急性肺损伤时肺部纤维化及血管生成状态的研究
李燕芹 吕寒冰 方马荣 刘斌 徐佳波
【关键词】 肺损伤，急性； 肺纤维化； 微血管
已知急性肺损伤(acute lung injury，ALI)可由多种因素诱发，但肺部病变的进展具有共同特征，组织的损伤修复和纤维组织增生是ALI后重要的病理过程，这一过程中损伤和修复在不断进行。近年来研究提示，在肺损伤初期即出现胶原纤维及纤维母细胞活性增加，而纤维母细胞和纤维增生的病理过程可能伴有组织血管生成状态的改变(1)。许多研究已证实，组织的损伤修复大都伴有组织微血管的改变(2)。肺部是一个血管、微血管分布极其丰富的器官，以往对于肺部损伤时微血管方面改变的研究甚少。本研究主要观察ALI时肺部纤维化和微血管的变化。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器设备：油酸化学纯，浙江杭州双林化工试剂厂出品；兔抗大鼠八因子多克隆抗体购于Abcam 公司；Carl Zeiss KS400图像分析仪。
, http://www.100md.com
2 实验动物模型建立及分组：20只健康成年SD大鼠，雌雄不限，体质量为200～250 g，由浙江省实验动物中心提供。采用随机数字表法将大鼠分为生理盐水对照组5只；油酸损伤致ALI组15只，按照损伤后不同时间又分为伤后1、4和7 d 3个亚组，每个亚组各5只。大鼠称重后以体积分数为4%的水合氯醛100 μl/kg腹腔麻醉，于左侧腹股沟处沿股静脉走向斜切口，清晰暴露股静脉、股神经和股动脉。ALI组和对照组分别注入油酸和生理盐水，剂量均为100 μl/kg。
1.3 检测方法
1.3.1 样本处理：将两组大鼠分别于致伤后1、4和7 d麻醉、开胸，观察肺的外观变化；然后放血处死，切下大鼠右肺，浸入体积分数为4%的多聚甲醛中浸泡固定2~3 h，取材，更换4%多聚甲醛4 ℃浸泡过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋制成蜡块。
1.3.2 标本检测
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1.3.2.1 石蜡切片经过苏木素-伊红(HE)染色后，在光镜下观察肺组织病理变化。
1.3.2.2 石蜡切片经Masson改良法进行胶原染色，用Carl Zeiss KS400图像分析仪定量分析肺组织纤维化的程度。每张切片在10倍物镜下观察3个视野中所有阳性染色的区域，计算阳性染色区域面积的总和。
1.3.2.3 石蜡切片用免疫组化方法行八因子相关抗原染色，将蜡块切片、烤片，用胰蛋白酶消化法修复组织活性，用质量分数为0.1%的氯化钙作为溶剂配制成质量分数为01%的胰蛋白酶溶液，将胰蛋白酶溶液滴加在玻片组织上，37 ℃消化20 min。八因子抗体以1∶500稀释，操作严格按照试剂盒说明进行。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。切片染色后，将胞浆呈棕褐色与周围其他组织有明显界限的内皮细胞或内皮细胞串，无论有无管腔，计数为1个血管。先在低倍镜下(×40倍，×100倍)选择内皮细胞染色最多的区域，再在高倍镜(×200倍)下计数这一区域的血管个数，记录3个高倍视野血管数的平均值作为微血管密度。
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1.4 统计学方法：实验结果以均数±标准差(x±s)表示，使用SPSS110软件进行数据分析，显著性比较用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 动物一般情况观察： 模型大鼠股静脉注入油酸后，立即出现呼吸频率增加、呼吸窘迫、粉红色泡沫状痰液溢出、口唇发绀明显等症状，符合ALI表现。
2.2 肺组织病理改变
2.2.1 肉眼观察：油酸损伤1 d组大鼠胸腔内可见有较多血性积液，肺脏明显增大且饱满，肺表面呈深红色，间有粉红色斑纹，气管及肺切面有凝血溢出；4 d和7 d组大鼠肺脏肿胀减轻，可见陈旧性出血灶。
2.2.2 HE染色：油酸损伤1 d组 大鼠有明显的肺间质水肿和肺泡水肿，呈弥漫性炎症细胞浸润，小血管扩张充血，部分肺泡腔内充满渗出物；4 d和7 d组可见肺泡壁明显增厚，炎性细胞浸润，肺间质纤维母细胞增生，肺泡和肺间质水肿，部分切片可见灶状肺不张、肺气肿，高倍镜下可见有大量增生的成纤维细胞。
, 百拇医药
2.2.3 Masson改良法染色(表1)：所染胶原呈绿色，弹性纤维呈亮深红色，肌纤维呈红色。对照组只在大支气管壁周围有较细薄的胶原纤维，无纤维化灶。油酸损伤1 d组肺泡间隔隐约可见绿染物质，但与对照组比较无统计学差异；4 d组肺间质可见明显的纤维化，肺泡间隔可见较大面积的纤维化灶，在支气管壁周围可见粗厚的胶原纤维；7 d组纤维化程度与4 d组相似。
2.2.4 八因子相关抗原染色(表1)：染色结果为胞浆着色，呈棕褐色。油酸致伤后4 d组出现肺部微血管增加，随病程的延长，肺部微血管并未持续增加，而是又降至基线水平。油酸损伤后7 d组与4 d组比较P<0.05。
3 讨 论
以往有关ALI的研究主要集中在急性炎症方面，如各种炎症细胞和细胞因子，而对于损伤炎症的伴随现象-组织的增生与修复方面研究不多。近来已有研究提示在ALI的早期，甚至在损伤的同时可能已开始启动了增生和修复，而此时启动的纤维组织增生可能对于组织的修复并非有利，如能在早期阶段将不利于组织正常修复的因素加以修正，可能会有利于ALI的预后(3-5)。以往认为ALI时纤维组织的增生出现于病变的中后期，但近来的研究提示在ALI的早期就会出现纤维母细胞增生和分泌胶原的活性增强。Marshall等(3)研究发现急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者在发病24 h内血清中和肺泡灌洗液中Ⅲ型前胶原浓度均高于非ARDS患者，且与患者预后有关，即血清中和肺泡灌洗液中Ⅲ型前胶原浓度高的患者病死率较高。本研究从病理组织学上进一步证实在ALI 1 d时肺间质内即可出现散在的纤维组织增生，与对照组之间比较未达到统计学差异，可能与每组动物数量有限有关。4 d时纤维组织增生形成大小不一的纤维灶，纤维的增生会进一步破坏肺泡的正常结构，使肺换气功能出现持续不可逆转的恶化。组织的增生与修复常伴有组织内微血管的变化，国外学者的相关研究提出肺部纤维化与血管生成之间可能有一定关系(6-9)。本实验结果显示，在ALI早期(4 d)，在肺部出现明显纤维组织增生的同期确实存在肺部微血管增加。同时还显示微血管的增生发生在损伤后一定时间；而随着损伤后时间的延长，肺部微血管的增生并非持续进展，而是在增加后又降至基线水平。以往临床研究所获得的临床标本中并未发现有肺部微血管的增生，这可能正是由于临床研究中的绝大多数患者已是病程中晚期，这一时期内肺部微血管的增生已随着肺部纤维化的发生、发展而逐渐减少或消失。
, 百拇医药
参考文献
1 Keane M P,Belperio J A,Burdick M D,et al.ENA-78 is a important angiogenic factor in idiopathic pulmonary fibrosis(J).Am J Respir Crit Care Med,2001,164:2239-2242
2 Henke C,Knighton D,Wick M, et al.Mechanisms of alveolar fibrosis following acute lung injury:presence of angiogenesis bioactirity in the lower respiratory tract(J).Chest,1991,99(3 Suppl):40S
3 Marshall R P,Bellingan G,Webb S,et al. Fibroproliferation occurs early in the acute respiratory distress syndrome and impacts on outcome(J).Am J Respir Crit Care Med,2000,162:1783-1788
, 百拇医药
4 Chesnutt A N,Matthay M A,Tibayan F A,et al.Early detection of type Ⅲ procollagen peptide in acute lung injury, pathogenetic and prognostic significance(J).Am J Respir Crit Care Med,1997,156(3 Pt1):840-845.
5 Deheinzelin D,Jatene F B,Saldiva P H, et al. Upregulation of collagen messenger RNA expression occurs immediately after lung damage(J).Chest,1997,112:1184-1188.
6 Strieter R M,Belperio J A,Keane M P.CXC chemokines in angiogenesis related to pulmonary fibrosis(J).Chest，2002，122(6 Suppl):298S-301S.
, http://www.100md.com
7 Keane M P,Wilke C A,Burdick M D, et al.IFN-gamma-inducible protein-10 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis via inhibition of angiogenesis(J).J Immunol, 1999,163:5686-5692
8 Keane M P,Belperio J A,Arenberg D A, et al. CXC chemokines regulate angiogenic activity in acute lung injury(J).Chest,1999, 116(1 Suppl):93S-94S.
9 Keane M P,Arenberg D A,Lynch J P, et al. The CXC chemokines,IL-8 and IP-10,regulate angiogenic activity in idiopathic pulmonary fibrosis(J).J Immunol,1997,159:1437-1443
作者单位：200127 上海第二医科大学仁济医院呼吸内科(李燕芹，刘斌，徐佳波)；浙江大学医学院解剖与组织胚胎教研室(吕寒冰，方马荣)
作者简介：李燕芹(1966-)，女(汉族)，山西省太原市人，医学博士，副主任医师，上海市医学会呼吸学会青年委员，主要研究方向为呼吸衰竭。, 百拇医药
【关键词】 肺损伤，急性； 肺纤维化； 微血管
已知急性肺损伤(acute lung injury，ALI)可由多种因素诱发，但肺部病变的进展具有共同特征，组织的损伤修复和纤维组织增生是ALI后重要的病理过程，这一过程中损伤和修复在不断进行。近年来研究提示，在肺损伤初期即出现胶原纤维及纤维母细胞活性增加，而纤维母细胞和纤维增生的病理过程可能伴有组织血管生成状态的改变(1)。许多研究已证实，组织的损伤修复大都伴有组织微血管的改变(2)。肺部是一个血管、微血管分布极其丰富的器官，以往对于肺部损伤时微血管方面改变的研究甚少。本研究主要观察ALI时肺部纤维化和微血管的变化。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器设备：油酸化学纯，浙江杭州双林化工试剂厂出品；兔抗大鼠八因子多克隆抗体购于Abcam 公司；Carl Zeiss KS400图像分析仪。
, http://www.100md.com
2 实验动物模型建立及分组：20只健康成年SD大鼠，雌雄不限，体质量为200～250 g，由浙江省实验动物中心提供。采用随机数字表法将大鼠分为生理盐水对照组5只；油酸损伤致ALI组15只，按照损伤后不同时间又分为伤后1、4和7 d 3个亚组，每个亚组各5只。大鼠称重后以体积分数为4%的水合氯醛100 μl/kg腹腔麻醉，于左侧腹股沟处沿股静脉走向斜切口，清晰暴露股静脉、股神经和股动脉。ALI组和对照组分别注入油酸和生理盐水，剂量均为100 μl/kg。
1.3 检测方法
1.3.1 样本处理：将两组大鼠分别于致伤后1、4和7 d麻醉、开胸，观察肺的外观变化；然后放血处死，切下大鼠右肺，浸入体积分数为4%的多聚甲醛中浸泡固定2~3 h，取材，更换4%多聚甲醛4 ℃浸泡过夜，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋制成蜡块。
1.3.2 标本检测
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1.3.2.1 石蜡切片经过苏木素-伊红(HE)染色后，在光镜下观察肺组织病理变化。
1.3.2.2 石蜡切片经Masson改良法进行胶原染色，用Carl Zeiss KS400图像分析仪定量分析肺组织纤维化的程度。每张切片在10倍物镜下观察3个视野中所有阳性染色的区域，计算阳性染色区域面积的总和。
1.3.2.3 石蜡切片用免疫组化方法行八因子相关抗原染色，将蜡块切片、烤片，用胰蛋白酶消化法修复组织活性，用质量分数为0.1%的氯化钙作为溶剂配制成质量分数为01%的胰蛋白酶溶液，将胰蛋白酶溶液滴加在玻片组织上，37 ℃消化20 min。八因子抗体以1∶500稀释，操作严格按照试剂盒说明进行。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。切片染色后，将胞浆呈棕褐色与周围其他组织有明显界限的内皮细胞或内皮细胞串，无论有无管腔，计数为1个血管。先在低倍镜下(×40倍，×100倍)选择内皮细胞染色最多的区域，再在高倍镜(×200倍)下计数这一区域的血管个数，记录3个高倍视野血管数的平均值作为微血管密度。
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1.4 统计学方法：实验结果以均数±标准差(x±s)表示，使用SPSS110软件进行数据分析，显著性比较用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 动物一般情况观察： 模型大鼠股静脉注入油酸后，立即出现呼吸频率增加、呼吸窘迫、粉红色泡沫状痰液溢出、口唇发绀明显等症状，符合ALI表现。
2.2 肺组织病理改变
2.2.1 肉眼观察：油酸损伤1 d组大鼠胸腔内可见有较多血性积液，肺脏明显增大且饱满，肺表面呈深红色，间有粉红色斑纹，气管及肺切面有凝血溢出；4 d和7 d组大鼠肺脏肿胀减轻，可见陈旧性出血灶。
2.2.2 HE染色：油酸损伤1 d组 大鼠有明显的肺间质水肿和肺泡水肿，呈弥漫性炎症细胞浸润，小血管扩张充血，部分肺泡腔内充满渗出物；4 d和7 d组可见肺泡壁明显增厚，炎性细胞浸润，肺间质纤维母细胞增生，肺泡和肺间质水肿，部分切片可见灶状肺不张、肺气肿，高倍镜下可见有大量增生的成纤维细胞。
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2.2.3 Masson改良法染色(表1)：所染胶原呈绿色，弹性纤维呈亮深红色，肌纤维呈红色。对照组只在大支气管壁周围有较细薄的胶原纤维，无纤维化灶。油酸损伤1 d组肺泡间隔隐约可见绿染物质，但与对照组比较无统计学差异；4 d组肺间质可见明显的纤维化，肺泡间隔可见较大面积的纤维化灶，在支气管壁周围可见粗厚的胶原纤维；7 d组纤维化程度与4 d组相似。
2.2.4 八因子相关抗原染色(表1)：染色结果为胞浆着色，呈棕褐色。油酸致伤后4 d组出现肺部微血管增加，随病程的延长，肺部微血管并未持续增加，而是又降至基线水平。油酸损伤后7 d组与4 d组比较P<0.05。
3 讨 论
以往有关ALI的研究主要集中在急性炎症方面，如各种炎症细胞和细胞因子，而对于损伤炎症的伴随现象-组织的增生与修复方面研究不多。近来已有研究提示在ALI的早期，甚至在损伤的同时可能已开始启动了增生和修复，而此时启动的纤维组织增生可能对于组织的修复并非有利，如能在早期阶段将不利于组织正常修复的因素加以修正，可能会有利于ALI的预后(3-5)。以往认为ALI时纤维组织的增生出现于病变的中后期，但近来的研究提示在ALI的早期就会出现纤维母细胞增生和分泌胶原的活性增强。Marshall等(3)研究发现急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者在发病24 h内血清中和肺泡灌洗液中Ⅲ型前胶原浓度均高于非ARDS患者，且与患者预后有关，即血清中和肺泡灌洗液中Ⅲ型前胶原浓度高的患者病死率较高。本研究从病理组织学上进一步证实在ALI 1 d时肺间质内即可出现散在的纤维组织增生，与对照组之间比较未达到统计学差异，可能与每组动物数量有限有关。4 d时纤维组织增生形成大小不一的纤维灶，纤维的增生会进一步破坏肺泡的正常结构，使肺换气功能出现持续不可逆转的恶化。组织的增生与修复常伴有组织内微血管的变化，国外学者的相关研究提出肺部纤维化与血管生成之间可能有一定关系(6-9)。本实验结果显示，在ALI早期(4 d)，在肺部出现明显纤维组织增生的同期确实存在肺部微血管增加。同时还显示微血管的增生发生在损伤后一定时间；而随着损伤后时间的延长，肺部微血管的增生并非持续进展，而是在增加后又降至基线水平。以往临床研究所获得的临床标本中并未发现有肺部微血管的增生，这可能正是由于临床研究中的绝大多数患者已是病程中晚期，这一时期内肺部微血管的增生已随着肺部纤维化的发生、发展而逐渐减少或消失。
, 百拇医药
参考文献
1 Keane M P,Belperio J A,Burdick M D,et al.ENA-78 is a important angiogenic factor in idiopathic pulmonary fibrosis(J).Am J Respir Crit Care Med,2001,164:2239-2242
2 Henke C,Knighton D,Wick M, et al.Mechanisms of alveolar fibrosis following acute lung injury:presence of angiogenesis bioactirity in the lower respiratory tract(J).Chest,1991,99(3 Suppl):40S
3 Marshall R P,Bellingan G,Webb S,et al. Fibroproliferation occurs early in the acute respiratory distress syndrome and impacts on outcome(J).Am J Respir Crit Care Med,2000,162:1783-1788
, 百拇医药
4 Chesnutt A N,Matthay M A,Tibayan F A,et al.Early detection of type Ⅲ procollagen peptide in acute lung injury, pathogenetic and prognostic significance(J).Am J Respir Crit Care Med,1997,156(3 Pt1):840-845.
5 Deheinzelin D,Jatene F B,Saldiva P H, et al. Upregulation of collagen messenger RNA expression occurs immediately after lung damage(J).Chest,1997,112:1184-1188.
6 Strieter R M,Belperio J A,Keane M P.CXC chemokines in angiogenesis related to pulmonary fibrosis(J).Chest，2002，122(6 Suppl):298S-301S.
, http://www.100md.com
7 Keane M P,Wilke C A,Burdick M D, et al.IFN-gamma-inducible protein-10 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis via inhibition of angiogenesis(J).J Immunol, 1999,163:5686-5692
8 Keane M P,Belperio J A,Arenberg D A, et al. CXC chemokines regulate angiogenic activity in acute lung injury(J).Chest,1999, 116(1 Suppl):93S-94S.
9 Keane M P,Arenberg D A,Lynch J P, et al. The CXC chemokines,IL-8 and IP-10,regulate angiogenic activity in idiopathic pulmonary fibrosis(J).J Immunol,1997,159:1437-1443
作者单位：200127 上海第二医科大学仁济医院呼吸内科(李燕芹，刘斌，徐佳波)；浙江大学医学院解剖与组织胚胎教研室(吕寒冰，方马荣)
作者简介：李燕芹(1966-)，女(汉族)，山西省太原市人，医学博士，副主任医师，上海市医学会呼吸学会青年委员，主要研究方向为呼吸衰竭。, 百拇医药