一步夹心点免疫结合试验检测HBeAg
1广东省深圳市东湖医院肝病研究室 518020
2中山医科大学传染病教研室
项目负责人 周伯平,518020,广东省深圳市东湖医院肝病研究室 收搞日期 1995-08-06
Subject headings hepatitis B e entigens/analysis immunoassay
主题词 肝炎抗原，肝炎/分析;免疫测定
周伯平,姚集鲁.一步夹心点免疫结合试验检测HBeAg.新消化病学杂志，1996；4(7)：412-413
, 百拇医药
点免疫结合试验(DIA)是本世纪80年代发展的一种固相标记免疫测定技术[1，2]，具有敏感、特异、简便、快速、试剂稳定等优点.我们以硝酸纤维素膜(NC)为固相载体，采用单克隆抗体，建立了一种检测HBeAg的快速DIA法，报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 ①硝酸纤维素膜(NC)：美国Schleicher & Schuel公司产品，孔径0.45μm.②单克隆抗-HBe α与抗HBe β株的制备：按已报道方法[3]进行.③检测HBeAg的单克隆ELISA与RIA试剂盒：分别由中山医科大学肝炎研究室与北京生化免疫制剂中心提供.④盐酸联苯胺(DAB)底物溶液：取80mg DAB溶于100ml 0.01mol/L Tris·HCl溶液(pH 7.6)，4℃保存，临用前加入0.3% H2O2(H2O2最终浓度为0.03%).⑤洗涤液：含0.05%吐温20的Tris缓冲生理盐水溶液(TBST，pH 7.8).⑥检测标本：由中山医科大学附属三医院提供.
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1.2 方法 ①过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗-HBe α：采用过碘酸钠法.经方阵滴定酶标抗-HBe I作液浓度为1∶1500.②包被与封闭：取2μl抗-HBe β稀释液(1∶15)点在NC上，室温自然干燥后浸入2%牛血清白蛋白溶液中2h，干燥后装入塑料袋内4℃或-20℃保存备用.③检测步骤：将包被有抗-HBe的NC置入24孔组织培养板之孔中，先后加入0.1ml酶标抗-HBe与0.1ml待检血清，混匀后45℃反应1h，然后用TBST洗涤2次，吸干后加入DAB底物溶液，10-15min后观察反应结果.阳性者在NC上形成蓝色斑点，阴性者不显色.
2 结果
2.1 特异性 ①替代试验：用本法对HBeAg，HBsAg与HBcAg阳性血清进行检测，结果仅HBeAg显阳性反应，用HBsAg或HBcAg代替HBeAg则均为阴性.②中和试验：对20份经RIA与本法证实的HBeAg阳性血清，用抗-HBe进行阻断后再用本法进行检测，结果13份显阴性反应，7份为弱阳性，斑点颜色均较抑制前明显变浅.③对照试验：用本法检测30份经RIA法证实的HBeAg阳性血清，结果全部阳性.30份已知HBeAg阴性血清，用本法检测全部阴性.
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2.2 敏感性 分别用本法、单克隆抗体ELISA与RIA法对不同稀释度的HBeAg阳性血清系列进行平行检测以比较其敏感性，结果显示3种方法检出的最高稀释度分别为1∶2000，1∶2000与1∶3000.本法敏感性与ELISA法相当，较RIA低.
2.3 检测效果 分别用本法、ELISA与RIA法检测185例血清标本，HBeAg的检出率分别为37.8%，38.4%与40.0%.DIA与ELISA及RIA法检测结果的符合率分别为97.3%与95.7%.
2.4 试剂稳定性 用本法对20份血清标本重复测定3次(1次/d)，3次结果的符合率达100%.包被在NC上的抗体在室温干燥保存7d或4℃4周，其检测效果无明显改变.-20℃可保存4个月.
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3 讨论
本文所介绍的是一种改进的DIA技术，其主要特点是采用两株不同的单克隆抗-HBe分别作为固相包被与酶标抗体，将待检血清与酶标抗-HBe混合一期培育，这与常规夹心法ELISA或经典的夹心法DIA[4]采用两步分期培育有所不同.与后两者相比较，一步夹心法DIA操作步骤进一步简化，检测时间缩短一半.其原理是在HBeAg分子上存在有分别与两株不同的单克隆抗-HBe相结合的两个位点，当待检血清中HBeAg与HRP-抗-HBe α结合后仍可与吸附在NC上的抗-HBe β相结合[3].
替代试验、中和试验与对照试验结果表明本法具有较好的特异性.对185份临床标本平行检测，结果显示本法与ELISA及RIA法具有良好的一致性(结果符合率分别为97.3%与95.7%).包被在NC上的抗体稳定性较好，易于保存和运输.
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4 参考文献
1 陶义训.快速斑点免疫结合试验在医学检验中的应用评价.中华医学检验杂志，1994；17(4)：197
2 Renner SW. Immunoblotting and dot bimmunobinding: Emerging techniques in protein immunochemistry. Arch Pathol Lab
Med, 1988;112(8):780-786
3 姚集鲁，郑锡澄，郭万里.单克隆抗体ELISA-孔一期培育法检测HBeAg与抗-HBe.中华传染病杂志，1988；9(3)：165-167
4 Towbin H, Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding: Current status and outlook. J Immunol Methods, 1984;72(6):313-340, 百拇医药(周伯平1 姚集鲁2)
2中山医科大学传染病教研室
项目负责人 周伯平,518020,广东省深圳市东湖医院肝病研究室 收搞日期 1995-08-06
Subject headings hepatitis B e entigens/analysis immunoassay
主题词 肝炎抗原，肝炎/分析;免疫测定
周伯平,姚集鲁.一步夹心点免疫结合试验检测HBeAg.新消化病学杂志，1996；4(7)：412-413
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点免疫结合试验(DIA)是本世纪80年代发展的一种固相标记免疫测定技术[1，2]，具有敏感、特异、简便、快速、试剂稳定等优点.我们以硝酸纤维素膜(NC)为固相载体，采用单克隆抗体，建立了一种检测HBeAg的快速DIA法，报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 ①硝酸纤维素膜(NC)：美国Schleicher & Schuel公司产品，孔径0.45μm.②单克隆抗-HBe α与抗HBe β株的制备：按已报道方法[3]进行.③检测HBeAg的单克隆ELISA与RIA试剂盒：分别由中山医科大学肝炎研究室与北京生化免疫制剂中心提供.④盐酸联苯胺(DAB)底物溶液：取80mg DAB溶于100ml 0.01mol/L Tris·HCl溶液(pH 7.6)，4℃保存，临用前加入0.3% H2O2(H2O2最终浓度为0.03%).⑤洗涤液：含0.05%吐温20的Tris缓冲生理盐水溶液(TBST，pH 7.8).⑥检测标本：由中山医科大学附属三医院提供.
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1.2 方法 ①过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗-HBe α：采用过碘酸钠法.经方阵滴定酶标抗-HBe I作液浓度为1∶1500.②包被与封闭：取2μl抗-HBe β稀释液(1∶15)点在NC上，室温自然干燥后浸入2%牛血清白蛋白溶液中2h，干燥后装入塑料袋内4℃或-20℃保存备用.③检测步骤：将包被有抗-HBe的NC置入24孔组织培养板之孔中，先后加入0.1ml酶标抗-HBe与0.1ml待检血清，混匀后45℃反应1h，然后用TBST洗涤2次，吸干后加入DAB底物溶液，10-15min后观察反应结果.阳性者在NC上形成蓝色斑点，阴性者不显色.
2 结果
2.1 特异性 ①替代试验：用本法对HBeAg，HBsAg与HBcAg阳性血清进行检测，结果仅HBeAg显阳性反应，用HBsAg或HBcAg代替HBeAg则均为阴性.②中和试验：对20份经RIA与本法证实的HBeAg阳性血清，用抗-HBe进行阻断后再用本法进行检测，结果13份显阴性反应，7份为弱阳性，斑点颜色均较抑制前明显变浅.③对照试验：用本法检测30份经RIA法证实的HBeAg阳性血清，结果全部阳性.30份已知HBeAg阴性血清，用本法检测全部阴性.
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2.2 敏感性 分别用本法、单克隆抗体ELISA与RIA法对不同稀释度的HBeAg阳性血清系列进行平行检测以比较其敏感性，结果显示3种方法检出的最高稀释度分别为1∶2000，1∶2000与1∶3000.本法敏感性与ELISA法相当，较RIA低.
2.3 检测效果 分别用本法、ELISA与RIA法检测185例血清标本，HBeAg的检出率分别为37.8%，38.4%与40.0%.DIA与ELISA及RIA法检测结果的符合率分别为97.3%与95.7%.
2.4 试剂稳定性 用本法对20份血清标本重复测定3次(1次/d)，3次结果的符合率达100%.包被在NC上的抗体在室温干燥保存7d或4℃4周，其检测效果无明显改变.-20℃可保存4个月.
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3 讨论
本文所介绍的是一种改进的DIA技术，其主要特点是采用两株不同的单克隆抗-HBe分别作为固相包被与酶标抗体，将待检血清与酶标抗-HBe混合一期培育，这与常规夹心法ELISA或经典的夹心法DIA[4]采用两步分期培育有所不同.与后两者相比较，一步夹心法DIA操作步骤进一步简化，检测时间缩短一半.其原理是在HBeAg分子上存在有分别与两株不同的单克隆抗-HBe相结合的两个位点，当待检血清中HBeAg与HRP-抗-HBe α结合后仍可与吸附在NC上的抗-HBe β相结合[3].
替代试验、中和试验与对照试验结果表明本法具有较好的特异性.对185份临床标本平行检测，结果显示本法与ELISA及RIA法具有良好的一致性(结果符合率分别为97.3%与95.7%).包被在NC上的抗体稳定性较好，易于保存和运输.
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4 参考文献
1 陶义训.快速斑点免疫结合试验在医学检验中的应用评价.中华医学检验杂志，1994；17(4)：197
2 Renner SW. Immunoblotting and dot bimmunobinding: Emerging techniques in protein immunochemistry. Arch Pathol Lab
Med, 1988;112(8):780-786
3 姚集鲁，郑锡澄，郭万里.单克隆抗体ELISA-孔一期培育法检测HBeAg与抗-HBe.中华传染病杂志，1988；9(3)：165-167
4 Towbin H, Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding: Current status and outlook. J Immunol Methods, 1984;72(6):313-340, 百拇医药(周伯平1 姚集鲁2)