肝细胞癌组织Ⅲ型胶原的来源
项目负责人:王要军，男，28岁。1991年获第二军医大学硕士学位。曾在国家级杂志发表论著10余篇。现任济南军区总医院消化内科主治医师，主要从事肝病的诊治及发病机制的研究。[山东省济南市师范路17号(250031)，电话：552171转69616](1993-06-13 收稿)
摘要目的：研究肝细胞癌组织中Ⅲ型胶原的细胞来源及其基因表达。
方法：6例正常肝组织及23例肝细胞癌组织I型胶原免疫组化染色采用卵白素-生物素-过氧化物酶法，2例正常肝及9例肝细胞癌组织胶原基因表达检测采用原位核酸杂交技术。
结果：正常肝组织及癌旁肝组织非活动性肝病时胶原合成处于静止状态，癌旁活动性肝病时可见间质细胞胶原蛋白及基因表达。癌组织中胶原表达明显增强，癌细胞胶原合成强于间质细胞。
, 百拇医药
结论：①癌旁肝组织合成胶原可能是肝病活动的结果，肝细胞不参与胶原合成；②癌组织中胶原主要来源于癌细胞。
主题词 肝细胞癌 Ⅲ型胶原 免疫组化 原位杂交
王要军, 孙自勤, 戴益民, 曹韫旭.肝细胞癌组织I型胶原的来源.新消化病学杂志,1994;2(1):21-22
AIM The origin and gene expression of type collagen inhepatocellular carcinoma (HCC) tissue were studied.
METHODS Collagen immunohistochemical stain was made in 6 cases of normal liver and 23 cases of HCC and its surrounding liver tissue. Collagen gene expression was detected by in situ hybridization in 2 casesof normal liver and 9 cases of HCC and its surrounding liver tissue.
, 百拇医药
RESULTS Type collagen synthesis was inactive in surrounding liver tissue with inactive liver disease. Collagen protein and geneexpression could be found only in the mesenchymal cells in surrounding livertissue with active liver disease. Collagen expression was significantly increased in HCC tissue and collagen synthesis in cancer cells was moreintensive than mesenchymal cells.
CONCLUSIONS Collagen synthesis in cancer surrounding liver tissue may be the consequence of activation of liver disease, and hepatocytes can not synthesize type collagen; Type collagen mainly derives from cancer cells in HCC tissue.
, 百拇医药
KEYWORDS hepatocellular carcinoma type collagen immunohistochemistry
Wang YJ, Sun ZQ, Dai YM, Cao YX. Origin of type collagen in humanhepatocellular carcinoma.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1994;2(1):21-22
随着组织免疫学及分子生物学的发展，人们对细胞外基质尤其是胶原基质有了更深入的了解，肝脏胶原代谢异常与肝纤维化发生发展以及肝癌组织的浸润、转移等肿瘤生物学行为有着密切的关系[1]。但肝细胞癌(HCC)及癌旁肝组织中胶原的细胞来源及其与肿瘤生物学行为之间的关系尚未清楚，本文主要对肝细胞癌石蜡及冰冻切片进行Ⅲ型胶原的免疫组化及分子杂交研究，试图对这一问题进行探讨。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 23例HCC系手术标本，分别取癌、癌旁肝、癌与癌旁肝交界处组织，6例正常肝组织系新鲜尸检材料，标本以10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切4μm连续石蜡切片。其中2例正常肝及9例HCC组织取材后OCT包埋、液氮速冻，恒冷箱冰冻切片。临床病理资料如下：23例HCC中男17例，女6例，年龄18岁～64岁，平均49.5岁。癌旁肝伴肝硬变19例，其中活动性肝硬变10例。伴CAH 2例。肿瘤直径2.5cm～14cm，平均7.2cm，根据Edmondson标准分级：I级1例，级12例，级10例。兔抗牛Ⅲ型前胶原肽抗血清由长征医院临床免疫科提供[2]。含人I型胶原α1链cDNA片段的质粒大肠杆菌由Vurio博士惠赠[3]。ABC 试剂盒为Vector产品，缺口平移标记试剂盒为BRL产品，32P-dCTP为Amersham产品。
, 百拇医药
1.2 方法 ①免疫组化染色：采用 ABC 法，一抗浓度为 1:200, 切片消化用 0.1% 胰蛋白酶消化20min。原位杂交：石蜡切片及冰冻切片均用于原位杂交，探针DNA长度为295 bp PstI-PstI 片段。探针制备及原位杂交方法见我们以前报道[4]。
2 结果
免疫组化染色结果除细胞内见Ⅲ型胶原染色阳性外，尚可见细胞外胶原基质阳性如中央静脉壁，纤维隔以及肝窦壁,本文只观察胶原的细胞内染色。原位杂交结果判断参考文献[4]。
2.1 免疫组化 正常肝组织及非活动性肝病的癌旁肝组织中未见胶原染色阳性的细胞，而在伴活动性肝病(10例活动性肝硬变及2例CAH)的癌旁肝组织中有9例(7例活动性肝硬变及2例CAH)见成纤维细胞、窦周细胞、血管内皮细胞等间质细胞含有Ⅲ型胶原，尤以纤维隔中成纤维细胞较明显，但肝细胞内未见胶原免疫染色阳性。17例癌组织中癌细胞含I型胶原，染色强度与肿瘤分化程度成反比。
, 百拇医药
2.2 原位杂交 所有石蜡切片均未见阳性杂交信号，2例正常肝组织亦无阳性信号。9例 HCC冰冻组织中7例出现阳性结果。其细胞分布基本与免疫组化结果一致，但在非活动性肝病的癌旁组织亦可见成纤维细胞、窦周细胞、血管内皮细胞等间质细胞有胶原基因表达。癌内信号明显强于癌旁肝。
3 讨论
关于正常人肝、肝纤维化及原发性肝癌组织胶原的细胞来源，目前有很多争议，很多学者的研究工作多采用细胞培养及动物组织，人肝癌组织中胶原的研究文献甚少[4,5]。细胞培养结果提示肝脏组织内间质细胞及肝细胞均能够产生胶原，但肝细胞可能受肝脏非主质细胞胶原产物的污染，而且肝细胞在分离后很容易导致其表现型的改变，很多学者对这些结果存有疑问。Clement[6]用免疫电镜技术检测大鼠肝、正常人肝及纤维化肝中胶原的来源，认为肝细胞能合成Ⅲ型胶原，也有人认为只在活动性肝病时肝细胞才参与胶原的合成[7]。Sakakibara[5]用免疫组化方法检测到肝癌细胞内含I型胶原。本研究则提示正常状态下肝脏内胶原合成处于静止状态。癌旁肝组织有活动性肝病(活动性肝硬变及CAH)时，间质细胞既有I型胶原的基因表达，又有胶原蛋白的合成，癌旁肝无活动性肝病时，则只有胶原基因表达而无蛋白合成，这可能与胶原合成控制在翻译水平有关，癌旁肝组织合成胶原蛋白可能是肝病活动的结果。癌旁肝组织中肝细胞不参与胶原的合成。癌组织中胶原基因表达及蛋白合成则强于癌旁肝组织，且胶原主要来源于肿瘤细胞，肿瘤间质中成纤维细胞、血管内皮细胞、窦周细胞等也参与胶原合成，结合以前工作[4,5]我们认为肝癌组织中Ⅲ型胶原基因过度表达与组织细胞的活跃增生有关。全部石蜡切片原位杂交出现阴性结果，与石蜡切片制作过程中胶原mRNA的降解有关，因为胶原mRNA T1/2很短，只有数小时，且极易降解[1],我们认为冰冻切片更适于肝癌组织胶原基因表达的研究。
, 百拇医药
4 参考文献1 王要军, 戴益民. 肝脏胶原基质的研究进展. 国外医学生理、病理与临床分册,1992;12(3):123-125
2 梅长林, 张国治, 孔宪涛, 等. 血清Ⅲ型前胶原肽在肝纤维化诊断中的价值.中华消化杂志, 1988;8(4):189-191
3 Sandberg M,Vurio E. Localization of type ,I, and collagen mRNAsin developing
human skeletal tissue by in situ hybridization. J CellBiol,1987;104(4):1077-1084
4 王要军, 杨林森, 戴益民. 人原发性肝癌Ⅰ型胶原基因的表达. 临床与实验病理学杂志, 1993;9(3):167-169
, http://www.100md.com
5 Sakakibara K, Ooshima A, Igarashi S, et al. Immunolocalization of typeⅢ collagen and
procollagen in cirrhotic human liver using monoclonalantibodies.
Virchows Archiv (Pathol Anat), 1986;409(1):37-46
6 Clement B, Emonard H, Rissel M, et al. Cellular origin of collagen and fibronectin in
the liver. Gell Mole Biol, 1984;30:489-496
7 Malizia G, Giannuoli G, Caltagirone M, et al . Procollagen type Produ ction by hepatocytes:
A marker of progressive liver disease?Lancet,1987;Ⅱ(8567):1055-1057, 百拇医药
摘要目的：研究肝细胞癌组织中Ⅲ型胶原的细胞来源及其基因表达。
方法：6例正常肝组织及23例肝细胞癌组织I型胶原免疫组化染色采用卵白素-生物素-过氧化物酶法，2例正常肝及9例肝细胞癌组织胶原基因表达检测采用原位核酸杂交技术。
结果：正常肝组织及癌旁肝组织非活动性肝病时胶原合成处于静止状态，癌旁活动性肝病时可见间质细胞胶原蛋白及基因表达。癌组织中胶原表达明显增强，癌细胞胶原合成强于间质细胞。
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结论：①癌旁肝组织合成胶原可能是肝病活动的结果，肝细胞不参与胶原合成；②癌组织中胶原主要来源于癌细胞。
主题词 肝细胞癌 Ⅲ型胶原 免疫组化 原位杂交
王要军, 孙自勤, 戴益民, 曹韫旭.肝细胞癌组织I型胶原的来源.新消化病学杂志,1994;2(1):21-22
AIM The origin and gene expression of type collagen inhepatocellular carcinoma (HCC) tissue were studied.
METHODS Collagen immunohistochemical stain was made in 6 cases of normal liver and 23 cases of HCC and its surrounding liver tissue. Collagen gene expression was detected by in situ hybridization in 2 casesof normal liver and 9 cases of HCC and its surrounding liver tissue.
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RESULTS Type collagen synthesis was inactive in surrounding liver tissue with inactive liver disease. Collagen protein and geneexpression could be found only in the mesenchymal cells in surrounding livertissue with active liver disease. Collagen expression was significantly increased in HCC tissue and collagen synthesis in cancer cells was moreintensive than mesenchymal cells.
CONCLUSIONS Collagen synthesis in cancer surrounding liver tissue may be the consequence of activation of liver disease, and hepatocytes can not synthesize type collagen; Type collagen mainly derives from cancer cells in HCC tissue.
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KEYWORDS hepatocellular carcinoma type collagen immunohistochemistry
Wang YJ, Sun ZQ, Dai YM, Cao YX. Origin of type collagen in humanhepatocellular carcinoma.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1994;2(1):21-22
随着组织免疫学及分子生物学的发展，人们对细胞外基质尤其是胶原基质有了更深入的了解，肝脏胶原代谢异常与肝纤维化发生发展以及肝癌组织的浸润、转移等肿瘤生物学行为有着密切的关系[1]。但肝细胞癌(HCC)及癌旁肝组织中胶原的细胞来源及其与肿瘤生物学行为之间的关系尚未清楚，本文主要对肝细胞癌石蜡及冰冻切片进行Ⅲ型胶原的免疫组化及分子杂交研究，试图对这一问题进行探讨。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 23例HCC系手术标本，分别取癌、癌旁肝、癌与癌旁肝交界处组织，6例正常肝组织系新鲜尸检材料，标本以10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切4μm连续石蜡切片。其中2例正常肝及9例HCC组织取材后OCT包埋、液氮速冻，恒冷箱冰冻切片。临床病理资料如下：23例HCC中男17例，女6例，年龄18岁～64岁，平均49.5岁。癌旁肝伴肝硬变19例，其中活动性肝硬变10例。伴CAH 2例。肿瘤直径2.5cm～14cm，平均7.2cm，根据Edmondson标准分级：I级1例，级12例，级10例。兔抗牛Ⅲ型前胶原肽抗血清由长征医院临床免疫科提供[2]。含人I型胶原α1链cDNA片段的质粒大肠杆菌由Vurio博士惠赠[3]。ABC 试剂盒为Vector产品，缺口平移标记试剂盒为BRL产品，32P-dCTP为Amersham产品。
, 百拇医药
1.2 方法 ①免疫组化染色：采用 ABC 法，一抗浓度为 1:200, 切片消化用 0.1% 胰蛋白酶消化20min。原位杂交：石蜡切片及冰冻切片均用于原位杂交，探针DNA长度为295 bp PstI-PstI 片段。探针制备及原位杂交方法见我们以前报道[4]。
2 结果
免疫组化染色结果除细胞内见Ⅲ型胶原染色阳性外，尚可见细胞外胶原基质阳性如中央静脉壁，纤维隔以及肝窦壁,本文只观察胶原的细胞内染色。原位杂交结果判断参考文献[4]。
2.1 免疫组化 正常肝组织及非活动性肝病的癌旁肝组织中未见胶原染色阳性的细胞，而在伴活动性肝病(10例活动性肝硬变及2例CAH)的癌旁肝组织中有9例(7例活动性肝硬变及2例CAH)见成纤维细胞、窦周细胞、血管内皮细胞等间质细胞含有Ⅲ型胶原，尤以纤维隔中成纤维细胞较明显，但肝细胞内未见胶原免疫染色阳性。17例癌组织中癌细胞含I型胶原，染色强度与肿瘤分化程度成反比。
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2.2 原位杂交 所有石蜡切片均未见阳性杂交信号，2例正常肝组织亦无阳性信号。9例 HCC冰冻组织中7例出现阳性结果。其细胞分布基本与免疫组化结果一致，但在非活动性肝病的癌旁组织亦可见成纤维细胞、窦周细胞、血管内皮细胞等间质细胞有胶原基因表达。癌内信号明显强于癌旁肝。
3 讨论
关于正常人肝、肝纤维化及原发性肝癌组织胶原的细胞来源，目前有很多争议，很多学者的研究工作多采用细胞培养及动物组织，人肝癌组织中胶原的研究文献甚少[4,5]。细胞培养结果提示肝脏组织内间质细胞及肝细胞均能够产生胶原，但肝细胞可能受肝脏非主质细胞胶原产物的污染，而且肝细胞在分离后很容易导致其表现型的改变，很多学者对这些结果存有疑问。Clement[6]用免疫电镜技术检测大鼠肝、正常人肝及纤维化肝中胶原的来源，认为肝细胞能合成Ⅲ型胶原，也有人认为只在活动性肝病时肝细胞才参与胶原的合成[7]。Sakakibara[5]用免疫组化方法检测到肝癌细胞内含I型胶原。本研究则提示正常状态下肝脏内胶原合成处于静止状态。癌旁肝组织有活动性肝病(活动性肝硬变及CAH)时，间质细胞既有I型胶原的基因表达，又有胶原蛋白的合成，癌旁肝无活动性肝病时，则只有胶原基因表达而无蛋白合成，这可能与胶原合成控制在翻译水平有关，癌旁肝组织合成胶原蛋白可能是肝病活动的结果。癌旁肝组织中肝细胞不参与胶原的合成。癌组织中胶原基因表达及蛋白合成则强于癌旁肝组织，且胶原主要来源于肿瘤细胞，肿瘤间质中成纤维细胞、血管内皮细胞、窦周细胞等也参与胶原合成，结合以前工作[4,5]我们认为肝癌组织中Ⅲ型胶原基因过度表达与组织细胞的活跃增生有关。全部石蜡切片原位杂交出现阴性结果，与石蜡切片制作过程中胶原mRNA的降解有关，因为胶原mRNA T1/2很短，只有数小时，且极易降解[1],我们认为冰冻切片更适于肝癌组织胶原基因表达的研究。
, 百拇医药
4 参考文献1 王要军, 戴益民. 肝脏胶原基质的研究进展. 国外医学生理、病理与临床分册,1992;12(3):123-125
2 梅长林, 张国治, 孔宪涛, 等. 血清Ⅲ型前胶原肽在肝纤维化诊断中的价值.中华消化杂志, 1988;8(4):189-191
3 Sandberg M,Vurio E. Localization of type ,I, and collagen mRNAsin developing
human skeletal tissue by in situ hybridization. J CellBiol,1987;104(4):1077-1084
4 王要军, 杨林森, 戴益民. 人原发性肝癌Ⅰ型胶原基因的表达. 临床与实验病理学杂志, 1993;9(3):167-169
, http://www.100md.com
5 Sakakibara K, Ooshima A, Igarashi S, et al. Immunolocalization of typeⅢ collagen and
procollagen in cirrhotic human liver using monoclonalantibodies.
Virchows Archiv (Pathol Anat), 1986;409(1):37-46
6 Clement B, Emonard H, Rissel M, et al. Cellular origin of collagen and fibronectin in
the liver. Gell Mole Biol, 1984;30:489-496
7 Malizia G, Giannuoli G, Caltagirone M, et al . Procollagen type Produ ction by hepatocytes:
A marker of progressive liver disease?Lancet,1987;Ⅱ(8567):1055-1057, 百拇医药