11椎板 底部去除其椎板，然后咬去部分T10椎板，开口稍大于冲击头。( 2) 脊髓创伤用自制脊髓撞击器对准T10脊髓中部，以218克厘米力(218gcf) 撞 击脊髓，造成脊髓顿挫伤。然后缝合椎旁肌肉和皮肤。NS组于术后第1d每日1次腹腔注射 生理 盐水2ml，连续4周；L-NNA组以等量生理盐水配制L-NNA(20mg/kg*d)，注射次数及时间同 NS组；正常对照组不作任何处理。术后第4周末，处死动物取材。
, 百拇医药
4.NADPHd组织化学染色
4.1 动物经乙醚和4%多聚甲醛灌注后，切取受损脊髓(T10)6mm，并将 组 织块分成3段，分别作NADPHd、Nissl染色和透射电镜制片。正常对照组取相同节段、方法制 片。
4.2 恒冷箱横切片(厚30μm)，每隔5片取2片，贴于涂有铬矾明胶的载片上，室温干燥 。
4.3 切片入0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗5 min×3。
4.4 入NADPHd 孵育(37℃，1 h)。孵育液成分为：1 mol/L NADPHd、0.25 mmol/L氯化 硝基四氮唑蓝(NBT)、0.3%Triton X-100、0.01mol/L PBS (pH7.4)。
4.5 入0.01mol/L PBS(pH7.4) 5min×3。
, 百拇医药
4.6 常规脱水，透明，树胶封片。
5.Nissl染色
按4.1的方法操作后石蜡包埋，切片(厚7μm)；脱蜡后入降级酒精；0.5%甲苯胺蓝染5 min ；95%酒精分色 1 min；0.01mol/L PBS( pH7.4)漂洗5min×3；常规脱水，透明，树胶 封片。
6.透射电镜标本制作
按4.1的方法操作后入4%多聚甲醛+1.25%戊二醛+0.01 mol/L PBS( pH7.4)，4℃固定4 h 后，振动切片(60μm)；振动切片经：(1)含1% OSO4+0.5%KMnO4的生理盐水4℃，1h ； (2)PBS(pH7.4)漂洗后，入30%、50%、70%、80%丙酮，每次1min;90%、100%丙酮，每次5min ，各级丙酮均为4℃，含0.5% HgCl；(3)含0.5%HgCl的100%丙酮均为4℃，1h，经纯丙酮换 3次，Epon 812定向包埋。超薄切片，铅铀染色，Opton100透射电镜观察。
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7.显微图像分析
7.1 NOS阳性神经元染色光密度测定： 从正常对照组、NS组和L-NNA组中随机取出8张 切 片，每张切片在光学显微镜下随机取5个脊髓NOS阳性神经元，用MPIAS500多媒体彩色病理图 文分析系统(德国制造)对其做光密度测定；
7.2 Niss1体染色光密度测定：具体做法同7.1。
8.统计学方法
所有数据均以
±s表示，两组均数均用t 检验作差异显著性分析。
结 果
1.神经行为学分值变化
, 百拇医药 1.1 开阔地行走(OFW)评分：正常对照组双后肢OFW分值为5；NS组和L-NNA组术后清醒 时的 OFW分值为0；术后第1周两组间OFW分值比较，P<0.05，术后第2、3、4 ，周两组间OFW分值比较P<0.01(表1)。
1.2 倾斜板(IP)评分：正常对照组双后肢IP分值为55°左右；NS组和L-NNA组术后第2 、3、4周IP评分比较P<0.01(表2)。
表1 大鼠脊髓损伤后0～4周OFW评分(±s)
Table 1 OFW score of rat spinal cord injury 0-4 weeks(±s) 组别/时间(周)
, 百拇医药
group/time(we ek)
1
2
3
4
N S
1.66±0.72
2.53±0.51
3.01±0.84
3.13±0.83
L-NNA
2.19±0.75*
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3.56 ± 0.47**
4.00±0.36**
4.06±0.44 *
*P<0.05； **P<0.01表2 大鼠脊髓损伤后0～4周IP评分(±s)
Table 2 IP score of rat spinal cord injury 0-4 weeks(±s) 组别/时间(周)
group/time(we ek)
, 百拇医药 1
2
3
4
N S
28.02±3.29
32.35±3.69
36.62±3.97
38.49 ±4.42
L-NNA
31.09±4.06*
37.4 4± 4.39**
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42.54±4.49**
46.23±5.1 9**
*P<0.05； **P<0.01
2.NADPHd组织化学染色
正常对照组脊髓NOS阳性神经元多见于后角浅层、中央管周围外侧柱，偶见后角深层、前角 和白质。NOS阳性神经元胞体及其突起染成浅蓝色，与L-NNA组脊髓NOS阳性神经元染色光密 度比较P>0.05(表3)。NS组脊髓NOS阳性神经元数量明显增多，多数神经 元胞体及其突起呈深蓝色(图1)。L-NNA组脊髓NOS阳性神经元染色明显弱于NS组(图2)，两 组间染色光密度比较P<0.05(表4)。表3 正常对照组(NC)与L-NNA组脊髓神经元
NOS染色光密度比较(±s)
, 百拇医药
Table 3 The comparison of photosensity of spinal cord neurona l NOS in normal control group with L-NNA group(±s) 组 别(group)
神 经元(neuron)NOS
NC
74.35±1.67
L-NNA
76.41±1.43*
*P>0.05
表4 脊髓损伤后4周神经元NOS染色光密度比较(±s)
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Table 4 The comparison of photosensity of neuronal
NOS of spinal cord injury four weeks(± s) 组 别(group)
神经元(neuron)NOS
NC
89.23±1.68
L-NNA
76.41±1.43*
*P<0.05
3.Nissl染色
, 百拇医药
正常对照组脊髓神经元胞体内Nissl体呈蓝色的颗粒或斑块状，此类神经元多见于脊髓后角 浅层、中央管周围和外侧柱。NS组脊髓多数神经元Nissl体出现移位，减少，甚至消失(图6) 。L-NNA组脊髓多数神经元Nissl体尚存在，其分布部位及染色光密度与正常对照组比较 无显著差异(表5)，但与NS组比较，其染色光密度较高P<0.05(图4，表6 )。表5 L-NNA组与正常对照组Nissl body光密度比较(±s)
Table 5 The comparison of the photosensity of Nissl bodies in L-NNA group with normal control (NC) group (±s) 组 别(group)
neuronal Nissl body
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NC
78.34±3.47
L-NNA
80.25±3.22*
*P>0.05
表6 L-NNA组与NS组Nissl body光密度比较(±s)
Table 6 The comparison of the photosensity
of Nissl bodies in L-NNA group with NS group (±s) 组 别(group)
, 百拇医药
n euronal Nissl body
NS
58.74±2.95
L-NNA
80.25±3.22*
*P<0.05
4.脊髓超微结构
正常对照组脊髓神经元胞核规则，核膜清晰；胞质中的线粒体、粗面内质网及高尔基复合体 等细胞器数量较多，神经纤维及髓鞘规则(图5)。NS组脊髓多数神经元出现多种异样改变， 主要表现为细胞核变形、胞质内出现空泡，尤其明显的是髓鞘严重变形，部分髓鞘松散呈网 状，常伴有呈块状的高电子密度沉积物(图6)。L-NNA组脊髓神经元及其神经纤维结构类似 正常对照组，偶见变形的髓鞘(图7)。
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讨 论
长期以来，人们致力于建立与自然脊髓损伤尽可能相似的模型。已有的急性实验性脊髓损伤 模型可分为脊髓横断伤和挫伤两种。本实验采用的是挫伤模型--重物下落冲击损伤模型， 因为这种模型与脊髓横断(部分或完全)更接近临床急性脊髓损伤[4]。为了得到满 意的 损伤效果而又不致损伤过重而引起动物死亡，我们选择了不完全性(218gcf)脊髓损伤模型。
近年来的研究表明，NO在脊髓继发性损害过程中发挥着重要作用。脊髓损伤后因NO过重合成 而具有神经毒性作用，可导致神经元特别是运动神经元死亡[5]。据报道，在CNS内 ，血 管内皮细胞源结构型NOS(ecNOS)早期激活所产生的NO是舒张血管，维持损伤区血流量，减少 血栓形成的重要因素，发挥神经保护作用。而CNS损伤后由神经细胞结构型NOS(ncNOS)和小 胶质细胞诱导型NOS(iNOS)合成的过量NO具有神经毒性 作用[6]。Hamada等[7]在实验中证实，脊髓损伤后cNOS mRNA表达并没有 变化，而i NOS mRNA表达则明显增强，24h后达最高值，提示iNOS mRNA在脊髓损伤后的神经毒性作用中 发挥关键调节作用。
, 百拇医药
由于NO是半衰期很短(仅1～5s)的不稳定气体活性分子，难以直接测定，因此常用NADPHd显 示NOS以间接表示NO合成量。我们应用此法发现，NS组脊髓NOS阳性神经元的数量和染色光 密度均明显增强，与其他各种脊髓损伤导致的NOS阳性神经元的改变相类似。L-N NA治疗组脊髓神经元NOS染色光密度明显低于NS组，接近正常对照组，表明L-NNA的持续应 用可有效地抑制NOS合成NO，从而减轻脊髓继发性损害，有利于神经元功能恢复。
Nissl体为神经元的特征性的光镜结构，因此神经元损伤后其胞体形态变化最显著的是Nissl 体，如Nissl体移位、溶解、甚至消失。本实验显示，L-NNA组脊髓神经元Nissl体改变与正 常对照组比较无显著差异，表明神经元功能恢复良好。
至目前为止，使用NOS抑制剂治疗急性脊髓损伤后的超微结构研究尚未见报道。我们的研究 发现NS组出现的神经元胞核变形、胞质内空泡，尤其明显的是髓 鞘严重变形，部分髓鞘呈现线团样改变 及块状高电子密度沉积物等现象，在L-NNA治疗组则很少见到，从而进一步证实L-NNA对于 促进受损神经元的结构恢复具有一定的作用，其详细机制有待进一步研究。
, 百拇医药
图1 NS组脊髓可见深蓝色强阳性反应的NOS 神经元。NADPHd组织化学染色 ×40
图2 L-NNA组脊髓可见浅蓝色阳性反应的NOS神经元。NA DPHd组织化学染色 ×40
图3 NS组脊髓神经元Nissl体消失。Nissl法，甲苯胺蓝 染色 ×40
图4 L-NNA组脊髓神经元Nissl体呈蓝紫色的颗粒或斑 块。Nissl法，甲苯胺蓝染色 ×40
图5 正常对照组脊髓神经元及其髓鞘。透射电镜，铅铀染色 ×4 000
图6 NS组脊髓呈网状变性的髓鞘。透射电镜，铅铀染色 ×6 000
图7 L-NNA组脊髓神经元的髓鞘。透射电镜，铅铀染色 ×4 000
, 百拇医药
Fig.1 The NOS positive neurons of spinal cord were stained dark blue in NS group ,NADPHd histohemistry ×40
Fig.2 The NOS positive neurons of spinal cord were stained light blue in L-NNA group.NADPHd histochemistry ×40
Fig.3 Neuronal Nissl bodies of spinal cord were vanish in NS grorp.Nissl method, toluidine blue stain ×40
Fig.4 Neuronal Nissl bodies of spinal cord were stained light blue in L-NNA g roup.Nissl method,toluidine blue stain ×40
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Figs.5-7 Transmission electron microscopy (TEM),lead and uranium stain
Fig.5 Neurons and myelin sheath of spinal cord in normal group ×4 000
Fig.6 Retiform myelin sheath with compact substance of spinal cord in NS group ×6 000
Fig.7 Myelin sheath of spinal cord neurons in L-NNA group ×4 000
【作者简介】刘德明(1951—)，男(汉族)，湖北省人，医学博士，副教授 ，教研室副主任
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Malinski T,Balley F,Zhang ZG,et al.Nitric oxide me asured by a porphyrinic m icrosensor in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion[J].J Cerebral Blood Metab, 1993,13(2):355-375.
[2]Wu W.Expression of nitric oxide synthase(NOS)in injured CNS neurons as shown by NADPHd histochemistry[J].Exp Neurol, 1993 120(4):153-158.
[3]Dawson VL,Dawson TM,Bartly DA,et al.Mechanism of nitric oxide mediat ed neurotoxicity in primary brain cultures[J].J Neurosci,1993,13(6):265-267.
, 百拇医药
[4]郭世绂，胥少汀.脊髓损伤基础与临床[M].北京：人民卫生出版社，1993： 131～140.
[5]Wu Y,Li Y,Liu H,et al.Induction of nitric oxide synthase and motoneu ron dea th in newborn and early postnatal rats following spinal root avulsion[J].Neuro sci Lett, 1995, 194(4):109-111.
[6]Hu WH,Li F,Qiang WA,et al.Dural role for nitric oxide in dynorphin s pinal neurotoxicity[J].J Neurotrauma, 1999,16(1):85-89.
[7]Hamada Y, Ikata T,Katoh S,et al. Role of nitric oxide in compressio n in jury of rat spinal cord[J].Free Radic Biol Med, 1996,20(3):1-3.
【收稿日期】2000-06-27 【修回日期】2000-07-17, http://www.100md.com
单位：华中科技大学同济医学院组织学与胚胎学教研室，武汉 430030
关键词：L-NNA；一氧化氮合酶(NOS)；Nissl体；超微结构；大鼠
解剖学报00zk10
【摘要】目的 观测L-NNA治疗大鼠急性脊髓损伤后的行为 学、脊髓神 经元一氧化氮合酶(NOS)、Nissl体及其超微结构变化。方法 用运动 评分和倾斜板评分法；NADPHd组织化学技术、Nissl法和透射电镜方法。结果1.行为学变化：L-NNA治疗组大鼠的后肢运动能力及倾斜板评分均较生理 盐水对照组 增强(P<0.01)；2.脊髓NOS阳性神经元染色较生理盐水对照组浅，两 组光密度比较P<0.05；3.脊髓神经元Nissl染色，生理盐水对照组显示 Nissl体移位、减少，甚至消失等现象，这些改变在L-NNA治疗组较轻；4.超微结构观察， 生理盐水对照组脊髓神经元胞质呈空泡样变，线粒体等细胞器变性，髓鞘严重变形，少数髓 鞘呈线团状改变，常伴有高电子密度的块状沉积物。但L-NNA治疗组脊髓神经元及大部分神 经纤维的髓鞘结构清晰。结论 大鼠急性脊髓损伤可诱导 神经元NOS表达，L-NNA可对其损伤修复起促进作用。
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【中图分类号】R651.2 【文献标识码】A 【文章编号】0529-1356(2000)-增-39
EXPERIMENTAL STUDY OF L-NNA FOR TREATING ACUTE SPINAL CORD INJURY OF RATS
LIU De-ming,PENG Fu-ning,YANG Shi-ming
(Department of Histology and Embryology,Tongji Medical College,Huazho ng
University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)
【Abstract】Objective To observe the changes of behaviour,NOS neurons,Nissl bodies and ultrastructure after L-NNA treatment of acute sp inal cord injury in rats.Methods Using movement and incline pla ne(IP) score to observe hindlimbs movement of rats with spinal cord injury;NAD PHd histochemistry,Nissl method and electron microscopy were used for obs erv ation of changes of neuronal NOS,Nissl bodies and ultrastructure of thre e groups(normal control group,saline solution(NS)control group and L-NNA group) .Results 1.Changes of behaviour:Hindlimbs movement and IP score in L-N NA group is more potent than that in NS group(P<0.01);2.The photosensity of NOS po sitive neurons of spinal cord in L-NNA group were lower than that in NS group( P <0.05);3.Niss stain:Translocation,decreasing or vanish of neuronal Nissl bodi es were showed in NS group.All these changes were much less in L-NNA group;4.Ultr as tructure observation: The sturcture of the spinal cord neurons in NS group were changed.Fox example,cytoplasm vacuolation,mitochondrias and myelin sheath degen e ration and so on.But all these abnormal changes were showed less in L-NNA group . Conclusion:Acute spinal cord injury of rat could induce expressi on o f neuronal NOS. Continuous application of L-NNA might promote the repair of incomplete spinal cord trauma.
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【Key words】 L-NNA； NOS； Niss bodies； Ultrastructure; Rat 近年来，随着对一氧化氮(NO)研究的深入，NO在中枢神经系统(CNS)的作 用倍受关注。有研 究表明，缺血和创伤等引起的CNS损伤可引起神经元一氧化氮合酶(NOS)大量和持续表达，合 成过量的NO，具有直接的神经毒性作用[1～3]。NOS抑制剂则可对抗这一过程而发 挥神经保护作用。本实验采用Allen法制成大鼠不完全性(218 gcf)急性脊髓损伤模型，再用 NOS抑制剂L-NNA治疗。应用运动评分和倾斜板评分，观测脊髓损伤大鼠的后肢运动能力； 以 组织化学和透射电镜方法分别观测不同实验组脊髓神经元NOS、Nissl体及超微结构的变化， 为L-NNA治疗大鼠急性脊髓损伤提供理论和实验依据。
材料和方法
1.实验动物及分组
雌性 Wistar 大鼠41只，体重250～280g，分为正常对照组(NC组，n=9)、生 理盐水对照组(NS组，n=16)和L-NNA治疗组(L-NNA组，n=1 6)。
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2.运动评分和倾斜板(IP)评分
按开阔地行走(OFW)标准对双后肢运动能力打分，重复3次，求均值后记录。评分标准：O 为看不到后肢运动；1为仅有可感觉到的后肢运动；2为经常出现或有较多的运动，不能持重 ；3为能用后肢支持体重，可行走1～2步；4为能用后肢行走，但伴有轻度障碍；5为正常行 走。NS组和L-NNA组于术后每周测试1次，重复3次，连续4周。
将大鼠头朝左或右置于按Rivlin法自制的倾斜板角度从小到大渐增，以其停留5s而不跌落的 最 大角度对双后肢评分，重复3次取均值。测试时间于术后动物清醒时开始，以后每周1次，重 复4周。
3.急性脊髓损伤动物模型制备
用Allen法造成大鼠第10胸髓节段脊髓损伤。(1)椎板切除：7%水合氯醛腹腔注射麻醉后， 在 大鼠背部中线作一切口，暴露T8～12椎骨椎板和棘突，清除附着于 T11～12棘突的肌肉，切除T10～11棘突，从第T11椎板 底部去除其椎板，然后咬去部分T10椎板，开口稍大于冲击头。( 2) 脊髓创伤用自制脊髓撞击器对准T10脊髓中部，以218克厘米力(218gcf) 撞 击脊髓，造成脊髓顿挫伤。然后缝合椎旁肌肉和皮肤。NS组于术后第1d每日1次腹腔注射 生理 盐水2ml，连续4周；L-NNA组以等量生理盐水配制L-NNA(20mg/kg*d)，注射次数及时间同 NS组；正常对照组不作任何处理。术后第4周末，处死动物取材。
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4.NADPHd组织化学染色
4.1 动物经乙醚和4%多聚甲醛灌注后，切取受损脊髓(T10)6mm，并将 组 织块分成3段，分别作NADPHd、Nissl染色和透射电镜制片。正常对照组取相同节段、方法制 片。
4.2 恒冷箱横切片(厚30μm)，每隔5片取2片，贴于涂有铬矾明胶的载片上，室温干燥 。
4.3 切片入0.01 mol/L PBS(pH7.4)漂洗5 min×3。
4.4 入NADPHd 孵育(37℃，1 h)。孵育液成分为：1 mol/L NADPHd、0.25 mmol/L氯化 硝基四氮唑蓝(NBT)、0.3%Triton X-100、0.01mol/L PBS (pH7.4)。
4.5 入0.01mol/L PBS(pH7.4) 5min×3。
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4.6 常规脱水，透明，树胶封片。
5.Nissl染色
按4.1的方法操作后石蜡包埋，切片(厚7μm)；脱蜡后入降级酒精；0.5%甲苯胺蓝染5 min ；95%酒精分色 1 min；0.01mol/L PBS( pH7.4)漂洗5min×3；常规脱水，透明，树胶 封片。
6.透射电镜标本制作
按4.1的方法操作后入4%多聚甲醛+1.25%戊二醛+0.01 mol/L PBS( pH7.4)，4℃固定4 h 后，振动切片(60μm)；振动切片经：(1)含1% OSO4+0.5%KMnO4的生理盐水4℃，1h ； (2)PBS(pH7.4)漂洗后，入30%、50%、70%、80%丙酮，每次1min;90%、100%丙酮，每次5min ，各级丙酮均为4℃，含0.5% HgCl；(3)含0.5%HgCl的100%丙酮均为4℃，1h，经纯丙酮换 3次，Epon 812定向包埋。超薄切片，铅铀染色，Opton100透射电镜观察。
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7.显微图像分析
7.1 NOS阳性神经元染色光密度测定： 从正常对照组、NS组和L-NNA组中随机取出8张 切 片，每张切片在光学显微镜下随机取5个脊髓NOS阳性神经元，用MPIAS500多媒体彩色病理图 文分析系统(德国制造)对其做光密度测定；
7.2 Niss1体染色光密度测定：具体做法同7.1。
8.统计学方法
所有数据均以
±s表示，两组均数均用t 检验作差异显著性分析。结 果
1.神经行为学分值变化
, 百拇医药 1.1 开阔地行走(OFW)评分：正常对照组双后肢OFW分值为5；NS组和L-NNA组术后清醒 时的 OFW分值为0；术后第1周两组间OFW分值比较，P<0.05，术后第2、3、4 ，周两组间OFW分值比较P<0.01(表1)。
1.2 倾斜板(IP)评分：正常对照组双后肢IP分值为55°左右；NS组和L-NNA组术后第2 、3、4周IP评分比较P<0.01(表2)。
表1 大鼠脊髓损伤后0～4周OFW评分(
±s)Table 1 OFW score of rat spinal cord injury 0-4 weeks(
±s) 组别/时间(周), 百拇医药
group/time(we ek)
1
2
3
4
N S
1.66±0.72
2.53±0.51
3.01±0.84
3.13±0.83
L-NNA
2.19±0.75*
, http://www.100md.com
3.56 ± 0.47**
4.00±0.36**
4.06±0.44 *
*P<0.05； **P<0.01表2 大鼠脊髓损伤后0～4周IP评分(
±s)Table 2 IP score of rat spinal cord injury 0-4 weeks(
±s) 组别/时间(周)group/time(we ek)
, 百拇医药 1
2
3
4
N S
28.02±3.29
32.35±3.69
36.62±3.97
38.49 ±4.42
L-NNA
31.09±4.06*
37.4 4± 4.39**
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42.54±4.49**
46.23±5.1 9**
*P<0.05； **P<0.01
2.NADPHd组织化学染色
正常对照组脊髓NOS阳性神经元多见于后角浅层、中央管周围外侧柱，偶见后角深层、前角 和白质。NOS阳性神经元胞体及其突起染成浅蓝色，与L-NNA组脊髓NOS阳性神经元染色光密 度比较P>0.05(表3)。NS组脊髓NOS阳性神经元数量明显增多，多数神经 元胞体及其突起呈深蓝色(图1)。L-NNA组脊髓NOS阳性神经元染色明显弱于NS组(图2)，两 组间染色光密度比较P<0.05(表4)。表3 正常对照组(NC)与L-NNA组脊髓神经元
NOS染色光密度比较(
±s), 百拇医药
Table 3 The comparison of photosensity of spinal cord neurona l NOS in normal control group with L-NNA group(
±s) 组 别(group)神 经元(neuron)NOS
NC
74.35±1.67
L-NNA
76.41±1.43*
*P>0.05
表4 脊髓损伤后4周神经元NOS染色光密度比较(
±s), http://www.100md.com
Table 4 The comparison of photosensity of neuronal
NOS of spinal cord injury four weeks(
± s) 组 别(group)神经元(neuron)NOS
NC
89.23±1.68
L-NNA
76.41±1.43*
*P<0.05
3.Nissl染色
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正常对照组脊髓神经元胞体内Nissl体呈蓝色的颗粒或斑块状，此类神经元多见于脊髓后角 浅层、中央管周围和外侧柱。NS组脊髓多数神经元Nissl体出现移位，减少，甚至消失(图6) 。L-NNA组脊髓多数神经元Nissl体尚存在，其分布部位及染色光密度与正常对照组比较 无显著差异(表5)，但与NS组比较，其染色光密度较高P<0.05(图4，表6 )。表5 L-NNA组与正常对照组Nissl body光密度比较(
±s)Table 5 The comparison of the photosensity of Nissl bodies in L-NNA group with normal control (NC) group (
±s) 组 别(group)neuronal Nissl body
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NC
78.34±3.47
L-NNA
80.25±3.22*
*P>0.05
表6 L-NNA组与NS组Nissl body光密度比较(
±s)Table 6 The comparison of the photosensity
of Nissl bodies in L-NNA group with NS group (
±s) 组 别(group), 百拇医药
n euronal Nissl body
NS
58.74±2.95
L-NNA
80.25±3.22*
*P<0.05
4.脊髓超微结构
正常对照组脊髓神经元胞核规则，核膜清晰；胞质中的线粒体、粗面内质网及高尔基复合体 等细胞器数量较多，神经纤维及髓鞘规则(图5)。NS组脊髓多数神经元出现多种异样改变， 主要表现为细胞核变形、胞质内出现空泡，尤其明显的是髓鞘严重变形，部分髓鞘松散呈网 状，常伴有呈块状的高电子密度沉积物(图6)。L-NNA组脊髓神经元及其神经纤维结构类似 正常对照组，偶见变形的髓鞘(图7)。
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讨 论
长期以来，人们致力于建立与自然脊髓损伤尽可能相似的模型。已有的急性实验性脊髓损伤 模型可分为脊髓横断伤和挫伤两种。本实验采用的是挫伤模型--重物下落冲击损伤模型， 因为这种模型与脊髓横断(部分或完全)更接近临床急性脊髓损伤[4]。为了得到满 意的 损伤效果而又不致损伤过重而引起动物死亡，我们选择了不完全性(218gcf)脊髓损伤模型。
近年来的研究表明，NO在脊髓继发性损害过程中发挥着重要作用。脊髓损伤后因NO过重合成 而具有神经毒性作用，可导致神经元特别是运动神经元死亡[5]。据报道，在CNS内 ，血 管内皮细胞源结构型NOS(ecNOS)早期激活所产生的NO是舒张血管，维持损伤区血流量，减少 血栓形成的重要因素，发挥神经保护作用。而CNS损伤后由神经细胞结构型NOS(ncNOS)和小 胶质细胞诱导型NOS(iNOS)合成的过量NO具有神经毒性 作用[6]。Hamada等[7]在实验中证实，脊髓损伤后cNOS mRNA表达并没有 变化，而i NOS mRNA表达则明显增强，24h后达最高值，提示iNOS mRNA在脊髓损伤后的神经毒性作用中 发挥关键调节作用。
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由于NO是半衰期很短(仅1～5s)的不稳定气体活性分子，难以直接测定，因此常用NADPHd显 示NOS以间接表示NO合成量。我们应用此法发现，NS组脊髓NOS阳性神经元的数量和染色光 密度均明显增强，与其他各种脊髓损伤导致的NOS阳性神经元的改变相类似。L-N NA治疗组脊髓神经元NOS染色光密度明显低于NS组，接近正常对照组，表明L-NNA的持续应 用可有效地抑制NOS合成NO，从而减轻脊髓继发性损害，有利于神经元功能恢复。
Nissl体为神经元的特征性的光镜结构，因此神经元损伤后其胞体形态变化最显著的是Nissl 体，如Nissl体移位、溶解、甚至消失。本实验显示，L-NNA组脊髓神经元Nissl体改变与正 常对照组比较无显著差异，表明神经元功能恢复良好。
至目前为止，使用NOS抑制剂治疗急性脊髓损伤后的超微结构研究尚未见报道。我们的研究 发现NS组出现的神经元胞核变形、胞质内空泡，尤其明显的是髓 鞘严重变形，部分髓鞘呈现线团样改变 及块状高电子密度沉积物等现象，在L-NNA治疗组则很少见到，从而进一步证实L-NNA对于 促进受损神经元的结构恢复具有一定的作用，其详细机制有待进一步研究。
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图1 NS组脊髓可见深蓝色强阳性反应的NOS 神经元。NADPHd组织化学染色 ×40
图2 L-NNA组脊髓可见浅蓝色阳性反应的NOS神经元。NA DPHd组织化学染色 ×40
图3 NS组脊髓神经元Nissl体消失。Nissl法，甲苯胺蓝 染色 ×40
图4 L-NNA组脊髓神经元Nissl体呈蓝紫色的颗粒或斑 块。Nissl法，甲苯胺蓝染色 ×40
图5 正常对照组脊髓神经元及其髓鞘。透射电镜，铅铀染色 ×4 000
图6 NS组脊髓呈网状变性的髓鞘。透射电镜，铅铀染色 ×6 000
图7 L-NNA组脊髓神经元的髓鞘。透射电镜，铅铀染色 ×4 000
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Fig.1 The NOS positive neurons of spinal cord were stained dark blue in NS group ,NADPHd histohemistry ×40
Fig.2 The NOS positive neurons of spinal cord were stained light blue in L-NNA group.NADPHd histochemistry ×40
Fig.3 Neuronal Nissl bodies of spinal cord were vanish in NS grorp.Nissl method, toluidine blue stain ×40
Fig.4 Neuronal Nissl bodies of spinal cord were stained light blue in L-NNA g roup.Nissl method,toluidine blue stain ×40
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Figs.5-7 Transmission electron microscopy (TEM),lead and uranium stain
Fig.5 Neurons and myelin sheath of spinal cord in normal group ×4 000
Fig.6 Retiform myelin sheath with compact substance of spinal cord in NS group ×6 000
Fig.7 Myelin sheath of spinal cord neurons in L-NNA group ×4 000
【作者简介】刘德明(1951—)，男(汉族)，湖北省人，医学博士，副教授 ，教研室副主任
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参考文献
[1]Malinski T,Balley F,Zhang ZG,et al.Nitric oxide me asured by a porphyrinic m icrosensor in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion[J].J Cerebral Blood Metab, 1993,13(2):355-375.
[2]Wu W.Expression of nitric oxide synthase(NOS)in injured CNS neurons as shown by NADPHd histochemistry[J].Exp Neurol, 1993 120(4):153-158.
[3]Dawson VL,Dawson TM,Bartly DA,et al.Mechanism of nitric oxide mediat ed neurotoxicity in primary brain cultures[J].J Neurosci,1993,13(6):265-267.
, 百拇医药
[4]郭世绂，胥少汀.脊髓损伤基础与临床[M].北京：人民卫生出版社，1993： 131～140.
[5]Wu Y,Li Y,Liu H,et al.Induction of nitric oxide synthase and motoneu ron dea th in newborn and early postnatal rats following spinal root avulsion[J].Neuro sci Lett, 1995, 194(4):109-111.
[6]Hu WH,Li F,Qiang WA,et al.Dural role for nitric oxide in dynorphin s pinal neurotoxicity[J].J Neurotrauma, 1999,16(1):85-89.
[7]Hamada Y, Ikata T,Katoh S,et al. Role of nitric oxide in compressio n in jury of rat spinal cord[J].Free Radic Biol Med, 1996,20(3):1-3.
【收稿日期】2000-06-27 【修回日期】2000-07-17, http://www.100md.com