PCR-SSCP对几种恶性肿瘤p53基因突变的筛检
作者：丁晓华 杨红霞 邱晓萍 伍欣星
单位：丁晓华 邱晓萍 伍欣星 湖北医科大学病毒研究所分子生物室(武汉，430071)；杨红霞 湖北医科大学附属第一医院麻醉科
关键词：p53基因；突变；聚合酶链反应；结肠肿瘤；肺肿瘤
癌症99zk67
中图号：R73534文献标识码：B
文章编号：1000-467X(1999)s0-0146-02
p53基因是一种肿瘤抑制基因，已证明正常p53基因能降低细胞癌变的可能性，p53基因失活与相当多的人类肿瘤有关，这主要表现为p53基因的突变和缺失〔1，2〕。
目前，分析基因突变常用的方法有序列分析法，PCR限制性酶谱分析法，PCR-寡核苷酸探针杂交法，聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)法。其中PCRSSCP能分析某一基因多位点的基因突变，而且操作简便，是一种理想的分析p53基因点突变的方法。但在实验中仍存在许多问题，如PCR产物变性方法，电泳条件，单链带的显色方法，结果判断等存在许多不稳定因素〔3，4〕。本文报道采用碱变性、溴化已淀染色的PCRSSCP分析方法，操作简便，结果稳定，重复性较好。
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1材料和方法
1.1肿瘤样品及肿瘤组织DNA提取
结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌样品取自湖北医科大学附一医院手术室。为手术切除的中晚期肿瘤标本，经病理检查证实。取少量组织，按酚/氯仿法常规提取高分子量DNA。
1.2PCR扩增p53基因DNA片段
PCR扩增引物分别为外显子5，6，外显子7，外显子8。引物委托中科院上海细胞生物学所合成。
PCR反应总体积为50μl，10×PCR缓冲液5μl，4种dNTP200μmol/L，primer1，2各35pmle，组织DNA0.1～0.5μg,95℃变性5min，加TagDNA聚合酶2U，覆盖石腊油50μl。Exon5,6循环参数为92.5℃1min，61℃1min，72℃2min；Exon7,8循环参数为92.5℃1min，55℃，1min，72℃1min，循环35次，最后于72℃保温10min。
, 百拇医药
exon5,6 primer1 5’GGAATTCTCCTCTTCCTGCAGTACTC3’
primer2 5’GGAATTCAAACCAGACCTCAGGCGGCT3’
exon7 primer1 5’TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC3’
primer2 5’CAAGTGGCTCCTGACCTGGA3’
exon8 primer1 5’CCTATCCTGAGTAGTGGTAA3’
primer2 5’GTCCTGCTTGCTTACCTCG3’
1.3SSCP分析
取PCR扩增产物10μl，加2μl碱变性液(0.5mol/LNaOH，10mmol/LEDTA)，于55℃变性5min，另取10μlPCR产物不变性对照，在加样前加6×上样缓冲液(30%甘油，0.025%二甲苯蓝，0.025%溴酚蓝)。常规制备8%聚丙烯酰胺凝胶垂直板，300V电泳2～4小时，取出凝胶及玻板，置于0.5mg/ml溴化乙淀中染色30分钟，紫外灯下观察。
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2结果
对结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌p53外显子5，6，7，8，分别进行PCR扩增，均可得到特异的DNA扩增带，外显子5，6为416bp，外显子7为133bp，外显子8为168bp，PCR产物量达1～2μg，无非特异性扩增产物(见图1)。双链PCR产物经变性后，聚丙烯酰胺凝胶电泳，可得到三种异常的迁移带型。一是两条单链带与正常对照组比较皆发生迁移，二是多出一条单链带，三是多出二条单链带(见图2)，这些都为异常的单链DNA迁移，判断为p53相应外显子发生了碱基改变，几种肿瘤p53基因外显子5，6，7，8的异常迁移见下表。
图1 肿瘤样品p53基因外显子8的扩增产物琼脂糖凝胶电泳
M.pGEM-7Zf/HaeⅢ分子量标准
1～3肺癌组织样品
4～5卵巢癌组织样品
, 百拇医药
图2 p53基因外显子8扩增片段的
SSCP分析聚丙烯酰胺凝胶电泳
M.pGEM-7Zf/HaeⅢ分子量标准
1，2，4，5p53基因外显子8的两条正常电泳单链带型。
3.发生迁移变化的p53基因电泳单链带型
几种肿瘤样品p53基因突变的分析结果
样品
总例数
exon5,6
exon7
exon8
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迁移改变率(%)
结肠癌
13
5
2
3
76.9
胃癌
22
3
4
5
54.5
肺癌
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16
1
2
7
62.5
卵巢癌
50
5
10
9
48.0
3讨论
近年来的研究表明，野生型p53基因促地细胞周期的停滞、分化和凋亡，有抑制肿瘤细胞发生的能力。p53基因的功能异常有可能导致细胞的异常增殖〔1，5〕。
, 百拇医药
我们应用PCR-SSCP分析胃癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌p53基因的突变。PCR产物变性后进行中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，一些病例可见两条单链DNA皆发生迁移，表明为纯合子突变，两条p53等位基因相应外显子皆发生突变，第二种是多出一条或两条单链带型，这可能有两种情况，一是杂合型突变，即p53只有一条等位基因发生突变，第二是所取组织中除癌组织外，也有相当A?的正常细胞，正常细胞p53基因未发生突变，故其变性单链带中除含有一突变p53基因外，也含有野生型p53基因，形成杂合的单链DNA带型。
分析发现p53基因外显子5，6，7，8的突变在结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌中都较高，分别为76.9%、54.5%、62.5%、48%，表明p53基因突变为这些恶性肿瘤发生中的常见事件，在这些恶性肿瘤发生发展的某一阶段起作用。
我们这一研究旨在建立筛检常见恶性肿瘤p53基因突变的方法，对部分临床资料全的病例，可进一步分析p53基因突变与肿瘤恶性程度，病人预后的关系。探讨检测p53基因突变在临床实际应用中的价值。
, 百拇医药
〔参考文献〕
1 Gottlieb T.M Oren M,et al.p53 in growth control and neoplasia〔J〕 .Biochimica et Biophsia Acta,1996,1287:77.
2 Semeshica Y,Matsuno Y,Hirohashis et al.Alterations of the p53 gene are common and critical events for the maintenance of malignant phenotypes in small-cell lung carcinome〔J〕 .Oncogene,1992,7:451.
3 Uchino S,Noguchi M,Ochiai A,et al.p53 mutation in gastric cancer: A genetic model for carcinogenesis is common to gastric and colorectal cancer〔J〕 . Int . J. Cancer,1993,54:759.
4 王宝成，师秋丽，狄剑时等.非同位素方法检测卵巢癌组织p53基因的改变〔J〕.中华医学检验杂志，1995，18：199.
5 Frebourg T,Friend S H,et al.The importance of p53 gene alterrations in human cancer.Is there more than circumstantial evidence 〔J〕 .J.of National Cancer Institute,1993,85:1544.
收稿日期：1997-05-13；修回日期：1997-12-15, 百拇医药
单位：丁晓华 邱晓萍 伍欣星 湖北医科大学病毒研究所分子生物室(武汉，430071)；杨红霞 湖北医科大学附属第一医院麻醉科
关键词：p53基因；突变；聚合酶链反应；结肠肿瘤；肺肿瘤
癌症99zk67
中图号：R73534文献标识码：B
文章编号：1000-467X(1999)s0-0146-02
p53基因是一种肿瘤抑制基因，已证明正常p53基因能降低细胞癌变的可能性，p53基因失活与相当多的人类肿瘤有关，这主要表现为p53基因的突变和缺失〔1，2〕。
目前，分析基因突变常用的方法有序列分析法，PCR限制性酶谱分析法，PCR-寡核苷酸探针杂交法，聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)法。其中PCRSSCP能分析某一基因多位点的基因突变，而且操作简便，是一种理想的分析p53基因点突变的方法。但在实验中仍存在许多问题，如PCR产物变性方法，电泳条件，单链带的显色方法，结果判断等存在许多不稳定因素〔3，4〕。本文报道采用碱变性、溴化已淀染色的PCRSSCP分析方法，操作简便，结果稳定，重复性较好。
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1材料和方法
1.1肿瘤样品及肿瘤组织DNA提取
结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌样品取自湖北医科大学附一医院手术室。为手术切除的中晚期肿瘤标本，经病理检查证实。取少量组织，按酚/氯仿法常规提取高分子量DNA。
1.2PCR扩增p53基因DNA片段
PCR扩增引物分别为外显子5，6，外显子7，外显子8。引物委托中科院上海细胞生物学所合成。
PCR反应总体积为50μl，10×PCR缓冲液5μl，4种dNTP200μmol/L，primer1，2各35pmle，组织DNA0.1～0.5μg,95℃变性5min，加TagDNA聚合酶2U，覆盖石腊油50μl。Exon5,6循环参数为92.5℃1min，61℃1min，72℃2min；Exon7,8循环参数为92.5℃1min，55℃，1min，72℃1min，循环35次，最后于72℃保温10min。
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exon5,6 primer1 5’GGAATTCTCCTCTTCCTGCAGTACTC3’
primer2 5’GGAATTCAAACCAGACCTCAGGCGGCT3’
exon7 primer1 5’TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC3’
primer2 5’CAAGTGGCTCCTGACCTGGA3’
exon8 primer1 5’CCTATCCTGAGTAGTGGTAA3’
primer2 5’GTCCTGCTTGCTTACCTCG3’
1.3SSCP分析
取PCR扩增产物10μl，加2μl碱变性液(0.5mol/LNaOH，10mmol/LEDTA)，于55℃变性5min，另取10μlPCR产物不变性对照，在加样前加6×上样缓冲液(30%甘油，0.025%二甲苯蓝，0.025%溴酚蓝)。常规制备8%聚丙烯酰胺凝胶垂直板，300V电泳2～4小时，取出凝胶及玻板，置于0.5mg/ml溴化乙淀中染色30分钟，紫外灯下观察。
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2结果
对结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌p53外显子5，6，7，8，分别进行PCR扩增，均可得到特异的DNA扩增带，外显子5，6为416bp，外显子7为133bp，外显子8为168bp，PCR产物量达1～2μg，无非特异性扩增产物(见图1)。双链PCR产物经变性后，聚丙烯酰胺凝胶电泳，可得到三种异常的迁移带型。一是两条单链带与正常对照组比较皆发生迁移，二是多出一条单链带，三是多出二条单链带(见图2)，这些都为异常的单链DNA迁移，判断为p53相应外显子发生了碱基改变，几种肿瘤p53基因外显子5，6，7，8的异常迁移见下表。
图1 肿瘤样品p53基因外显子8的扩增产物琼脂糖凝胶电泳
M.pGEM-7Zf/HaeⅢ分子量标准
1～3肺癌组织样品
4～5卵巢癌组织样品
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图2 p53基因外显子8扩增片段的
SSCP分析聚丙烯酰胺凝胶电泳
M.pGEM-7Zf/HaeⅢ分子量标准
1，2，4，5p53基因外显子8的两条正常电泳单链带型。
3.发生迁移变化的p53基因电泳单链带型
几种肿瘤样品p53基因突变的分析结果
样品
总例数
exon5,6
exon7
exon8
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迁移改变率(%)
结肠癌
13
5
2
3
76.9
胃癌
22
3
4
5
54.5
肺癌
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16
1
2
7
62.5
卵巢癌
50
5
10
9
48.0
3讨论
近年来的研究表明，野生型p53基因促地细胞周期的停滞、分化和凋亡，有抑制肿瘤细胞发生的能力。p53基因的功能异常有可能导致细胞的异常增殖〔1，5〕。
, 百拇医药
我们应用PCR-SSCP分析胃癌、结直肠癌、肺癌、卵巢癌p53基因的突变。PCR产物变性后进行中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，一些病例可见两条单链DNA皆发生迁移，表明为纯合子突变，两条p53等位基因相应外显子皆发生突变，第二种是多出一条或两条单链带型，这可能有两种情况，一是杂合型突变，即p53只有一条等位基因发生突变，第二是所取组织中除癌组织外，也有相当A?的正常细胞，正常细胞p53基因未发生突变，故其变性单链带中除含有一突变p53基因外，也含有野生型p53基因，形成杂合的单链DNA带型。
分析发现p53基因外显子5，6，7，8的突变在结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌中都较高，分别为76.9%、54.5%、62.5%、48%，表明p53基因突变为这些恶性肿瘤发生中的常见事件，在这些恶性肿瘤发生发展的某一阶段起作用。
我们这一研究旨在建立筛检常见恶性肿瘤p53基因突变的方法，对部分临床资料全的病例，可进一步分析p53基因突变与肿瘤恶性程度，病人预后的关系。探讨检测p53基因突变在临床实际应用中的价值。
, 百拇医药
〔参考文献〕
1 Gottlieb T.M Oren M,et al.p53 in growth control and neoplasia〔J〕 .Biochimica et Biophsia Acta,1996,1287:77.
2 Semeshica Y,Matsuno Y,Hirohashis et al.Alterations of the p53 gene are common and critical events for the maintenance of malignant phenotypes in small-cell lung carcinome〔J〕 .Oncogene,1992,7:451.
3 Uchino S,Noguchi M,Ochiai A,et al.p53 mutation in gastric cancer: A genetic model for carcinogenesis is common to gastric and colorectal cancer〔J〕 . Int . J. Cancer,1993,54:759.
4 王宝成，师秋丽，狄剑时等.非同位素方法检测卵巢癌组织p53基因的改变〔J〕.中华医学检验杂志，1995，18：199.
5 Frebourg T,Friend S H,et al.The importance of p53 gene alterrations in human cancer.Is there more than circumstantial evidence 〔J〕 .J.of National Cancer Institute,1993,85:1544.
收稿日期：1997-05-13；修回日期：1997-12-15, 百拇医药