肝纤维化大鼠血清有机膦酸酯酶的变化
项目负责人:孙自勤, 250031, 济南军区总医院消化科
摘要目的：探讨肝纤维化大鼠血清有机膦酸酯酶的变化。
方法：用四氯化碳诱导大鼠产生肝纤维化，分别于wk4, wk8, wk12, wk14, 用荧光分光法测定血清有机膦酸酯酶(PE)水平，并与血清PC III，HA进行比较。
结果：于实验wk4, wk8, wk12, wk14, 大鼠血清PE水平分别为168.6±40.0, 212.9±32.1, 271.5±40.6与243.1±83.1 IU/L，均明显高于正常大鼠(91.0±25.0 IU/L)，与血清PC III及HA呈显著正相关。
, 百拇医药
结论：肝纤维化时血清PE明显升高，且与肝纤维化程度呈正相关，可作为肝纤维化诊断的血清学指标之一。
主题词 肝纤维化;有机膦酸酯酶;大鼠
孙自勤, 王要军, 权启镇, 韩刚毅, 靳小红.肝纤维化大鼠血清有机膦酸酯酶的变化.新消化病学杂志,1994;2(4):206-207
AIM To study on the diagnostic value of serum phosphonate esterase for liver fibrosis.
METHODS Liver fibrosis was induced in rats with CCl4. Serum phosphonate esterase (PE) was measured by flurometry at 4,8,12,14 weeks after the first injection of CCl4. Serum type III procollagen (PC III) and hyaluronic acid (HA) were detected using radioimmunoassay.
, 百拇医药
RESULTS The serum levels of PE were 168.6±40.0 (4wk), 212.9±32.1(8wk), 271.5±40.6 (12wk) and 243.1±83.1 IU/L (14wk) respectiv ely, which were significantly higher than that in normal animals (91.0±25.0 IU/L). The changes of serum PE had a positive relation with serum PC Ⅲ and HA.
CONCLUSION Serum PE is strongly related to hepatic fibrosis. It can be used as a serum marker in liver fibrogenesis.
, 百拇医药 Keywords liver fibrosis;phosphonate esterase;rat
Sun ZQ, Wang YJ, Quan QZ, Han GY, Jin XH. Changes of serum phosphonate esterase in hepatic fibrosis in rats. Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1994;2(4):206-207
肝纤维化阶段是可以逆转的。早期诊断、及时治疗，可以防止其向肝硬变阶段过渡。传统的肝活检方法具有损伤性及不可避免的标本误差。迫切需要找到一种敏感性与特异性均较高的判定肝纤维化及其程度的非损伤性指标。我们用四氯化碳诱发大鼠肝纤维化，并动态测定了血清有机膦酸酯酶(PE)的变化，并与血清III型前胶原(PC Ⅲ)及透明质酸(HA)作了比较，探讨了PE对肝纤维化的诊断价值。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 动物 雄性 Wistar大鼠，体重280g～350g, 由山东医学科学院提供，自由进食与饮水。
1.2 主要试剂 鼠抗人Desmin单克隆抗体与Ⅲ型胶原抗体，均为Dako公司产品。四氯化碳，济南化工厂产品。PC Ⅲ 试剂盒，重庆肿瘤研究所提供。HA试剂盒，第二军医大学提供。4-甲基伞形酮苯基膦酸酯，由济南军区医学科学研究所提供。
1.3 肝纤维化动物模型 将四氯化碳用精制花生油配成40%溶液，按1.2mL/kg体重给上述大鼠皮下注射，2次/wk，共14wk。正常大鼠用同样方法皮下注射等量生理盐水作为对照。
1.4 测定指标 于注射四氯化碳后4，8，12，14wk末随机分批处死动物，收集血清与肝组织标本分别测定：①血清PE水平。取血清样品0.1mL，加双蒸水0.3mL，Tris-盐酸(1mol/L , pH 9.0) 0.1mL, lmmol/L底物0.5mL，37温育30min，用930型荧光光度计测定各管荧光强度[1]。放免法测定血清PC Ⅲ与HA，均按试剂盒说明书进行。免疫组化法测定肝内Ⅲ型胶原及Desmin阳性细胞[2]。肝组织HE染色及VG染色检查肝组织病理学及肝胶原纤维变化。
, 百拇医药
1.5 数据处理 各组间血清PE、PC Ⅲ, HA, FSC的显著性用F检验。并对PE与HA及PE与PC Ⅲ进行相关分析。
2 结果
2.1 肝脏病理及胶原纤维于实验wk4以肝细胞变性坏死及炎症为主 ，并有少量纤维组织沉积；wk8除肝细胞变性仍明显外，胶原纤维沿肝界板延伸呈细 纤维隔状，但无完整分隔形成；wk12肝纤维化继续加重，小叶间形成完整纤维隔，部分假小叶形成。
2.2 IV型胶原变化 正常对照组大鼠IV型胶原沉积于窦周，呈不连续线状分布，小血管基底亦 阳性。实验组大鼠于wk8 IV型胶原就明显增加，于窦周形成连续 网状，纤维增生处可见有IV型胶原阳性的成纤维细胞。肝界板处亦见IV型胶原沉积。
2.3 用抗Desmin抗体对肝组织免疫组化染色提示肝内FSC数目明显增加(表1)。
, 百拇医药
表1 Desmin阳性FSC变化(x-±s 个/Hp)
**P<0.01，vs 正常组。
2.4 血清PC III及HA变化 于实验第4周开始，大鼠血清PC Ⅲ与HA就明显高于正常，以后随肝纤维化 加深而升高更加明显(表2)。
, 百拇医药
2.5 血清PE水平变化 实验wk4开始，四氯化 碳中毒组大鼠血清PE水平显著高于正常动物(P<0.01)。wk8 与wk12升高更为明显。与肝纤维化程度呈正比。且与血清PC III及HA动态改变呈显著正相关，相关系数分别为r=0.967, P<0.01和r=0.989,P<0.01(表2)。
表2 血清PE, PC III与HA水平动态变化
, 百拇医药
*P<0.05，**P<0.01，实验组vs 正常组。
3 讨论
PE是韩刚毅et al[1,3]首先发现的存在于人及动物血清中能催化有机膦酸酯 键分解的酶。它广泛分布于肝、肠粘膜、肾、脾、心脏等组织中。该酶性质较为稳定，在37条件下温育6h活性无变化，-20下保存1a其活性仅损失5%。他们 还发现，肝病患者血清中PE活性较高，其中肝硬变患者最高，慢活肝次之。而其他疾病时均 无明显变化，提示该酶对于慢性肝病的诊断具有较好的特异性。 本研究发现,在实验性肝纤维化的过程中，PE水平明显升高，且与肝纤维化程度关系密切。细胞外基质，尤其是胶原，在肝内过度沉积是肝纤维化的基本病理改变。肝纤维化时Ⅰ，III，IV型胶原大量积聚，其中 Ⅰ，III型胶原广泛分布于肝脏间质，而IV型胶原则分布于窦内皮细胞下，IV型胶原过度沉积使肝窦毛细血管化，使肝血流和结构改变而加剧肝脏病变。FSC是肝纤维化发生与发展的关键细胞[4]。我们用四氯化碳诱导产生肝纤维化，胶原纤维，IV型胶原及FSC均大量增加，且血清PC III及HA水平也相应升高。血清PC III与HA被认为是较好地反映肝纤维化的指标[5，6]。本实验发现肝纤维化时PE升高与PC III，HA升高呈明显正相关，与肝纤维化程度呈正比，提示慢性肝病时该酶升高可能主要与肝纤维化有关。因此，我们认为，PE可作为肝纤维化诊断的血清学指标之一。 该酶在肝纤维化时血清中水平升高的具体机制还不清楚，有待进一步研究。
, 百拇医药
4 参考文献1 Han GY, Fan XH, Jin XB, et al. Specific detection and properties of enzyme
hydrolyzing phosphonate esterase in serum. Clin Chem, 1992；38(3)：377-380
2 王要军，孙自勤，权启镇，等. 汉防己甲素治疗大鼠实验性肝纤维化的研究. 临床肝胆病杂志，1993；9(增刊)：40-41
3 韩刚毅，靳晓红，范西红，等.血清磷酸酯酶在各种肝病中的意义.中国医学理论与实践，1991；1(1)：357-360
4 王要军.储脂细胞与肝纤维化.临床肝胆病杂志，1993；9(4)：182-184
5 李伟道，刘兴明，林丁，等.人Ⅲ型前胶原提取纯化与抗血清的制备应用于肝纤维化的诊断.
胃肠病学和肝病学杂志，1992；1(1)：44-46
6 孙自勤.肝纤维化血清学诊断进展.临床肝胆病杂志，1993；9(4)：175-178, http://www.100md.com(孙自勤,王要军,权启镇,韩刚毅,靳小红)
摘要目的：探讨肝纤维化大鼠血清有机膦酸酯酶的变化。
方法：用四氯化碳诱导大鼠产生肝纤维化，分别于wk4, wk8, wk12, wk14, 用荧光分光法测定血清有机膦酸酯酶(PE)水平，并与血清PC III，HA进行比较。
结果：于实验wk4, wk8, wk12, wk14, 大鼠血清PE水平分别为168.6±40.0, 212.9±32.1, 271.5±40.6与243.1±83.1 IU/L，均明显高于正常大鼠(91.0±25.0 IU/L)，与血清PC III及HA呈显著正相关。
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结论：肝纤维化时血清PE明显升高，且与肝纤维化程度呈正相关，可作为肝纤维化诊断的血清学指标之一。
主题词 肝纤维化;有机膦酸酯酶;大鼠
孙自勤, 王要军, 权启镇, 韩刚毅, 靳小红.肝纤维化大鼠血清有机膦酸酯酶的变化.新消化病学杂志,1994;2(4):206-207
AIM To study on the diagnostic value of serum phosphonate esterase for liver fibrosis.
METHODS Liver fibrosis was induced in rats with CCl4. Serum phosphonate esterase (PE) was measured by flurometry at 4,8,12,14 weeks after the first injection of CCl4. Serum type III procollagen (PC III) and hyaluronic acid (HA) were detected using radioimmunoassay.
, 百拇医药
RESULTS The serum levels of PE were 168.6±40.0 (4wk), 212.9±32.1(8wk), 271.5±40.6 (12wk) and 243.1±83.1 IU/L (14wk) respectiv ely, which were significantly higher than that in normal animals (91.0±25.0 IU/L). The changes of serum PE had a positive relation with serum PC Ⅲ and HA.
CONCLUSION Serum PE is strongly related to hepatic fibrosis. It can be used as a serum marker in liver fibrogenesis.
, 百拇医药 Keywords liver fibrosis;phosphonate esterase;rat
Sun ZQ, Wang YJ, Quan QZ, Han GY, Jin XH. Changes of serum phosphonate esterase in hepatic fibrosis in rats. Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1994;2(4):206-207
肝纤维化阶段是可以逆转的。早期诊断、及时治疗，可以防止其向肝硬变阶段过渡。传统的肝活检方法具有损伤性及不可避免的标本误差。迫切需要找到一种敏感性与特异性均较高的判定肝纤维化及其程度的非损伤性指标。我们用四氯化碳诱发大鼠肝纤维化，并动态测定了血清有机膦酸酯酶(PE)的变化，并与血清III型前胶原(PC Ⅲ)及透明质酸(HA)作了比较，探讨了PE对肝纤维化的诊断价值。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 动物 雄性 Wistar大鼠，体重280g～350g, 由山东医学科学院提供，自由进食与饮水。
1.2 主要试剂 鼠抗人Desmin单克隆抗体与Ⅲ型胶原抗体，均为Dako公司产品。四氯化碳，济南化工厂产品。PC Ⅲ 试剂盒，重庆肿瘤研究所提供。HA试剂盒，第二军医大学提供。4-甲基伞形酮苯基膦酸酯，由济南军区医学科学研究所提供。
1.3 肝纤维化动物模型 将四氯化碳用精制花生油配成40%溶液，按1.2mL/kg体重给上述大鼠皮下注射，2次/wk，共14wk。正常大鼠用同样方法皮下注射等量生理盐水作为对照。
1.4 测定指标 于注射四氯化碳后4，8，12，14wk末随机分批处死动物，收集血清与肝组织标本分别测定：①血清PE水平。取血清样品0.1mL，加双蒸水0.3mL，Tris-盐酸(1mol/L , pH 9.0) 0.1mL, lmmol/L底物0.5mL，37温育30min，用930型荧光光度计测定各管荧光强度[1]。放免法测定血清PC Ⅲ与HA，均按试剂盒说明书进行。免疫组化法测定肝内Ⅲ型胶原及Desmin阳性细胞[2]。肝组织HE染色及VG染色检查肝组织病理学及肝胶原纤维变化。
, 百拇医药
1.5 数据处理 各组间血清PE、PC Ⅲ, HA, FSC的显著性用F检验。并对PE与HA及PE与PC Ⅲ进行相关分析。
2 结果
2.1 肝脏病理及胶原纤维于实验wk4以肝细胞变性坏死及炎症为主 ，并有少量纤维组织沉积；wk8除肝细胞变性仍明显外，胶原纤维沿肝界板延伸呈细 纤维隔状，但无完整分隔形成；wk12肝纤维化继续加重，小叶间形成完整纤维隔，部分假小叶形成。
2.2 IV型胶原变化 正常对照组大鼠IV型胶原沉积于窦周，呈不连续线状分布，小血管基底亦 阳性。实验组大鼠于wk8 IV型胶原就明显增加，于窦周形成连续 网状，纤维增生处可见有IV型胶原阳性的成纤维细胞。肝界板处亦见IV型胶原沉积。
2.3 用抗Desmin抗体对肝组织免疫组化染色提示肝内FSC数目明显增加(表1)。
, 百拇医药
表1 Desmin阳性FSC变化(x-±s 个/Hp)
| 时间(wk) | 正常对照组 | 肝纤维化组 |
| 4 | 9.0±2.6 | 23.0±5.3** |
| 8 | 9.0±2.8 | 34.2±3.3** |
| 12 | 8.8±3.2 | 32.3±3.9** |
| 14 | 9.8±3.5 | 31.0±4.4** |
**P<0.01，vs 正常组。
2.4 血清PC III及HA变化 于实验第4周开始，大鼠血清PC Ⅲ与HA就明显高于正常，以后随肝纤维化 加深而升高更加明显(表2)。
, 百拇医药
2.5 血清PE水平变化 实验wk4开始，四氯化 碳中毒组大鼠血清PE水平显著高于正常动物(P<0.01)。wk8 与wk12升高更为明显。与肝纤维化程度呈正比。且与血清PC III及HA动态改变呈显著正相关，相关系数分别为r=0.967, P<0.01和r=0.989,P<0.01(表2)。
表2 血清PE, PC III与HA水平动态变化
| 时间 | PE(IU/L) | PC III(μg/L) | HA(μg/L) |
| 正常 | 91.0±25.0 | 50.2±7.2 | 65.2±10.5 |
| 4wk | 168.6±40.0* | 135.7±29.0* | 372.3±48.1** |
| 8wk | 212.9±32.1** | 268.2±53.9** | 440.0±112.2** |
| 12wk | 271.5±40.6** | 290.7±81.7** | 614.2±123.9** |
| 14wk | 243.1±83.1** | 270.2±46.1** | 565.2±161.9** |
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*P<0.05，**P<0.01，实验组vs 正常组。
3 讨论
PE是韩刚毅et al[1,3]首先发现的存在于人及动物血清中能催化有机膦酸酯 键分解的酶。它广泛分布于肝、肠粘膜、肾、脾、心脏等组织中。该酶性质较为稳定，在37条件下温育6h活性无变化，-20下保存1a其活性仅损失5%。他们 还发现，肝病患者血清中PE活性较高，其中肝硬变患者最高，慢活肝次之。而其他疾病时均 无明显变化，提示该酶对于慢性肝病的诊断具有较好的特异性。 本研究发现,在实验性肝纤维化的过程中，PE水平明显升高，且与肝纤维化程度关系密切。细胞外基质，尤其是胶原，在肝内过度沉积是肝纤维化的基本病理改变。肝纤维化时Ⅰ，III，IV型胶原大量积聚，其中 Ⅰ，III型胶原广泛分布于肝脏间质，而IV型胶原则分布于窦内皮细胞下，IV型胶原过度沉积使肝窦毛细血管化，使肝血流和结构改变而加剧肝脏病变。FSC是肝纤维化发生与发展的关键细胞[4]。我们用四氯化碳诱导产生肝纤维化，胶原纤维，IV型胶原及FSC均大量增加，且血清PC III及HA水平也相应升高。血清PC III与HA被认为是较好地反映肝纤维化的指标[5，6]。本实验发现肝纤维化时PE升高与PC III，HA升高呈明显正相关，与肝纤维化程度呈正比，提示慢性肝病时该酶升高可能主要与肝纤维化有关。因此，我们认为，PE可作为肝纤维化诊断的血清学指标之一。 该酶在肝纤维化时血清中水平升高的具体机制还不清楚，有待进一步研究。
, 百拇医药
4 参考文献1 Han GY, Fan XH, Jin XB, et al. Specific detection and properties of enzyme
hydrolyzing phosphonate esterase in serum. Clin Chem, 1992；38(3)：377-380
2 王要军，孙自勤，权启镇，等. 汉防己甲素治疗大鼠实验性肝纤维化的研究. 临床肝胆病杂志，1993；9(增刊)：40-41
3 韩刚毅，靳晓红，范西红，等.血清磷酸酯酶在各种肝病中的意义.中国医学理论与实践，1991；1(1)：357-360
4 王要军.储脂细胞与肝纤维化.临床肝胆病杂志，1993；9(4)：182-184
5 李伟道，刘兴明，林丁，等.人Ⅲ型前胶原提取纯化与抗血清的制备应用于肝纤维化的诊断.
胃肠病学和肝病学杂志，1992；1(1)：44-46
6 孙自勤.肝纤维化血清学诊断进展.临床肝胆病杂志，1993；9(4)：175-178, http://www.100md.com(孙自勤,王要军,权启镇,韩刚毅,靳小红)