端粒酶的研究进展，存在问题及其在病理学中的应用
中华病理学杂志 作者：朱虹光 宋宜
从Kim等于1994年报道了用TRAP法能检测到数十个肿瘤细胞的端粒酶活性以来，端粒酶的研究已经取得了长足的进展。重要的进展可概括为其蛋白质成分的分离、纯化及其基因克隆；端粒酶的功能研究；表达细胞群的研究和潜在的应用价值4个方面。
一、端粒酶蛋白质成分分离
端粒酶是一个以自身RNA为模板逆转录出一段DNA以补充染色体DNA在复制中由于末端RNA引物被水解后，其缺口不能被DNA聚合酶修复而丢失的端粒末端DNA的核蛋白。不同种属的端粒酶的RNA在1995年和1996年先后由Greider等[1]克隆到。但端粒酶蛋白质的分离过程却比较曲折。由于端粒酶在各种细胞中丰度极低，而且当时的研究结果显示其为一个结合模板RNA的蛋白质二聚体，单体不应该有活性，所以不能用克隆基因后表达蛋白质再研究其功能的技术路线，只能用生化分离蛋白质观察端粒酶活性位于哪一个回收部分，然后再进一步分离的方法。我室曾经过2年的努力，分离到SDS-PAGE电泳中只剩5条条带的含端粒酶活性的粗提物，但在进一步的分离中端粒酶活性丢失而未能最后获得可作氨基酸序列分析的蛋白质成分。
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世界各国科学家在经过一系列失败后，在生物界中挑选了容易培养而且能快速繁殖的纤毛虫和一个细胞内含有数千条染色体的四膜虫作为分离端粒酶的材料，并于1996年分离出纤毛虫的p-123，p-43两条多肽，这两条多肽和端粒酶RNA结合成为有端粒酶活性的全酶分子[2]；于1997年分离出四膜虫的p-80，p-95两条端粒酶多肽，并将其命名为TLP1[3]。经过进一步的研究，发现p-80为与端粒酶RNA结合亚基，p-95为与端粒末端DNA结合亚基，两个亚基与端粒酶RNA一起构成完整的端粒酶，并通过p-95与端粒末端结合，利用该酶的活性延长端粒的末端。上述从四膜虫和纤毛虫中分离出的两组蛋白质之间并无同源性，Nakayama等[4]在人和鼠中克隆了TLP1中的p-80同源基因，用该基因体外表达多肽制备得到特异性沉淀人、鼠端粒酶活性成分的多克隆抗体。该抗体能沉淀S-100抽提液中约一半的端粒酶活性，但无论再加多少抗体，也不能将端粒酶活性完全沉淀，提示人和鼠类有两个端粒酶的亚型存在。当然，也不能排除TLP1的p-80仅是一种端粒酶结合蛋白质的可能性。
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在分析了上述两个种属的端粒酶4个亚基后，Nakamura等[5]发现只有纤毛虫端粒酶中的p-123具有逆转录酶的基本特征片段 (RT-motif)，而且p-123还和酵母体内维持端粒长度必须的EST-2基因有同源性。利用p-123的序列，Nakamura等[5]在人类cDNA库中克隆到了hTRT(human telomerase reverse transcriptase gene)，hTRT具有7个RT-motif和1个motif t (telomerase-specific)。与其他的多肽不同的是，编码hTRT蛋白质成分的mRNA仅存在于永生化细胞中。
二、端粒酶的功能研究
在Kim等的TRAP法建立以前，由于检测手段不敏感，端粒酶活性只能在肿瘤细胞和生殖细胞中检出，而这两种细胞的共同特征都是能永生化生长。结合端粒的长度在体内、外细胞分裂中随着细胞分裂次数的增加而不断缩短，肿瘤细胞和生殖细胞这两种端粒酶活性阳性细胞则在体内、外增殖过程中均保持端粒的长度不变等实验证据，众多学者提出了端粒酶的功能是维持细胞永生化的假说。这个假说如能成立，则单细胞真核生物都应该具有端粒酶活性，随着端粒酶活性在纤毛虫、四膜虫、酵母等单细胞真核生物中的恒定检出，“端粒酶是细胞永生化必需的酶"也逐渐由假说变成理论。但由于Kim等的TRAP法的建立，一些原来不能检出端粒酶活性的组织中逐渐检出了端粒酶活性，这一理论受到了挑战。在hTRT基因被Knock-out的小鼠中，传6代后小鼠仍然保持健康。该发现意味着端粒酶的活性并非维持物种传代所必需。但另一方面，将hTRT基因转入人成纤维细胞，视网膜色素上皮细胞，血管内皮细胞后，这些细胞获得了永生性生长能力，证明端粒酶的确能使细胞永生化[6]。此外，还发现在少数永生化的肿瘤细胞株中没有端粒酶活性，它们可以通过其他的目前尚不明确的端粒延长机制(ALT)获得永生[7]，在一些软组织肿瘤的端粒酶活性检测中也发现了这一现象[8]。这些结果表明，端粒酶的表达能使细胞永生化，但在一些特定的情况下，细胞也可能通过其他途径获得永生性生长的机会。
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三、体内表达端粒酶的细胞群
通过抑制端粒酶活性来治疗肿瘤是一个非常诱人的新战略，目前已有报道表明，在体内、外实验中用端粒酶RNA的反意义链阻断胶质细胞瘤[9]和胃癌[10]中端粒酶活性能使肿瘤细胞生长受到抑制，并能使部分细胞发生凋亡。该研究为肿瘤治疗研究提出了一个新靶点。但要将此方法应用于临床，前提是除了生殖细胞和肿瘤细胞外，其他增生细胞不表达端粒酶。所以，研究体内表达端粒酶的细胞群就成了一个相当重要的课题。Kim等的TRAP法建立后，由于方法学敏感了，已经有大量报道表明，体内许多需要永生化生长的细胞能表达端粒酶活性。比较明确的表达端粒酶的正常体细胞有快速增殖的淋巴造血系统细胞、皮肤基底层细胞、增生期子宫内膜细胞等。已经报道的绝大多数肿瘤细胞表达端粒酶但部分有增生的病变，如慢性活动性肝炎向肝癌转变的过程中，肝癌的癌旁组织中等也可检测到较弱的端粒酶活性[11]。其意义是仅代表有细胞增生，还是代表这些组织中已有细胞进入癌发生演进(progression)阶段(即癌前病变向癌转化阶段)，还值得进一步研究。
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四、在病理学中的应用及其前景
体内部分正常体细胞增生期时也表达端粒酶，表明正常的需要经常增生以补充不断衰老、死亡细胞群的体细胞中也必须有一批永生化的干细胞存在，才能保证生物个体的整体正常活动。另一方面，由于可能还存在端粒酶以外的其他维持端粒长度的机制，通过抑制端粒酶活性来特异性地抑制肿瘤细胞生长的战略受到了严重的挑战。
由于体内的干细胞一般不会形成密集细胞群，所以只要用半定量的方法检测，总会发现正常组织或一些癌前病变组织中的端粒酶活性，即使有也比恶性肿瘤中的活性低得多。这一现象已在胃癌[12]等多种肿瘤中得到了证实。此现象是由于癌细胞表达的端粒酶活性比正常干细胞强，还是仅仅因为表达端粒酶活性的癌细胞比例较高所造成，仍是一个值得研究的问题。但不管是什么原因造成这一个现象，端粒酶的在癌组织中强表达给病理学鉴别病变的良恶性提供了一个很好的标志物。国内学者在这一方面做了大量的工作。吴珊等[13]报道大部分乳腺癌端粒酶活性呈阳性而乳腺良性病变则呈阴性，国外同行也有相似结果报道[14]。赵东兵等[15]报道大肠癌中端粒酶强阳性而癌旁组织中端粒酶阴性。在脱落细胞检查中，端粒酶的应用更显示了良好的应用前景。最近发现在尿脱落细胞中检测端粒酶能获得比细胞学敏感性高得多的结果[16]。在肝细胞肝癌[17]等肿瘤中，端粒酶活性与肿瘤转移，预后及病人存活期密切相关。这些研究成果提示对端粒酶的检测可作为极有价值的临床诊断、药效评估、预后判断参数。尽管如此，直接将端粒酶用于临床诊断还有大量工作要做。杨仕明等[18]在胃粘膜活检组织中发现，虽然统计学上胃癌的端粒酶阳性率(92.3%)显著高于慢性萎缩性胃炎(24.6%)，肠上皮化生(38.5%)，不典型增生(37.5%)，但良性病变中有如此高的端粒酶阳性率，以及一些软组织恶性肿瘤中未检测到端粒酶活性的现象[8]，显然限制了用目前的常规方法检测端粒酶活性作为一个良恶性鉴别标志物在病理学中的应用。另一方面，虽然大量研究表明hTRT的表达与肿瘤有很好的相关性[19]，但将其应用于肿瘤鉴别还有赖于对端粒酶的蛋白质组成及其与酶活性的关系的进一步认识。
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五、端粒酶研究中存在的问题
近年来端粒酶的研究取得了很大的进展，但是也还有许多问题有待解决。(1)端粒酶是否有亚型存在？对这个问题，我们已经制备了能特异性沉淀端粒酶活性的抗hTRT单克隆抗体，目前正在制备抗TLP1的单克隆抗体以进一步探讨这个问题。(2)端粒酶活性在肿瘤中明显高于增生组织的机制是因为肿瘤组织中表达端粒酶的细胞丰度高，还是肿瘤组织中单个细胞表达的端粒酶活性强于单个增生细胞？(3)能否建立一种有效的原位检测端粒酶的方法以研究增生组织和肿瘤组织中端粒酶阳性细胞分布的差异，以便将这个标志物结合形态学更好地应用于病理学中。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570292)
参考文献：
[1]Greider CW, collins K, Cautexier, in DNA Replication in Eukaryotic Cells, M.L.DePamphilis, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spriong Harbor, NY, 1996，619.
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[2]Lingner J，Cech TR. Purification of telomerase from Euplotes aediculatus: requirement of a primer 3' overhang. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:10712-10717.
[3]Lingner J, Hughes TR, Shevchenko ATI, et al. Reverse transcriptase motif in the catalytic subunit of telomerase. Science, 1997, 276: 561-567.
[4]Nakayama J,Saito M, Nakamura H, et al.TLP1: a gene encoding a protein component of mammalian telomerase is a novel member of WD repeats family. cell,1997, 88: 875-884.
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[5]Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB, et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science, 1997, 277: 955-959.
[6]Yang J,Chang E,Cherry AM,et al. Human endothelial cell life extension by telomerase expression. J Biol Chem,1999,274: 26141-26148.
[7]Reddel RR, Bryan TM, Murnane JP, et al. Immortalized cells with no detectable telomerase activity .A review . Biochemistry-Mosc,1997,62: 1254-1262.
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[8]Yan P, Coindre JM, Benhattar J, et al. Telomerase activity and human telomerase reverse transcriptase mRNA expression in soft tissue tumors:correlation with grade,histology,and proliferative activity. Cancer res,1999,59:3166-3170.
[9]Kondo S，Kondo Y, Li G, et al. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. oncogene. 1998,16: 3323-3330.
[10]Naka K, Yokozaki H, Yasui W, et al. Effect of antisense human telomerase rNA transfection on the growth of human gastric cancer cell lines. Biochem biophys Res Commun,1999,255:753-758.
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[11]吴珊，刘宗石，李晓明，等.原发性肝癌及慢性肝脏病变端粒酶活性的研究.中华病理学杂志,1998，27: 91-93.
[12]Jong HS, Park YI, Kim S, et al. Up-regulation of human telomerase catalytic subunit during gastric carcinogenesis. Cancer ,1999,86:559-565.
[13]吴珊，刘宗石，孙宏明,等.人乳腺浸润性导管癌端粒酶活性的检测.中华医学杂志 ，1998，78:515-516.
[14]Umbricht CB, Sherman ME, Dome J, et al. Telomerase activity in ductal carcinoma in situ and invasive breast cancer. Oncogene, 1999, 18: 3407-3414.
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[15]赵东兵，张伟，金顺钱,等.大肠癌组织中端粒酶活性的研究.中华肿瘤杂志，1998，20:199-201.
[16]Rahat MA, Lahat N, Gazawi H, et al. Telomerase activity in patients with transitional cell carcinoma: a preliminary study. Cancer,1999, 85: 919-924.
[17]Kanamaru T, Yamamoto M, Morita Y, et al. Clinical implications of telomerase activity in resected hepatocellular carcinoma. Int J Mol Med, 1999,4: 267-271.
[18]杨仕明，房殿春，罗元辉,等.胃癌及癌前组织中端粒酶活性的检测及其临床意义.中华医学杂志,1998，78: 207-209.
[19]Park TW, Riethdorf S, Riethdorf L, et al. Differential telomerase activity,expression of the telomerase catalytic sub-unit and telomerase-RNA in ovarian tumors. Int J Cancer, 1999, 84: 426-431., 百拇医药
从Kim等于1994年报道了用TRAP法能检测到数十个肿瘤细胞的端粒酶活性以来，端粒酶的研究已经取得了长足的进展。重要的进展可概括为其蛋白质成分的分离、纯化及其基因克隆；端粒酶的功能研究；表达细胞群的研究和潜在的应用价值4个方面。
一、端粒酶蛋白质成分分离
端粒酶是一个以自身RNA为模板逆转录出一段DNA以补充染色体DNA在复制中由于末端RNA引物被水解后，其缺口不能被DNA聚合酶修复而丢失的端粒末端DNA的核蛋白。不同种属的端粒酶的RNA在1995年和1996年先后由Greider等[1]克隆到。但端粒酶蛋白质的分离过程却比较曲折。由于端粒酶在各种细胞中丰度极低，而且当时的研究结果显示其为一个结合模板RNA的蛋白质二聚体，单体不应该有活性，所以不能用克隆基因后表达蛋白质再研究其功能的技术路线，只能用生化分离蛋白质观察端粒酶活性位于哪一个回收部分，然后再进一步分离的方法。我室曾经过2年的努力，分离到SDS-PAGE电泳中只剩5条条带的含端粒酶活性的粗提物，但在进一步的分离中端粒酶活性丢失而未能最后获得可作氨基酸序列分析的蛋白质成分。
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世界各国科学家在经过一系列失败后，在生物界中挑选了容易培养而且能快速繁殖的纤毛虫和一个细胞内含有数千条染色体的四膜虫作为分离端粒酶的材料，并于1996年分离出纤毛虫的p-123，p-43两条多肽，这两条多肽和端粒酶RNA结合成为有端粒酶活性的全酶分子[2]；于1997年分离出四膜虫的p-80，p-95两条端粒酶多肽，并将其命名为TLP1[3]。经过进一步的研究，发现p-80为与端粒酶RNA结合亚基，p-95为与端粒末端DNA结合亚基，两个亚基与端粒酶RNA一起构成完整的端粒酶，并通过p-95与端粒末端结合，利用该酶的活性延长端粒的末端。上述从四膜虫和纤毛虫中分离出的两组蛋白质之间并无同源性，Nakayama等[4]在人和鼠中克隆了TLP1中的p-80同源基因，用该基因体外表达多肽制备得到特异性沉淀人、鼠端粒酶活性成分的多克隆抗体。该抗体能沉淀S-100抽提液中约一半的端粒酶活性，但无论再加多少抗体，也不能将端粒酶活性完全沉淀，提示人和鼠类有两个端粒酶的亚型存在。当然，也不能排除TLP1的p-80仅是一种端粒酶结合蛋白质的可能性。
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在分析了上述两个种属的端粒酶4个亚基后，Nakamura等[5]发现只有纤毛虫端粒酶中的p-123具有逆转录酶的基本特征片段 (RT-motif)，而且p-123还和酵母体内维持端粒长度必须的EST-2基因有同源性。利用p-123的序列，Nakamura等[5]在人类cDNA库中克隆到了hTRT(human telomerase reverse transcriptase gene)，hTRT具有7个RT-motif和1个motif t (telomerase-specific)。与其他的多肽不同的是，编码hTRT蛋白质成分的mRNA仅存在于永生化细胞中。
二、端粒酶的功能研究
在Kim等的TRAP法建立以前，由于检测手段不敏感，端粒酶活性只能在肿瘤细胞和生殖细胞中检出，而这两种细胞的共同特征都是能永生化生长。结合端粒的长度在体内、外细胞分裂中随着细胞分裂次数的增加而不断缩短，肿瘤细胞和生殖细胞这两种端粒酶活性阳性细胞则在体内、外增殖过程中均保持端粒的长度不变等实验证据，众多学者提出了端粒酶的功能是维持细胞永生化的假说。这个假说如能成立，则单细胞真核生物都应该具有端粒酶活性，随着端粒酶活性在纤毛虫、四膜虫、酵母等单细胞真核生物中的恒定检出，“端粒酶是细胞永生化必需的酶"也逐渐由假说变成理论。但由于Kim等的TRAP法的建立，一些原来不能检出端粒酶活性的组织中逐渐检出了端粒酶活性，这一理论受到了挑战。在hTRT基因被Knock-out的小鼠中，传6代后小鼠仍然保持健康。该发现意味着端粒酶的活性并非维持物种传代所必需。但另一方面，将hTRT基因转入人成纤维细胞，视网膜色素上皮细胞，血管内皮细胞后，这些细胞获得了永生性生长能力，证明端粒酶的确能使细胞永生化[6]。此外，还发现在少数永生化的肿瘤细胞株中没有端粒酶活性，它们可以通过其他的目前尚不明确的端粒延长机制(ALT)获得永生[7]，在一些软组织肿瘤的端粒酶活性检测中也发现了这一现象[8]。这些结果表明，端粒酶的表达能使细胞永生化，但在一些特定的情况下，细胞也可能通过其他途径获得永生性生长的机会。
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三、体内表达端粒酶的细胞群
通过抑制端粒酶活性来治疗肿瘤是一个非常诱人的新战略，目前已有报道表明，在体内、外实验中用端粒酶RNA的反意义链阻断胶质细胞瘤[9]和胃癌[10]中端粒酶活性能使肿瘤细胞生长受到抑制，并能使部分细胞发生凋亡。该研究为肿瘤治疗研究提出了一个新靶点。但要将此方法应用于临床，前提是除了生殖细胞和肿瘤细胞外，其他增生细胞不表达端粒酶。所以，研究体内表达端粒酶的细胞群就成了一个相当重要的课题。Kim等的TRAP法建立后，由于方法学敏感了，已经有大量报道表明，体内许多需要永生化生长的细胞能表达端粒酶活性。比较明确的表达端粒酶的正常体细胞有快速增殖的淋巴造血系统细胞、皮肤基底层细胞、增生期子宫内膜细胞等。已经报道的绝大多数肿瘤细胞表达端粒酶但部分有增生的病变，如慢性活动性肝炎向肝癌转变的过程中，肝癌的癌旁组织中等也可检测到较弱的端粒酶活性[11]。其意义是仅代表有细胞增生，还是代表这些组织中已有细胞进入癌发生演进(progression)阶段(即癌前病变向癌转化阶段)，还值得进一步研究。
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四、在病理学中的应用及其前景
体内部分正常体细胞增生期时也表达端粒酶，表明正常的需要经常增生以补充不断衰老、死亡细胞群的体细胞中也必须有一批永生化的干细胞存在，才能保证生物个体的整体正常活动。另一方面，由于可能还存在端粒酶以外的其他维持端粒长度的机制，通过抑制端粒酶活性来特异性地抑制肿瘤细胞生长的战略受到了严重的挑战。
由于体内的干细胞一般不会形成密集细胞群，所以只要用半定量的方法检测，总会发现正常组织或一些癌前病变组织中的端粒酶活性，即使有也比恶性肿瘤中的活性低得多。这一现象已在胃癌[12]等多种肿瘤中得到了证实。此现象是由于癌细胞表达的端粒酶活性比正常干细胞强，还是仅仅因为表达端粒酶活性的癌细胞比例较高所造成，仍是一个值得研究的问题。但不管是什么原因造成这一个现象，端粒酶的在癌组织中强表达给病理学鉴别病变的良恶性提供了一个很好的标志物。国内学者在这一方面做了大量的工作。吴珊等[13]报道大部分乳腺癌端粒酶活性呈阳性而乳腺良性病变则呈阴性，国外同行也有相似结果报道[14]。赵东兵等[15]报道大肠癌中端粒酶强阳性而癌旁组织中端粒酶阴性。在脱落细胞检查中，端粒酶的应用更显示了良好的应用前景。最近发现在尿脱落细胞中检测端粒酶能获得比细胞学敏感性高得多的结果[16]。在肝细胞肝癌[17]等肿瘤中，端粒酶活性与肿瘤转移，预后及病人存活期密切相关。这些研究成果提示对端粒酶的检测可作为极有价值的临床诊断、药效评估、预后判断参数。尽管如此，直接将端粒酶用于临床诊断还有大量工作要做。杨仕明等[18]在胃粘膜活检组织中发现，虽然统计学上胃癌的端粒酶阳性率(92.3%)显著高于慢性萎缩性胃炎(24.6%)，肠上皮化生(38.5%)，不典型增生(37.5%)，但良性病变中有如此高的端粒酶阳性率，以及一些软组织恶性肿瘤中未检测到端粒酶活性的现象[8]，显然限制了用目前的常规方法检测端粒酶活性作为一个良恶性鉴别标志物在病理学中的应用。另一方面，虽然大量研究表明hTRT的表达与肿瘤有很好的相关性[19]，但将其应用于肿瘤鉴别还有赖于对端粒酶的蛋白质组成及其与酶活性的关系的进一步认识。
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五、端粒酶研究中存在的问题
近年来端粒酶的研究取得了很大的进展，但是也还有许多问题有待解决。(1)端粒酶是否有亚型存在？对这个问题，我们已经制备了能特异性沉淀端粒酶活性的抗hTRT单克隆抗体，目前正在制备抗TLP1的单克隆抗体以进一步探讨这个问题。(2)端粒酶活性在肿瘤中明显高于增生组织的机制是因为肿瘤组织中表达端粒酶的细胞丰度高，还是肿瘤组织中单个细胞表达的端粒酶活性强于单个增生细胞？(3)能否建立一种有效的原位检测端粒酶的方法以研究增生组织和肿瘤组织中端粒酶阳性细胞分布的差异，以便将这个标志物结合形态学更好地应用于病理学中。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570292)
参考文献：
[1]Greider CW, collins K, Cautexier, in DNA Replication in Eukaryotic Cells, M.L.DePamphilis, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spriong Harbor, NY, 1996，619.
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[4]Nakayama J,Saito M, Nakamura H, et al.TLP1: a gene encoding a protein component of mammalian telomerase is a novel member of WD repeats family. cell,1997, 88: 875-884.
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[7]Reddel RR, Bryan TM, Murnane JP, et al. Immortalized cells with no detectable telomerase activity .A review . Biochemistry-Mosc,1997,62: 1254-1262.
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[12]Jong HS, Park YI, Kim S, et al. Up-regulation of human telomerase catalytic subunit during gastric carcinogenesis. Cancer ,1999,86:559-565.
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