聚合酶链反应用于乙肝病毒DNA及性传播疾病病原体检测的诊断价值
作者：成凯
单位：安徽省滁州市医学科学情报所 239058
关键词：聚合酶链反应；酶结合免疫吸附测定；乙肝病毒DNA；性传播疾病
淮海医药00zk25
【中国图书分类号】 R 446
我所在1995年建立了聚合酶链反应(PCR)实验室，几年来通过对门诊患者用PCR技术检测乙肝病毒DNA(HBV-DNA)及性传播疾病(STD)病原体的检测，从而对PCR技术用于上述两项检测方面有了进一步的认识。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 检测对象 ①乙肝患者414例，男261例，女153例，年龄9～72岁。②1996～1999年到我所门诊就诊疑有淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)感染的患者，其中男286例，女209例，为无选择的随机样品(取其宫颈和尿道分泌物做为样品)。
, 百拇医药
1.2 检测试剂 ①PCR试剂盒由中美上海华都生物有限公司提供。②乙肝血清标志物试剂盒为深圳月亮湾生物公司产品。
1.3 检测方法
1.3.1 乙肝患者 ①HBVM检测用酶结合免疫吸附法(ELISA)常规检测HBsAg、HBeAg、抗HBs、抗HBe、抗HBc；②PCR法检测患者血清中HBVDNA，按说明书操作。每例患者血清同时作HBVDNA和HBVM检测。
1.3.2 疑NG、CT、UU感染患者 用消毒棉签插入宫颈口或尿道口，捻转并停留数秒，将标本洗涤液12 000 r/min离心5 min去上清液后按PCR法常规操作。
2 结果
见表1和表2。
表1 PCR与ELISA检测HBVM的比较 HBVM
, 百拇医药
例数
PCR阳性例数
HBV-DNA阳性率(%)
HBsAg(+)
HBeAg(+)
抗HBc(+)
126
121
96
HBsAg(+)
抗HBe(+)
抗HBc(+)
, 百拇医药
165
102
61.81
HBsAg(+)
抗HBc(+)
61
36
59
HBsAg(+)
余(-)
29
10
34.44
, 百拇医药
HBVM全阴
33
4
12.12
合 计
414
273
52.67
表2 PCR检测NG、CT、UU结果 病原体
检测例数
阳性例数
阳性率(%)
NG
, 百拇医药
395
67
16.96
CT
210
32
15.23
UU
153
33
21.56
合计
758
, 百拇医药
132
17.91
3 讨论
3.1 PCR检测HBVDNA与HBVM比较
3.1.1 PCR用于诊断乙型肝炎(乙肝)的优点 ELISA检测是标型指标，提供HBV感染的间接证据，一般认为HBeAg阴转，抗HBe出现为HBV复制减弱或停止，当抗HBs出现表明HBV感染结束，二对半均阴性多认为可除外乙肝诊断。但本组抗HBe出现，PCR检测HBVDNA阳性率61.81%，二对半均阴HBVDNA阳性为12.12%，说明病毒仍继续存在，这一结果提示我们应重新认识HBV感染及血清标志物的意义。PCR技术可直接检测到10-5Pg的HBVDNA，甚至一个病毒颗粒，较目前用的血清标志物ELISA法更敏感，是早期诊断HBV感染的最有效手段[1]。并且在HBV宫内感染诊断方面，随着PCR技术的开展应用。检出率大大提高。以往文献报道HBV宫内感染率低，一般在5%～15%，钟铃等[2]报道用PCR检测HBV宫内感染检出率高达66.7%，认为PCR检测HBVDNA是预测HBV宫内感染最直接最可靠的指标。
, 百拇医药
3.1.2 PCR用于诊断HBV感染存在问题 定性PCR阳性从病毒角度说明HBV感染的存在，但不能进一步说明感染的活动程度和病毒的复制状况(如：只检出HBsAb，表明处于恢复期)，因此必须结合病理、临床表现和HBVM，作出合理的解释和判断。目前国际上已较多地采用定量PCR方法，它比定性PCR更能准确反映出患者体内HBVDNA水平，并有效地应用于药物治疗对象的筛选，治疗中HBVDNA的动态测定。目前HBVDNA的PCR试剂的生产厂商较多，国内尚无标准试剂，质量差异较大，影响临床判断的准确性。同时PCR检测虽有较高的特异性，灵敏性，但因其实验环境操作技术均要求较高，不适于临床大量初筛检查。
3.2 PCR在诊断STD中的应用
3.2.1 PCR检测STD病原体 目前，国家重点防治的8种STD均依赖于血清学、病原体分离培养及组织病理学等作出常规诊断。例如，培养法一直被当作检测淋球菌的金标准，特异性为100%，但其敏感性受取材、患者是否治疗及培养条件等因素的影响，阳性率约75%～85%[3]。PCR检测淋球菌比培养法更敏感、更可行。近年来的国内外文献表明，与细胞培养，原位杂交等方法比较，PCR检测STD病原体的敏感性和特异性极高[4]。对于无症状的早期STD患者、病原体携带者或轻症患者，PCR检测由于样品过程简单，操作易行，所以更为有用。
, 百拇医药
3.2.2 PCR诊断STD的局限性 PCR本身存在难以避免的局限性和某些不足，如判断结果时背景模糊，常有非特异性条带干扰等。PCR反应具有高度的灵敏性，其实验环境、操作技术均要求较高。由于各地的条件不一，影响因素很多，容易产生假阳性或假阴性结果，外源性DNA污染，即使是极微量的污染，如实验过程中PCR产物的污染及样品采集和处理过程中的交叉污染等，容易产生假阳性结果。国外在PCR技术基础上，做了许多改进，除在操作各个步骤中严格控制污染外，改一次性PCR为套式PCR(Nested PCR)，有助于结果的判断。套式PCR虽然灵敏度更高，但由于进行2次扩增反应，极少量交叉污染即可出现假阳性结果，特别是进行大规模标本的检测时，扩增物的污染有时很难避免。且此法操作繁杂，在临床应用上受到一定的限制。
3.2.3 PCR对STD诊断价格的评估 传统STD实验室诊断方法有其明显的优越性，如梅毒血清学试验仍是目前推荐的常规方法，不仅可以确定感染而且有助于疗效判定；淋球菌和衣原体培养是WHO目前推荐的筛查淋病患者的唯一方法和诊断衣原体感染的金标准，所以PCR的诊断是一严肃的课题，它关系到社会和家庭的稳定，特别是对艾滋病(AIDS)的诊断更要求客观准确，所以对STD患者的诊断不能完全依赖于PCR结果。PCR结果阳性便诊断为STD是一种误区。
, 百拇医药
总之，PCR技术具备操作简便、快速、灵敏等特点，但也存在较高比率的假阳性和假阴性，目前缺乏其它更好的方法来证实或排除。因此，实际工作中对PCR技术的优点和不足要有充分的认识。随着PCR技术自身的完善和发展，以及PCR试剂和标化，它将在医学微生物的研究领域得到更为广泛的应用。
参考文献
1，戴利成.PCR技术及其在乙型肝炎诊断中的应用.中级医刊，1998，33(9)：13
2，钟 铃，廖洪波，胡丽娜，等.应用PCR检测HBV的宫内传播.中华妇产科杂志，1995，30(9)：553
3，朱慧兰，武明昌，曹文铃，等.聚合酶链反应在淋病诊断及随访中的意义.临床荟萃，1999，14(19)：891
4，范雪莉，刘玉峰.用PCR诊断性传播性疾病及其误区.临床检验杂志，1998，16(2)：113
(收稿：2000-05-13), http://www.100md.com
单位：安徽省滁州市医学科学情报所 239058
关键词：聚合酶链反应；酶结合免疫吸附测定；乙肝病毒DNA；性传播疾病
淮海医药00zk25
【中国图书分类号】 R 446
我所在1995年建立了聚合酶链反应(PCR)实验室，几年来通过对门诊患者用PCR技术检测乙肝病毒DNA(HBV-DNA)及性传播疾病(STD)病原体的检测，从而对PCR技术用于上述两项检测方面有了进一步的认识。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 检测对象 ①乙肝患者414例，男261例，女153例，年龄9～72岁。②1996～1999年到我所门诊就诊疑有淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)感染的患者，其中男286例，女209例，为无选择的随机样品(取其宫颈和尿道分泌物做为样品)。
, 百拇医药
1.2 检测试剂 ①PCR试剂盒由中美上海华都生物有限公司提供。②乙肝血清标志物试剂盒为深圳月亮湾生物公司产品。
1.3 检测方法
1.3.1 乙肝患者 ①HBVM检测用酶结合免疫吸附法(ELISA)常规检测HBsAg、HBeAg、抗HBs、抗HBe、抗HBc；②PCR法检测患者血清中HBVDNA，按说明书操作。每例患者血清同时作HBVDNA和HBVM检测。
1.3.2 疑NG、CT、UU感染患者 用消毒棉签插入宫颈口或尿道口，捻转并停留数秒，将标本洗涤液12 000 r/min离心5 min去上清液后按PCR法常规操作。
2 结果
见表1和表2。
表1 PCR与ELISA检测HBVM的比较 HBVM
, 百拇医药
例数
PCR阳性例数
HBV-DNA阳性率(%)
HBsAg(+)
HBeAg(+)
抗HBc(+)
126
121
96
HBsAg(+)
抗HBe(+)
抗HBc(+)
, 百拇医药
165
102
61.81
HBsAg(+)
抗HBc(+)
61
36
59
HBsAg(+)
余(-)
29
10
34.44
, 百拇医药
HBVM全阴
33
4
12.12
合 计
414
273
52.67
表2 PCR检测NG、CT、UU结果 病原体
检测例数
阳性例数
阳性率(%)
NG
, 百拇医药
395
67
16.96
CT
210
32
15.23
UU
153
33
21.56
合计
758
, 百拇医药
132
17.91
3 讨论
3.1 PCR检测HBVDNA与HBVM比较
3.1.1 PCR用于诊断乙型肝炎(乙肝)的优点 ELISA检测是标型指标，提供HBV感染的间接证据，一般认为HBeAg阴转，抗HBe出现为HBV复制减弱或停止，当抗HBs出现表明HBV感染结束，二对半均阴性多认为可除外乙肝诊断。但本组抗HBe出现，PCR检测HBVDNA阳性率61.81%，二对半均阴HBVDNA阳性为12.12%，说明病毒仍继续存在，这一结果提示我们应重新认识HBV感染及血清标志物的意义。PCR技术可直接检测到10-5Pg的HBVDNA，甚至一个病毒颗粒，较目前用的血清标志物ELISA法更敏感，是早期诊断HBV感染的最有效手段[1]。并且在HBV宫内感染诊断方面，随着PCR技术的开展应用。检出率大大提高。以往文献报道HBV宫内感染率低，一般在5%～15%，钟铃等[2]报道用PCR检测HBV宫内感染检出率高达66.7%，认为PCR检测HBVDNA是预测HBV宫内感染最直接最可靠的指标。
, 百拇医药
3.1.2 PCR用于诊断HBV感染存在问题 定性PCR阳性从病毒角度说明HBV感染的存在，但不能进一步说明感染的活动程度和病毒的复制状况(如：只检出HBsAb，表明处于恢复期)，因此必须结合病理、临床表现和HBVM，作出合理的解释和判断。目前国际上已较多地采用定量PCR方法，它比定性PCR更能准确反映出患者体内HBVDNA水平，并有效地应用于药物治疗对象的筛选，治疗中HBVDNA的动态测定。目前HBVDNA的PCR试剂的生产厂商较多，国内尚无标准试剂，质量差异较大，影响临床判断的准确性。同时PCR检测虽有较高的特异性，灵敏性，但因其实验环境操作技术均要求较高，不适于临床大量初筛检查。
3.2 PCR在诊断STD中的应用
3.2.1 PCR检测STD病原体 目前，国家重点防治的8种STD均依赖于血清学、病原体分离培养及组织病理学等作出常规诊断。例如，培养法一直被当作检测淋球菌的金标准，特异性为100%，但其敏感性受取材、患者是否治疗及培养条件等因素的影响，阳性率约75%～85%[3]。PCR检测淋球菌比培养法更敏感、更可行。近年来的国内外文献表明，与细胞培养，原位杂交等方法比较，PCR检测STD病原体的敏感性和特异性极高[4]。对于无症状的早期STD患者、病原体携带者或轻症患者，PCR检测由于样品过程简单，操作易行，所以更为有用。
, 百拇医药
3.2.2 PCR诊断STD的局限性 PCR本身存在难以避免的局限性和某些不足，如判断结果时背景模糊，常有非特异性条带干扰等。PCR反应具有高度的灵敏性，其实验环境、操作技术均要求较高。由于各地的条件不一，影响因素很多，容易产生假阳性或假阴性结果，外源性DNA污染，即使是极微量的污染，如实验过程中PCR产物的污染及样品采集和处理过程中的交叉污染等，容易产生假阳性结果。国外在PCR技术基础上，做了许多改进，除在操作各个步骤中严格控制污染外，改一次性PCR为套式PCR(Nested PCR)，有助于结果的判断。套式PCR虽然灵敏度更高，但由于进行2次扩增反应，极少量交叉污染即可出现假阳性结果，特别是进行大规模标本的检测时，扩增物的污染有时很难避免。且此法操作繁杂，在临床应用上受到一定的限制。
3.2.3 PCR对STD诊断价格的评估 传统STD实验室诊断方法有其明显的优越性，如梅毒血清学试验仍是目前推荐的常规方法，不仅可以确定感染而且有助于疗效判定；淋球菌和衣原体培养是WHO目前推荐的筛查淋病患者的唯一方法和诊断衣原体感染的金标准，所以PCR的诊断是一严肃的课题，它关系到社会和家庭的稳定，特别是对艾滋病(AIDS)的诊断更要求客观准确，所以对STD患者的诊断不能完全依赖于PCR结果。PCR结果阳性便诊断为STD是一种误区。
, 百拇医药
总之，PCR技术具备操作简便、快速、灵敏等特点，但也存在较高比率的假阳性和假阴性，目前缺乏其它更好的方法来证实或排除。因此，实际工作中对PCR技术的优点和不足要有充分的认识。随着PCR技术自身的完善和发展，以及PCR试剂和标化，它将在医学微生物的研究领域得到更为广泛的应用。
参考文献
1，戴利成.PCR技术及其在乙型肝炎诊断中的应用.中级医刊，1998，33(9)：13
2，钟 铃，廖洪波，胡丽娜，等.应用PCR检测HBV的宫内传播.中华妇产科杂志，1995，30(9)：553
3，朱慧兰，武明昌，曹文铃，等.聚合酶链反应在淋病诊断及随访中的意义.临床荟萃，1999，14(19)：891
4，范雪莉，刘玉峰.用PCR诊断性传播性疾病及其误区.临床检验杂志，1998，16(2)：113
(收稿：2000-05-13), http://www.100md.com