MTT比色法检测肝细胞再生刺激因子的生物活性
上海第二医科大学瑞金医院普外科 上海市 200025
项明，男，1963-11-21生，浙江省金华市人，汉族.1985年温州医学院毕业，1993年
上海第二医科大学研究生毕业，博士，普外科主治医师，讲师
项目负责人 项明,200025 上海市瑞金二路197号,上海市,上海第二医科大学瑞金医院普外科
Tel: 021-4370045-6041 收搞日期 1995-01-10 接收日期 1995-02-27
MTT colorimetric assay for the biological activity of hepatic stimulator substance
, 百拇医药
Ming Xiang, Yan-Zhen Lin, Shang-Lin Zhu and Yu-Bao Ji
Department of General Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai, 200025 China
Abstract
AIMS To establish a convenient, rapid and specific method for the determination the biological activity of hepatic stimulator
substance(HSS).
METHODS Mosmann's MTT colorimetric assay with some modification was used to test the activity of HSS, in comparison with the
, 百拇医药
〔3H〕TdR uptake assay. Hepatoma cell lines was used as target cells and the DMSO as a solvent. All tests were repeated 4 to 6 times.
RESULTS MTT assay could reflect the change in cell number over a wide range of concentrations similar to 〔3H〕TdR uptake assay with a HSS dose dependent curve.
CONCLUSIONS MTT assay is simple and sensitive in reflecting cellular survival and cellular growth, useful in clinical practise.
, http://www.100md.com
Subject headings colorimetry growth substances/analysis peptides/analysis tumor cells, cultured
Xiang M, Lin YZ, Zhu SL,Ji YB.MTT colorimetric assay for the biological activity of hepatic stimulator substance.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(8)：430-431
摘要
目的 建立一种简便、快速安全可靠的 肝细胞再生刺激因子生物活性的检 测方法.
, 百拇医药
方法 参照Mosmann的MTT比色法，加以改进，用体外培养的肝癌细胞株作靶细胞，二甲亚砜为终止反应剂，用BIO-TEK EL312酶标仪检测OD570-630值，来测试肝细胞再生刺激因子(HSS)的生物活性，并与〔3H〕TdR掺入法作比较.
结果 MTT比色法可灵敏地反映出细胞数量上的变化，在一定HSS剂量范围内，细胞增殖与HSS呈量效依赖关系. 同传统的〔3H〕TdR掺入法作比较，有良好的可比性.
结论 MTT比色法鉴定细胞存活和细胞生长，可在一般无菌室内操作，具有特异性高、快速、灵敏、方便等特点.
主题词 比色法;生长物质/分析;肽类/分析;肿瘤细胞，培养的
, http://www.100md.com
项明,林言箴,朱上林,纪玉宝.MTT比色法检测肝细胞再生刺激因子的生物活性.新消化病学杂志，1996；4(8)：430-431
1975年La Brecque等[1]从断乳鼠的肝脏中提取到一种物质，称为肝细胞刺激因子(hepatic stimulator substance, HSS)，因其能专一地刺激肝细胞增殖和再生，并具有逆转实验性肝衰的生物效应，而引起重视.随着对其理化、生物活性的深入研究，建立一种快速、简便、准确而又特异性高的活性检测方法，尤为关键.目前，传统检测活性的方法，均用〔3H〕TdR掺入法，操作过程繁琐，需放射性防护，且有环境污染之虞，应用受限[2，3].自Mosmann[4]首创MTT比色法测定IL-2活性以来，因其具有简便、快速、灵敏、准确的优点，而被越来越多地采用.本实验选用体外培养的肝癌细胞株，探讨应用MTT法检测HSS生物活性的可行性及适宜条件，并与〔3H〕TdR掺入法作比较.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 参照La Brecque，Francavilla等[1，5]所建立的方法加以改进.采用10-20kg雄性乳猪，在2.5%戊巴比妥钠静脉麻醉下，作部分肝切除(40%).术后48h，再次手术用4℃生理盐水行门静脉插管灌注.完整取下残肝，制成匀浆，并经加热、离心、酒精沉淀、Amicon超滤而获得HSS.采用SMMC-7721肝癌细胞株，体外传代，用时调整细胞浓度到1×105/ml.
1.2 MTT比色法 以完全RPMI1640培养液培养SMMC-7721等肝癌细胞株，用胰酶消化法，制成细胞悬液，浓度1×105/ml，接种到96孔平底培养板(美国Corning公司产品，每孔100μl(1×104个).设立加样组及阴性对照组，每个条件均设6复孔.在37℃，5%CO2下培养48h，弃去培养板每孔上清液，每孔加入100ml MTT溶液I溴化二甲噻唑二苯四氮唑3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Fluka公司产品(1mg/ml)，继续在原条件下培养4h，弃去培养板上清液，每孔再加入二甲亚砜(DMSO)100μl以终止反应，振荡数分钟，使MTT的还原产物甲
, 百拇医药
月赞 完全溶解，最后用BIO-TEKEL312酶标仪分别测量每孔OD570-630.
1.3 同位素掺入法 HSS加样组、阴性对照组之肝癌细胞株接种法完全同前一致，培养48h后，加入〔3H〕TdR(3H-胸腺嘧啶核苷，浓度37MBq/ml比放射强度740GBq/mmol.由上海原子能研究所提供)37KBq/孔，同条件下续培养2h后，每孔加入适量胰酶消化后，用多头细胞样品收集器(ZT-ⅣB型)，将细胞收集到玻璃纤维薄膜上，用蒸馏水冲洗3次，烘箱烤干玻璃纤维膜样本，分别放入瓶内加闪烁液(PPO和POPOP).用液闪仪测〔3H〕TdR掺入DNA量，结果表达为cpm/1×104细胞.
2 结果
, 百拇医药
2.1 细胞数量与甲 月赞 形成(OD)的关系先测定了不同细胞数量与MTT代谢产物甲月赞 形成的相关曲线.数值用图1表示，可见在一定范围内，细胞数量与甲 月赞 呈直线相关，说明MTT方法可灵敏地反映出细胞数量的变化，同Carmichael[6]的实验结果相一致.
图1 细胞数与甲月赞 的量呈直线相关
图2 HSS对SMMC-7721肝癌细胞株作用的量效曲线(用剂量与OD570-630值表示)
图3 HSS剂量与[3H]-TDR掺入量之关系
, http://www.100md.com
2.2 MTT法检测HSS生物活性 根据预试验，确定出待测HSS样品加样浓度范围，按一定剂量梯度，设立几个浓度组别，测得OD570-630值，如图2.表明在一定HSS剂量范围，细胞增殖与其呈量效依赖关系，但其增殖效应有一最高限值，当超过时，活性反有下降，其确切机理尚不明了.
2.3 〔3H〕TdR掺入法检测HSS生物活性 条件完全相同的另一复板，作〔3H〕TdR掺入法检测，结果见图3.可见，两种方法在一定范围内，均显示了HSS与肝细胞增殖间的量效依存关系，且具有良好的相关性.
3 讨论
, 百拇医药
近年来，有关肝脏再生机制的研究进展较快.现认为，肝细胞的再生受到HSS的调控[7].对HSS进一步深入研究，关键之一是建立可靠、快速的生物活性检测方法.传统的体内、体外检测方法均用到放射性同位素，而受到一定限制.本实验据Tim Mosmann 1983年创建的MTT比色法，进一步改善后，应用于HSS体外法活性检测.
MTT是一种有机盐染料，只和活细胞内具有活性的琥珀酸脱氢酶起反应，生成紫色(或蓝色)的甲 月赞 颗粒，被还原甲 月赞 的量同存活细胞数成正比.因脱氢酶只存在于活细胞线粒体内，而不存在于上清液中，故有较好特异性.培养和比色过程中毋需洗涤细胞，避免了细胞的丢失，减少了样品的误差.检测时用Bio-Tek多孔扫描酶标仪，比色分析不受人的主观因素影响，方便、迅速，每块96孔只需1-2min，故可同时检测大量样品.最后比色时，需加入溶细胞剂，溶解形成的甲 月赞 颗粒，由于培养液中酚红，改变均对比色读数有影响，故最终将反应后MTT液吸净，再加溶剂.我们实验中发现，酸性异丙醇溶解效果不彻底，改用DMSO后，获得理想结果.
, http://www.100md.com
MTT比色法作为细胞生长和存活的测定方法，采用细胞培养法，一般无菌室内即可操作，简便易行.具有特异性高、快速、灵敏、方便等特点，具有一定临床使用价值.
4 参考文献
1 LaBrecque DR, Pesh LA. Partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance from rat liver. J Physiol,1975; 248(2):273-284
2 孔祥平，郑国池，张宜俊，等.肝细胞刺激因子活性的实验研究.天津医药，1989；17(7)：401-404
3 李秀森.MTT比色法检测细胞存活和淋巴因子.免疫学杂志，1992；8(1)：67-68
, 百拇医药
4 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survial: Application to proliferation and cytotoxicity assays.
J Immunol Methods, 1983;65(6):55-63
5 Francavilla A, Dve P, Polimeno L, et al. Extraction and partial purification of a hepatic stimulatory substance in rats, mice and
dogs. Cancer Res, 1987;47(21):5600-5605
6 Carmichael J, DeGraff WG,Gazdar AF, et al. Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment
of chemosensitivity testing. Cancer Res, 1987;47(4):936-942
7 Bucher NLR, Liver regeneration: An overview. J Gastroenterol Hepatol, 1991;6(6):615-624, http://www.100md.com(项明 林言箴 朱上林 纪玉宝)
项明，男，1963-11-21生，浙江省金华市人，汉族.1985年温州医学院毕业，1993年
上海第二医科大学研究生毕业，博士，普外科主治医师，讲师
项目负责人 项明,200025 上海市瑞金二路197号,上海市,上海第二医科大学瑞金医院普外科
Tel: 021-4370045-6041 收搞日期 1995-01-10 接收日期 1995-02-27
MTT colorimetric assay for the biological activity of hepatic stimulator substance
, 百拇医药
Ming Xiang, Yan-Zhen Lin, Shang-Lin Zhu and Yu-Bao Ji
Department of General Surgery, Ruijin Hospital, Shanghai, 200025 China
Abstract
AIMS To establish a convenient, rapid and specific method for the determination the biological activity of hepatic stimulator
substance(HSS).
METHODS Mosmann's MTT colorimetric assay with some modification was used to test the activity of HSS, in comparison with the
, 百拇医药
〔3H〕TdR uptake assay. Hepatoma cell lines was used as target cells and the DMSO as a solvent. All tests were repeated 4 to 6 times.
RESULTS MTT assay could reflect the change in cell number over a wide range of concentrations similar to 〔3H〕TdR uptake assay with a HSS dose dependent curve.
CONCLUSIONS MTT assay is simple and sensitive in reflecting cellular survival and cellular growth, useful in clinical practise.
, http://www.100md.com
Subject headings colorimetry growth substances/analysis peptides/analysis tumor cells, cultured
Xiang M, Lin YZ, Zhu SL,Ji YB.MTT colorimetric assay for the biological activity of hepatic stimulator substance.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(8)：430-431
摘要
目的 建立一种简便、快速安全可靠的 肝细胞再生刺激因子生物活性的检 测方法.
, 百拇医药
方法 参照Mosmann的MTT比色法，加以改进，用体外培养的肝癌细胞株作靶细胞，二甲亚砜为终止反应剂，用BIO-TEK EL312酶标仪检测OD570-630值，来测试肝细胞再生刺激因子(HSS)的生物活性，并与〔3H〕TdR掺入法作比较.
结果 MTT比色法可灵敏地反映出细胞数量上的变化，在一定HSS剂量范围内，细胞增殖与HSS呈量效依赖关系. 同传统的〔3H〕TdR掺入法作比较，有良好的可比性.
结论 MTT比色法鉴定细胞存活和细胞生长，可在一般无菌室内操作，具有特异性高、快速、灵敏、方便等特点.
主题词 比色法;生长物质/分析;肽类/分析;肿瘤细胞，培养的
, http://www.100md.com
项明,林言箴,朱上林,纪玉宝.MTT比色法检测肝细胞再生刺激因子的生物活性.新消化病学杂志，1996；4(8)：430-431
1975年La Brecque等[1]从断乳鼠的肝脏中提取到一种物质，称为肝细胞刺激因子(hepatic stimulator substance, HSS)，因其能专一地刺激肝细胞增殖和再生，并具有逆转实验性肝衰的生物效应，而引起重视.随着对其理化、生物活性的深入研究，建立一种快速、简便、准确而又特异性高的活性检测方法，尤为关键.目前，传统检测活性的方法，均用〔3H〕TdR掺入法，操作过程繁琐，需放射性防护，且有环境污染之虞，应用受限[2，3].自Mosmann[4]首创MTT比色法测定IL-2活性以来，因其具有简便、快速、灵敏、准确的优点，而被越来越多地采用.本实验选用体外培养的肝癌细胞株，探讨应用MTT法检测HSS生物活性的可行性及适宜条件，并与〔3H〕TdR掺入法作比较.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 参照La Brecque，Francavilla等[1，5]所建立的方法加以改进.采用10-20kg雄性乳猪，在2.5%戊巴比妥钠静脉麻醉下，作部分肝切除(40%).术后48h，再次手术用4℃生理盐水行门静脉插管灌注.完整取下残肝，制成匀浆，并经加热、离心、酒精沉淀、Amicon超滤而获得HSS.采用SMMC-7721肝癌细胞株，体外传代，用时调整细胞浓度到1×105/ml.
1.2 MTT比色法 以完全RPMI1640培养液培养SMMC-7721等肝癌细胞株，用胰酶消化法，制成细胞悬液，浓度1×105/ml，接种到96孔平底培养板(美国Corning公司产品，每孔100μl(1×104个).设立加样组及阴性对照组，每个条件均设6复孔.在37℃，5%CO2下培养48h，弃去培养板每孔上清液，每孔加入100ml MTT溶液I溴化二甲噻唑二苯四氮唑3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Fluka公司产品(1mg/ml)，继续在原条件下培养4h，弃去培养板上清液，每孔再加入二甲亚砜(DMSO)100μl以终止反应，振荡数分钟，使MTT的还原产物甲
, 百拇医药
月赞 完全溶解，最后用BIO-TEKEL312酶标仪分别测量每孔OD570-630.
1.3 同位素掺入法 HSS加样组、阴性对照组之肝癌细胞株接种法完全同前一致，培养48h后，加入〔3H〕TdR(3H-胸腺嘧啶核苷，浓度37MBq/ml比放射强度740GBq/mmol.由上海原子能研究所提供)37KBq/孔，同条件下续培养2h后，每孔加入适量胰酶消化后，用多头细胞样品收集器(ZT-ⅣB型)，将细胞收集到玻璃纤维薄膜上，用蒸馏水冲洗3次，烘箱烤干玻璃纤维膜样本，分别放入瓶内加闪烁液(PPO和POPOP).用液闪仪测〔3H〕TdR掺入DNA量，结果表达为cpm/1×104细胞.
2 结果
, 百拇医药
2.1 细胞数量与甲 月赞 形成(OD)的关系先测定了不同细胞数量与MTT代谢产物甲月赞 形成的相关曲线.数值用图1表示，可见在一定范围内，细胞数量与甲 月赞 呈直线相关，说明MTT方法可灵敏地反映出细胞数量的变化，同Carmichael[6]的实验结果相一致.
图1 细胞数与甲月赞 的量呈直线相关
图2 HSS对SMMC-7721肝癌细胞株作用的量效曲线(用剂量与OD570-630值表示)
图3 HSS剂量与[3H]-TDR掺入量之关系
, http://www.100md.com
2.2 MTT法检测HSS生物活性 根据预试验，确定出待测HSS样品加样浓度范围，按一定剂量梯度，设立几个浓度组别，测得OD570-630值，如图2.表明在一定HSS剂量范围，细胞增殖与其呈量效依赖关系，但其增殖效应有一最高限值，当超过时，活性反有下降，其确切机理尚不明了.
2.3 〔3H〕TdR掺入法检测HSS生物活性 条件完全相同的另一复板，作〔3H〕TdR掺入法检测，结果见图3.可见，两种方法在一定范围内，均显示了HSS与肝细胞增殖间的量效依存关系，且具有良好的相关性.
3 讨论
, 百拇医药
近年来，有关肝脏再生机制的研究进展较快.现认为，肝细胞的再生受到HSS的调控[7].对HSS进一步深入研究，关键之一是建立可靠、快速的生物活性检测方法.传统的体内、体外检测方法均用到放射性同位素，而受到一定限制.本实验据Tim Mosmann 1983年创建的MTT比色法，进一步改善后，应用于HSS体外法活性检测.
MTT是一种有机盐染料，只和活细胞内具有活性的琥珀酸脱氢酶起反应，生成紫色(或蓝色)的甲 月赞 颗粒，被还原甲 月赞 的量同存活细胞数成正比.因脱氢酶只存在于活细胞线粒体内，而不存在于上清液中，故有较好特异性.培养和比色过程中毋需洗涤细胞，避免了细胞的丢失，减少了样品的误差.检测时用Bio-Tek多孔扫描酶标仪，比色分析不受人的主观因素影响，方便、迅速，每块96孔只需1-2min，故可同时检测大量样品.最后比色时，需加入溶细胞剂，溶解形成的甲 月赞 颗粒，由于培养液中酚红，改变均对比色读数有影响，故最终将反应后MTT液吸净，再加溶剂.我们实验中发现，酸性异丙醇溶解效果不彻底，改用DMSO后，获得理想结果.
, http://www.100md.com
MTT比色法作为细胞生长和存活的测定方法，采用细胞培养法，一般无菌室内即可操作，简便易行.具有特异性高、快速、灵敏、方便等特点，具有一定临床使用价值.
4 参考文献
1 LaBrecque DR, Pesh LA. Partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance from rat liver. J Physiol,1975; 248(2):273-284
2 孔祥平，郑国池，张宜俊，等.肝细胞刺激因子活性的实验研究.天津医药，1989；17(7)：401-404
3 李秀森.MTT比色法检测细胞存活和淋巴因子.免疫学杂志，1992；8(1)：67-68
, 百拇医药
4 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survial: Application to proliferation and cytotoxicity assays.
J Immunol Methods, 1983;65(6):55-63
5 Francavilla A, Dve P, Polimeno L, et al. Extraction and partial purification of a hepatic stimulatory substance in rats, mice and
dogs. Cancer Res, 1987;47(21):5600-5605
6 Carmichael J, DeGraff WG,Gazdar AF, et al. Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment
of chemosensitivity testing. Cancer Res, 1987;47(4):936-942
7 Bucher NLR, Liver regeneration: An overview. J Gastroenterol Hepatol, 1991;6(6):615-624, http://www.100md.com(项明 林言箴 朱上林 纪玉宝)