胃癌组织H-ras基因点突变与预后的关系
项目负责人:房殿春, 630038, 重庆市第三军医大学西南医院消化科
摘要
目的：胃癌发生发展的分子基础仍不甚明了，为了明确H-ras点突变在胃癌发生发展中的作用，本研究对胃癌组织H-ras点突变进行检测。
方法：采用多聚酶链延伸反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)对88例福尔马林液固定、石蜡包埋胃癌组织H-ras第12位和61位密码子点突变作了检测，并对点突变与肿瘤生物学行为及预后的关系进行分析。
结果：H-ras总突变率为14.8%(13/88)，点突变的发生与肿瘤浆膜浸润，淋巴结转移、临床分期及术后生存期密切相关。
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结论：检测胃癌组织H-ras基因点突变有助于判断胃癌患者的预后。
主题词 胃癌H-ras突变 多聚酶链延伸反应 限制性片段长度多态性分析
房殿春, 罗元辉, 鲁荣, 门荣甫, 晋华源.胃癌组织H-ras基因点突变与预后的关系.新消化病学杂志,1994;2(2):80-81
AIM The molecular basis of gastric cancer development ispoorly understood. In order to evalue the role of H-ras mutation in the progression of gastric cancer, we examined H-ras point mutation in gastric cancer.
, http://www.100md.com
METHODS Polymerase chain reaction and restrication fragmentlength polymorphisms (PCR-RFLP) analysis was performed on 88 formalin-fixed,paraffin-embedded gastric cancer tissues to determine the point mutation at codon 12 and 61 of H-ras gene. The relation between H-ras gene pointmutation and the tumor biology and prognosis was analysed.
RESULTS Point mutation was detected in 13/88(14.8%) of gastric cancer and the positivity of H-ras point mutation was related to the status of serosal invasion, lymph-node metastasis, stages and postsurgical survival period.
, http://www.100md.com
CONCLUSION Determination of H-ras point mutation in gastric cancer may be useful in predicting prognosis of patients with gastric cancer.
Keywords gastric cancer H-ras mutation PCR-RFLP
Fang DC, Luo YH, Lu R, Men RP, Jin HY. Study on the relation between H-ras gene point mutation and the prognosis of patients with gastric cancer.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1994;2(2):80-81
, http://www.100md.com
随着分子生物学技术的迅速发展，对肿瘤发生发展的研究已深入到分子水平。业已证明，癌基因ras突变在某些肿瘤的发生发展中起重要作用[1]。作者采用PCR-RFLP法对88例福尔马林液固定、石蜡包埋胃癌组织H-ras基因点突变进行分析，并探讨其与胃癌患者预后的关系。
1 材料和方法
1.1 组织标本 88例胃癌和30例大致正常胃粘膜组织为我院1978/1988年手术切除标本，均经10%福尔马林液固定、石蜡包埋，先切片1张，厚5μm， 行HE染色，用于病理诊断。另切同样厚度蜡片5张备用。
1.2 DNA提取 将胃癌组织片放入Eppendorf管中，二甲苯脱蜡，95%乙醇水化后，蛋白酶K消化，采用酚/氯仿抽提法提取DNA[2]。将提纯的DNA样品用TE缓冲液稀释，于紫外分光光度计上分别测定其在波长260nm及280nm时的吸收值，计算核酸的浓度和纯度。
, 百拇医药
1.3 引物设计 PCR引物由北京大学生命科学中心合成。H-ras基因第12位密码子引物顺序：P1A：5＇-CAGGGCCCTCCTTGGCAGG-3＇，为自H-ras第12位密码子正链上游非编码区第52～71核苷酸之间的序列；P1B：5＇-GTCGTATTCGTCCACAAAATGG-3＇，为负链第12位密码子突变位点下游第45～66核苷酸之间的序列。扩增片段长170bp，经限制性内切酶Hpa或Msp酶切，野生型被切为66+56+48bp 3个片段，突变型则切成122+48bp 2个片段。H-ras基因第61位密码子引物顺序：P2A：5＇-ACGTGCCTGTTGGACATCCT-3＇，为H-ras基因第61位密码子正链上游第15～34核苷酸之间的序列；P2B：5＇-CACACAGGAAGCCCTCCCCG-3＇，为负链下游第40～60核苷酸之间的序列。扩增片段长95bp，经限制性内切酶BstN1酶切，野生型被切成20+15+60bp 3个片段，突变型则切成20+75bp 2个片段。
1.4 PCR-RFLP分析 取约1μg组织DNA，溶于60μL PCR缓冲液(10mmol Tris HCl, 50mmol KCl,1.5mmol MgCl, 0.2mmol dATP, dGTP, dCTP和dTTP，1μmol引物，1～3μTaqDNA多聚酶)中，PCR扩增仪上操作(Perkin Elmer Cetus)： 95变性70s， 57复性70s，72延伸70s，重复以上循环40次，后于72放置10min。取10μLPCR产物用相应内切酶酶切(美国BRL公司产品)，4%聚丙烯酰胺电泳分离，溴乙锭染色后在紫外光透视板上观察并照像。
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1.5 患者随访 88例胃癌患者术后均随访5年以上，其中存活1年以上者64例，2年以上者49例，3年以上者36例，4年以上者32例，5年以上者26例。
2 结果
2.1 胃癌组织H-ras基因突变率 30例大致正常胃粘膜组织未发现有H-ras基因点突变者。88例胃癌有H-ras点突变13例，突变率为14.8%。其中H-ras 12位密码子突变12例(13.6%)，61位密码子突变3例(3.4%)。有一处密码子突变者11例，同时有两处密码子突变者2例。
2.2 H-ras突变与临床病理参数的关系 根据胃癌组织学分型、肿瘤大小、有无浆膜侵犯和淋巴结转移及临床病理分期的不同进行分组，各组H-ras基因突变率见表1。经统计学处理，有浆膜浸润组H-ras基因突变率显著高于无浆膜浸润组(P<0.05)；有淋巴结转移组H-ras突变率显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)；III、 IV期组H-ras突变率显著高于I, II期组(P<0.01)。其他各组间H-ras突变率则无显著差异(P>0.05)。
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2.3 H-ras基因点突变与胃癌患者存活期 88例胃癌患者5年存活情况见表2。经统计学处理，无H-ras点突变组2, 3, 4和5年的存活率均显著高于有H-ras点突变组(P<0.05)。
表1 H-ras点突变与临床病理参数的关系
, 百拇医药
*P<0.05, **P<0.01
表2 胃癌患者5年存活率与H-ras点突变的关系
, 百拇医药 *P<0.05.
3 讨论
癌基因ras族活化是某些肿瘤发生发展的分子基础。ras族基因由H-ras, K-ras和N-ras基因组成。点突变是ras族基因活化的重要方式，因此对肿瘤细胞ras基因点突变的检测一直是肿瘤工作者所致力于研究的热点。ras族基因第12位、13位和61位密码子的点突变可使其获得转化细胞的能力[3]。国外文献报道，ras基因的突变率在胰腺癌为90%，大肠癌为40%，胃癌则在10%以下[4，5]。国内邓国仁et al[6]检测我国胃癌标本发现，41%胃癌有H-ras第12位密码子点突变。本文采用PCR-RFLP法对88例石蜡包埋的胃癌组织进行分析，H-ras突变率为14.8%。日本学者报告胃癌主要是K-ras点突变[7]，而我国主要是H-ras基因的点突变[8]。这种突变率和突变位点的不同，可能与地理环境条件、种族、致癌原和检测方法的不同有关。 本研究还发现，H-ras基因点突变与胃癌的某些生物学行为有关。从本组资料看，肿瘤不同组织学类型和大小H-ras基因突变率无显著差异，而侵及浆膜者突变率显著高于未侵及浆膜者；有淋巴结转移者突变率明显高于无淋巴结转移者；Ⅲ, IV期胃癌患者显著高于Ⅰ, II期患者，此与国际上一些关于肿瘤浸润和转移的分子机制研究结果相一致。对88例胃癌患者进行5年以上的随访观察，结果发现无H-ras基因突变组术后5年存活率为34.7%，而13例有H-ras基因突变者无1例存活至5年，两组2年～5年存活率均有显著差别。因此，检测胃癌组织H-ras点突变不仅有助于了解胃癌的某些分子生物学行为，而且有可能成为判断胃癌患者预后的有用指标。 癌是基因疾病，这一概念已为愈来愈多的人所接受。本文对ras基因点突变的检测使我们对其在肿瘤发生发展过程中的作用有了进一步了解。然而从本组资料来看，大部分胃癌并未发现有H-ras基因点突变，说明其并非是仅有的导致胃癌发生发展的因素，可能还有其他基因或因素参与，这些需我们进一步研究和探索。
, 百拇医药
4 参考文献1 Koh EH, Chung HC, Lee KB, et al. Point mutation at condon 12 of the CHa-ras gene in human gastric
cancer. J Korean Med Sci, 1992;7(2):110-115
2 Goelz SE, Hamilton SR, Vogelstein B. Purification of DNA from formaldehydefixed and paraffin
embedded human tissue. Biochem Biophys Res Comm,1985;130(1):118-126
3 Barbacid M. Ras gene. Ann Rev Biochem, 1987;56(3):779-784
, http://www.100md.com
4 Neuman WL, Wasylyshyn ML, Jacoby R, et al. Evidence for a common molecular pathogenesis in
colorectal, gastric and pancreatic cancer. Cenes Chromosom Cancer, 1991;3(6):468-473
5 Nanus DM, Kelsen DP, Mentle IR. Infrequent point mutation of ras oncogenes in gastric cancers.
Gastroenterology, 1990;(4):955-962
6 Deng GR, Liu XH, Wang JR. Correlation of mutation of oncogene C-Ha-ras at codon 12 with
, http://www.100md.com
metastasis and survival of gastric cancer patients. Oncogene Res, 1991;6(1):33-38
7 Kihana T, Tsuda H, Hirota T, et al. Point mutation of C-Ki-ras oncogene in gastric adenoma
and adenocarcinoma with tubular differentiation. Jpn J Cancer Res, 1991;82(3):308-314
8 Hill SA. Clonal heterogeneity, experimental metastatic ability, and P21 expression in H-ras
transformed NIH 3T3 cells. J Natl Cancer Inst,1988;80(7):484-490, 百拇医药(房殿春,罗元辉,鲁荣,门荣甫,晋华源)
摘要
目的：胃癌发生发展的分子基础仍不甚明了，为了明确H-ras点突变在胃癌发生发展中的作用，本研究对胃癌组织H-ras点突变进行检测。
方法：采用多聚酶链延伸反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)对88例福尔马林液固定、石蜡包埋胃癌组织H-ras第12位和61位密码子点突变作了检测，并对点突变与肿瘤生物学行为及预后的关系进行分析。
结果：H-ras总突变率为14.8%(13/88)，点突变的发生与肿瘤浆膜浸润，淋巴结转移、临床分期及术后生存期密切相关。
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结论：检测胃癌组织H-ras基因点突变有助于判断胃癌患者的预后。
主题词 胃癌H-ras突变 多聚酶链延伸反应 限制性片段长度多态性分析
房殿春, 罗元辉, 鲁荣, 门荣甫, 晋华源.胃癌组织H-ras基因点突变与预后的关系.新消化病学杂志,1994;2(2):80-81
AIM The molecular basis of gastric cancer development ispoorly understood. In order to evalue the role of H-ras mutation in the progression of gastric cancer, we examined H-ras point mutation in gastric cancer.
, http://www.100md.com
METHODS Polymerase chain reaction and restrication fragmentlength polymorphisms (PCR-RFLP) analysis was performed on 88 formalin-fixed,paraffin-embedded gastric cancer tissues to determine the point mutation at codon 12 and 61 of H-ras gene. The relation between H-ras gene pointmutation and the tumor biology and prognosis was analysed.
RESULTS Point mutation was detected in 13/88(14.8%) of gastric cancer and the positivity of H-ras point mutation was related to the status of serosal invasion, lymph-node metastasis, stages and postsurgical survival period.
, http://www.100md.com
CONCLUSION Determination of H-ras point mutation in gastric cancer may be useful in predicting prognosis of patients with gastric cancer.
Keywords gastric cancer H-ras mutation PCR-RFLP
Fang DC, Luo YH, Lu R, Men RP, Jin HY. Study on the relation between H-ras gene point mutation and the prognosis of patients with gastric cancer.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1994;2(2):80-81
, http://www.100md.com
随着分子生物学技术的迅速发展，对肿瘤发生发展的研究已深入到分子水平。业已证明，癌基因ras突变在某些肿瘤的发生发展中起重要作用[1]。作者采用PCR-RFLP法对88例福尔马林液固定、石蜡包埋胃癌组织H-ras基因点突变进行分析，并探讨其与胃癌患者预后的关系。
1 材料和方法
1.1 组织标本 88例胃癌和30例大致正常胃粘膜组织为我院1978/1988年手术切除标本，均经10%福尔马林液固定、石蜡包埋，先切片1张，厚5μm， 行HE染色，用于病理诊断。另切同样厚度蜡片5张备用。
1.2 DNA提取 将胃癌组织片放入Eppendorf管中，二甲苯脱蜡，95%乙醇水化后，蛋白酶K消化，采用酚/氯仿抽提法提取DNA[2]。将提纯的DNA样品用TE缓冲液稀释，于紫外分光光度计上分别测定其在波长260nm及280nm时的吸收值，计算核酸的浓度和纯度。
, 百拇医药
1.3 引物设计 PCR引物由北京大学生命科学中心合成。H-ras基因第12位密码子引物顺序：P1A：5＇-CAGGGCCCTCCTTGGCAGG-3＇，为自H-ras第12位密码子正链上游非编码区第52～71核苷酸之间的序列；P1B：5＇-GTCGTATTCGTCCACAAAATGG-3＇，为负链第12位密码子突变位点下游第45～66核苷酸之间的序列。扩增片段长170bp，经限制性内切酶Hpa或Msp酶切，野生型被切为66+56+48bp 3个片段，突变型则切成122+48bp 2个片段。H-ras基因第61位密码子引物顺序：P2A：5＇-ACGTGCCTGTTGGACATCCT-3＇，为H-ras基因第61位密码子正链上游第15～34核苷酸之间的序列；P2B：5＇-CACACAGGAAGCCCTCCCCG-3＇，为负链下游第40～60核苷酸之间的序列。扩增片段长95bp，经限制性内切酶BstN1酶切，野生型被切成20+15+60bp 3个片段，突变型则切成20+75bp 2个片段。
1.4 PCR-RFLP分析 取约1μg组织DNA，溶于60μL PCR缓冲液(10mmol Tris HCl, 50mmol KCl,1.5mmol MgCl, 0.2mmol dATP, dGTP, dCTP和dTTP，1μmol引物，1～3μTaqDNA多聚酶)中，PCR扩增仪上操作(Perkin Elmer Cetus)： 95变性70s， 57复性70s，72延伸70s，重复以上循环40次，后于72放置10min。取10μLPCR产物用相应内切酶酶切(美国BRL公司产品)，4%聚丙烯酰胺电泳分离，溴乙锭染色后在紫外光透视板上观察并照像。
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1.5 患者随访 88例胃癌患者术后均随访5年以上，其中存活1年以上者64例，2年以上者49例，3年以上者36例，4年以上者32例，5年以上者26例。
2 结果
2.1 胃癌组织H-ras基因突变率 30例大致正常胃粘膜组织未发现有H-ras基因点突变者。88例胃癌有H-ras点突变13例，突变率为14.8%。其中H-ras 12位密码子突变12例(13.6%)，61位密码子突变3例(3.4%)。有一处密码子突变者11例，同时有两处密码子突变者2例。
2.2 H-ras突变与临床病理参数的关系 根据胃癌组织学分型、肿瘤大小、有无浆膜侵犯和淋巴结转移及临床病理分期的不同进行分组，各组H-ras基因突变率见表1。经统计学处理，有浆膜浸润组H-ras基因突变率显著高于无浆膜浸润组(P<0.05)；有淋巴结转移组H-ras突变率显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)；III、 IV期组H-ras突变率显著高于I, II期组(P<0.01)。其他各组间H-ras突变率则无显著差异(P>0.05)。
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2.3 H-ras基因点突变与胃癌患者存活期 88例胃癌患者5年存活情况见表2。经统计学处理，无H-ras点突变组2, 3, 4和5年的存活率均显著高于有H-ras点突变组(P<0.05)。
表1 H-ras点突变与临床病理参数的关系
| 临床病理参数 | 标本数 | 有突变(%) |
| 组织学类型 | ||
| 高中分化管状腺癌 | 23 | 2( 8.6) |
| 低分化癌 | 28 | 5(17.8) |
| 印戒细胞癌 | 24 | 4(16.6) |
| 粘液腺癌 | 13 | 2(15.4) |
| 肿瘤大小 | ||
| <5cm | 45 | 5(11.1) |
| >5cm | 43 | 8(18.6) |
| 浆膜浸润 | ||
| 未侵浆膜 | 33 | 2( 6.1) |
| 侵及浆膜 | 55 | 11(25.0)* |
| 淋巴结转移 | ||
| 无淋巴结转移 | 34 | 2( 5.8) |
| 有淋巴结转移 | 54 | 11(20.4)* |
| 临床分期 | ||
| I、II期 | 38 | 1( 2.6) |
| III、IV期 | 50 | 12(24.0)** |
, 百拇医药
*P<0.05, **P<0.01
表2 胃癌患者5年存活率与H-ras点突变的关系
| 组别 | n | 生存期(%) | ||||
| 1年 | 2年 | 3年 | 4年 | 5年 | ||
| 无H-ras点突变 | 75 | 56(74.7) | 45(60.0) | 34(41.3) | 31(41.3) | 26(34.7) |
| 有H-ras点突变 | 13 | 8(61.5) | 4(30.8)* | 2(15.4)* | 1( 7.7)* | 0( 0 )* |
, 百拇医药 *P<0.05.
3 讨论
癌基因ras族活化是某些肿瘤发生发展的分子基础。ras族基因由H-ras, K-ras和N-ras基因组成。点突变是ras族基因活化的重要方式，因此对肿瘤细胞ras基因点突变的检测一直是肿瘤工作者所致力于研究的热点。ras族基因第12位、13位和61位密码子的点突变可使其获得转化细胞的能力[3]。国外文献报道，ras基因的突变率在胰腺癌为90%，大肠癌为40%，胃癌则在10%以下[4，5]。国内邓国仁et al[6]检测我国胃癌标本发现，41%胃癌有H-ras第12位密码子点突变。本文采用PCR-RFLP法对88例石蜡包埋的胃癌组织进行分析，H-ras突变率为14.8%。日本学者报告胃癌主要是K-ras点突变[7]，而我国主要是H-ras基因的点突变[8]。这种突变率和突变位点的不同，可能与地理环境条件、种族、致癌原和检测方法的不同有关。 本研究还发现，H-ras基因点突变与胃癌的某些生物学行为有关。从本组资料看，肿瘤不同组织学类型和大小H-ras基因突变率无显著差异，而侵及浆膜者突变率显著高于未侵及浆膜者；有淋巴结转移者突变率明显高于无淋巴结转移者；Ⅲ, IV期胃癌患者显著高于Ⅰ, II期患者，此与国际上一些关于肿瘤浸润和转移的分子机制研究结果相一致。对88例胃癌患者进行5年以上的随访观察，结果发现无H-ras基因突变组术后5年存活率为34.7%，而13例有H-ras基因突变者无1例存活至5年，两组2年～5年存活率均有显著差别。因此，检测胃癌组织H-ras点突变不仅有助于了解胃癌的某些分子生物学行为，而且有可能成为判断胃癌患者预后的有用指标。 癌是基因疾病，这一概念已为愈来愈多的人所接受。本文对ras基因点突变的检测使我们对其在肿瘤发生发展过程中的作用有了进一步了解。然而从本组资料来看，大部分胃癌并未发现有H-ras基因点突变，说明其并非是仅有的导致胃癌发生发展的因素，可能还有其他基因或因素参与，这些需我们进一步研究和探索。
, 百拇医药
4 参考文献1 Koh EH, Chung HC, Lee KB, et al. Point mutation at condon 12 of the CHa-ras gene in human gastric
cancer. J Korean Med Sci, 1992;7(2):110-115
2 Goelz SE, Hamilton SR, Vogelstein B. Purification of DNA from formaldehydefixed and paraffin
embedded human tissue. Biochem Biophys Res Comm,1985;130(1):118-126
3 Barbacid M. Ras gene. Ann Rev Biochem, 1987;56(3):779-784
, http://www.100md.com
4 Neuman WL, Wasylyshyn ML, Jacoby R, et al. Evidence for a common molecular pathogenesis in
colorectal, gastric and pancreatic cancer. Cenes Chromosom Cancer, 1991;3(6):468-473
5 Nanus DM, Kelsen DP, Mentle IR. Infrequent point mutation of ras oncogenes in gastric cancers.
Gastroenterology, 1990;(4):955-962
6 Deng GR, Liu XH, Wang JR. Correlation of mutation of oncogene C-Ha-ras at codon 12 with
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metastasis and survival of gastric cancer patients. Oncogene Res, 1991;6(1):33-38
7 Kihana T, Tsuda H, Hirota T, et al. Point mutation of C-Ki-ras oncogene in gastric adenoma
and adenocarcinoma with tubular differentiation. Jpn J Cancer Res, 1991;82(3):308-314
8 Hill SA. Clonal heterogeneity, experimental metastatic ability, and P21 expression in H-ras
transformed NIH 3T3 cells. J Natl Cancer Inst,1988;80(7):484-490, 百拇医药(房殿春,罗元辉,鲁荣,门荣甫,晋华源)