小鼠肝细胞细胞色素P450 1A1/1A2诱导的免疫细胞化学研究
四川省成都市第三人民医院消化内科 610031
赵聪，男，1962-01-26生，北京市人，汉族.1983年重庆医科大学医学系毕业，主治医师，主要从事消化病的诊治研究，发表论文10篇.现在美国韦恩大学医学院作访问学者
项目负责人 赵聪,610031,四川省成都市第三人民医院消化内科
Tel: 0313-5776461， 0313-5775482收搞日期 1995-03-23 接收日期 1995-04-30
Induction of cytochrome P450 1A1/1A2 in mouse hepatocytes by β-naphthoflavone: a immunocytochemical study
, http://www.100md.com
Cong Zhao and Yao-Xia Zhou
Department of Gastroenterology, Chengdu Third municipal People's Hospital, Chengdu 610031 Sichuan Province, China
Abstract
AIMS To study the induction of cytochrome P450 1A1/1A2 by β-naphthoflavone in mouse hepatocytes immunocytochemically.
METHODS C57BL/6N and DBA/2 mice were given β-naphthoflavone, 200mg/kg BW in corn oil (experomedtal group) or corn oil alone (control group) intraperitoneally. Animals were sacrificed at 0,24,48,72 and 96 hours after injection. Induction of P450 1A1/1A2 was detected in hepatocytes by using goat anti-P450 1A1/1A2 antibody (primary antibody) and rabbit anti-goat, gold conjugated antibody (secondary antibody). Ultrathin sections were examined with electron microscope.
, 百拇医药
RESULTS Gold particles were found in association with endoplasmic reticulum in C57BL/6N mouse hepatocytes after treatment with β-naphthoflavone. The P450 1A1/1A2 activity was increasing at 24 hours(38.6±3.7), reaching maximum at 48 hours(76.4±5.8), then declining gradually. There was no gold particle found in DBA/2 mice.
CONCLUSIONS The cytochrome P450 1A1/1A2 activity is greatly induced by β-naphthoflavone in C57 BL/6N mouse hepatocytes and reaches the maximum at 48 hours. The enzymatic activity can not be further enhanced by increasing the dose of the inducer. DBA/2 mice are non-responsive to this inducer.
, 百拇医药
Subject headings cytochrome P450/metabolism liver/enzymology immunohistochemistry
Zhao C,Zhou YX.Induction of cytochrome P450 1A1/1A2 in mouse hepatocytes by β-naphthoflavone: a immunocytochemical study.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(8)：434-435
摘要
目的 小鼠肝细胞细胞色素P450 1A1/1A2的免疫细胞化学研究.
, 百拇医药
方法 应用免疫细胞化学的方法研究了诱导剂β-萘酚黄酮对C57BL/6N和DBA/2小鼠肝细胞中细胞色素P4501A1/1A2的诱导.
结果 免疫电镜发现，C57BL/6N 实验组小鼠肝细胞内质网上有大量胶体金标记抗体结合，对照组则无类似改变.
DBA/2实验组和对照组未发现有金颗粒结合.
结论 C57 BL/6N 小鼠肝细胞P4501A1/1A2活性在诱导剂注射后48h达高峰. 增加诱导剂剂量并不相应增高该酶活性的表达.
, http://www.100md.com 主题词 免疫组织/化学;肝/酶学;细胞色素P450/代谢
赵聪,周耀霞.小鼠肝细胞细胞色素P450 1A1/1A2诱导的免疫细胞化学研究.新消化病学杂志，1996；4(8)：434-435
尽管大量研究已经表明，许多肝外组织参与药物的体内代谢[1]，然而肝脏仍然是机体药物代谢的主要器官.细胞色素P450作为药物代谢的主要参与酶之一已受到广泛深入的研究.既往多采用分离微粒体的方法而测定酶的活性水平，近来由于P4501A1/1A2抗体的商品化供应，使人们得以应用免疫细胞化学的方法直接研究其在细胞内的诱导和分布.作者应用免疫电镜方法研究由萘酚黄酮(β-naphthoflavone，β-NF)诱导的细胞色素P450 1A1/1A2在小鼠肝细胞中的表达，并探讨其意义.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 C57BL/6N (B6)和DBA/2(D2)小鼠(4周，体重18.21±1.64g，购自Harlan Sprague Dawley Inc)，分别分为实验组和对照组.实验组小鼠给予200mg/kg体重的β-NF(购自Aldrich)溶于0.3ml的玉米油中，一次 性腹腔内注射.对照组仅给予同等剂量的玉米油.注射后小鼠被喂养在有自动白昼循环调节装置的动物室中并避免其接触其它活性化合物如杀虫剂、香烟等.48h后，处死小鼠并立即取肝脏供研究.为观察诱导剂注射后不同时间小鼠肝细胞P450 1A1/1A2活性水平，另取10只B6小鼠用上述方法注入诱导剂后，分别于0，24，48，72和96h时各处死2只供研究.为探讨不同剂量的诱导剂对该酶活性的影响，B6和D2(各12只)被分别给予200，300和500mg/kg体重的β-NF，并于48h处死，取肝脏供研究.
, 百拇医药
1.2 方法 小鼠肝脏被切成1mm3大小，浸泡于PLP固定液中(含4%多聚甲醛，50mM L-赖氨酸，10mM过碘酸钠和7.5%蔗糖，pH 7.4)，4℃，共3h.磷酸缓冲液洗涤后逐级酒精脱水.浸透于90%酒精和LR White(购自Polysciences)混合液(2∶1，1∶1和1∶2中，20℃下各60min)以及纯L.R White中20℃过夜.最后用纯L.R White包埋于有盖胶囊中，45℃烤箱中聚合72h.60nm的超薄切片用含1%小牛血清白蛋白，10%正常兔血清及0.01%吐温20的Tris缓冲液20℃阻断30min，继而用羊抗P450 1A1/1A2抗体(第1抗体)，购自Oxford Biorned, Res. Co.)20℃孵育90min(1∶200稀释于含1%小牛血清白蛋白的Tris缓冲液中).洗涤后用1∶40的兔抗羊胶体金标记抗体(第2抗体，购自Sigma)20℃下孵育60min.5%醋酸铀染色后电镜下观察.另用免疫前血清替代第1抗体作为免疫细胞化学对照.
, http://www.100md.com
1.3 胶体金标记抗体结合密度 为计算胶体金标记抗体在肝细胞中的结合密度，在从取自实验组和对照组每一小鼠肝脏标本制成的每一张超薄切片中，拍摄20张放大倍数为15*#000倍的电镜照片，用测试格计算单位面积内的金颗粒数.结合密度用每平方微米金颗粒的均数表示.
2 结果
实验组B6肝细胞中可见内质网上有大量金标记抗体结合，而细胞核和线粒体上则缺如.对照组B6无结合的金颗粒可见.无论实验组或对照组的D2肝细胞内均未见有金标记抗体结合.用免疫前血清替代第1抗体的免疫细胞化学对照实验，其结合未发现有金标记抗体结合.
2.1 β-NF对P450 1A1/1A2的诱导与时间的关系 如图1所示，诱导剂注射后24h，B6肝细胞中P450 1A1/1A2活性开始增高(38.6±3.7)，至48h达高峰(76.4±5.8)，继而缓慢下降(72h时为74.6±6.5，96h时为71.3±4.9.
, http://www.100md.com
图1 β-NF对P450 1A1/1A2的诱导与时间的关系
2.2 不同剂量诱导剂对P450 1A1/1A2活性的影响 接受200mg/kg体重的B6小鼠48h时其胶体金标记抗体结合数为72.4±4.6，300mg的B6为76.4±5.8，500mg的为78.6±6.5.3种剂量间的金颗粒数无显著性差异(P>0.05)，提示增加剂量并不相应增加单个肝细胞中该酶活性的诱导，而D2小鼠在任何剂量下均未发现有该酶活性诱导发生.
3 讨论
, 百拇医药
目前已发现[1]由17个基因簇所编码的不同的P450酶，其中P4501A1/1A2指能被MC类诱导剂诱导的P450酶，如β-NF等[2].本文应用免疫细胞化学方法亦证实由MC类诱导剂诱发的P450 1A1/1A2只发生在B6，而D2则无反应，同其它方法所得到的结果相同.免疫电镜发现，诱导后产生的酶活性分布于肝细胞的内质网上，其它细胞结构则缺乏该酶活性，说明内质网在药物代谢中的重要地位，这与Nebert等[1]用制成细胞匀浆后分离微粒体以探讨该酶分布的研究结果相同.诱导剂注入后24h，P450 1A1/1A2活性开始升高，48h达高峰，继而缓慢下降.诱导后的酶活性较诱导前增高约66倍左右，这同其它直接测定酶活性的方法所报道的50-100倍结果一致[1].有学者应用不同剂量的3-methylcholanthrene对大鼠肝脏内的P450 1A1/1A2的分布进行研究[3]，结果发现低剂量时，酶活性呈不均态分布，以中央静脉周围最高；高剂量时则呈均态分布.我们以不同剂量的β-NF研究小鼠个体肝细胞中酶活性的诱导，发现200mg/kg体重已在B6小鼠个体肝细胞中诱导出最大酶活性，再增大剂量并不相应增加酶活性的诱导.D2小鼠则在任何剂量下均未发现有酶活性诱导的发生.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Nebert DW. The ah locus: genetic differences in toxicity, cancer, mutation and birth defects. Crit Rev Toxicol,1989;20(3):153-174
2 Jnchau MR. Substrate speclities and functions of the P450 cytochromes. Life Sci, 1990;47(26):2385-2394
3 Sliedregt AV, Bezooijen CFA. Effect of different doses of 3-methylcholanthrene on the localization of the
3-methylcholanthrene-inducible isozymes of cytochrome P450 within the centrilobular and periportal zones of the rat liver.
Biochem Pharm, 1990;39(11):1703-1708, http://www.100md.com(赵聪 周耀霞)
赵聪，男，1962-01-26生，北京市人，汉族.1983年重庆医科大学医学系毕业，主治医师，主要从事消化病的诊治研究，发表论文10篇.现在美国韦恩大学医学院作访问学者
项目负责人 赵聪,610031,四川省成都市第三人民医院消化内科
Tel: 0313-5776461， 0313-5775482收搞日期 1995-03-23 接收日期 1995-04-30
Induction of cytochrome P450 1A1/1A2 in mouse hepatocytes by β-naphthoflavone: a immunocytochemical study
, http://www.100md.com
Cong Zhao and Yao-Xia Zhou
Department of Gastroenterology, Chengdu Third municipal People's Hospital, Chengdu 610031 Sichuan Province, China
Abstract
AIMS To study the induction of cytochrome P450 1A1/1A2 by β-naphthoflavone in mouse hepatocytes immunocytochemically.
METHODS C57BL/6N and DBA/2 mice were given β-naphthoflavone, 200mg/kg BW in corn oil (experomedtal group) or corn oil alone (control group) intraperitoneally. Animals were sacrificed at 0,24,48,72 and 96 hours after injection. Induction of P450 1A1/1A2 was detected in hepatocytes by using goat anti-P450 1A1/1A2 antibody (primary antibody) and rabbit anti-goat, gold conjugated antibody (secondary antibody). Ultrathin sections were examined with electron microscope.
, 百拇医药
RESULTS Gold particles were found in association with endoplasmic reticulum in C57BL/6N mouse hepatocytes after treatment with β-naphthoflavone. The P450 1A1/1A2 activity was increasing at 24 hours(38.6±3.7), reaching maximum at 48 hours(76.4±5.8), then declining gradually. There was no gold particle found in DBA/2 mice.
CONCLUSIONS The cytochrome P450 1A1/1A2 activity is greatly induced by β-naphthoflavone in C57 BL/6N mouse hepatocytes and reaches the maximum at 48 hours. The enzymatic activity can not be further enhanced by increasing the dose of the inducer. DBA/2 mice are non-responsive to this inducer.
, 百拇医药
Subject headings cytochrome P450/metabolism liver/enzymology immunohistochemistry
Zhao C,Zhou YX.Induction of cytochrome P450 1A1/1A2 in mouse hepatocytes by β-naphthoflavone: a immunocytochemical study.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(8)：434-435
摘要
目的 小鼠肝细胞细胞色素P450 1A1/1A2的免疫细胞化学研究.
, 百拇医药
方法 应用免疫细胞化学的方法研究了诱导剂β-萘酚黄酮对C57BL/6N和DBA/2小鼠肝细胞中细胞色素P4501A1/1A2的诱导.
结果 免疫电镜发现，C57BL/6N 实验组小鼠肝细胞内质网上有大量胶体金标记抗体结合，对照组则无类似改变.
DBA/2实验组和对照组未发现有金颗粒结合.
结论 C57 BL/6N 小鼠肝细胞P4501A1/1A2活性在诱导剂注射后48h达高峰. 增加诱导剂剂量并不相应增高该酶活性的表达.
, http://www.100md.com 主题词 免疫组织/化学;肝/酶学;细胞色素P450/代谢
赵聪,周耀霞.小鼠肝细胞细胞色素P450 1A1/1A2诱导的免疫细胞化学研究.新消化病学杂志，1996；4(8)：434-435
尽管大量研究已经表明，许多肝外组织参与药物的体内代谢[1]，然而肝脏仍然是机体药物代谢的主要器官.细胞色素P450作为药物代谢的主要参与酶之一已受到广泛深入的研究.既往多采用分离微粒体的方法而测定酶的活性水平，近来由于P4501A1/1A2抗体的商品化供应，使人们得以应用免疫细胞化学的方法直接研究其在细胞内的诱导和分布.作者应用免疫电镜方法研究由萘酚黄酮(β-naphthoflavone，β-NF)诱导的细胞色素P450 1A1/1A2在小鼠肝细胞中的表达，并探讨其意义.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 C57BL/6N (B6)和DBA/2(D2)小鼠(4周，体重18.21±1.64g，购自Harlan Sprague Dawley Inc)，分别分为实验组和对照组.实验组小鼠给予200mg/kg体重的β-NF(购自Aldrich)溶于0.3ml的玉米油中，一次 性腹腔内注射.对照组仅给予同等剂量的玉米油.注射后小鼠被喂养在有自动白昼循环调节装置的动物室中并避免其接触其它活性化合物如杀虫剂、香烟等.48h后，处死小鼠并立即取肝脏供研究.为观察诱导剂注射后不同时间小鼠肝细胞P450 1A1/1A2活性水平，另取10只B6小鼠用上述方法注入诱导剂后，分别于0，24，48，72和96h时各处死2只供研究.为探讨不同剂量的诱导剂对该酶活性的影响，B6和D2(各12只)被分别给予200，300和500mg/kg体重的β-NF，并于48h处死，取肝脏供研究.
, 百拇医药
1.2 方法 小鼠肝脏被切成1mm3大小，浸泡于PLP固定液中(含4%多聚甲醛，50mM L-赖氨酸，10mM过碘酸钠和7.5%蔗糖，pH 7.4)，4℃，共3h.磷酸缓冲液洗涤后逐级酒精脱水.浸透于90%酒精和LR White(购自Polysciences)混合液(2∶1，1∶1和1∶2中，20℃下各60min)以及纯L.R White中20℃过夜.最后用纯L.R White包埋于有盖胶囊中，45℃烤箱中聚合72h.60nm的超薄切片用含1%小牛血清白蛋白，10%正常兔血清及0.01%吐温20的Tris缓冲液20℃阻断30min，继而用羊抗P450 1A1/1A2抗体(第1抗体)，购自Oxford Biorned, Res. Co.)20℃孵育90min(1∶200稀释于含1%小牛血清白蛋白的Tris缓冲液中).洗涤后用1∶40的兔抗羊胶体金标记抗体(第2抗体，购自Sigma)20℃下孵育60min.5%醋酸铀染色后电镜下观察.另用免疫前血清替代第1抗体作为免疫细胞化学对照.
, http://www.100md.com
1.3 胶体金标记抗体结合密度 为计算胶体金标记抗体在肝细胞中的结合密度，在从取自实验组和对照组每一小鼠肝脏标本制成的每一张超薄切片中，拍摄20张放大倍数为15*#000倍的电镜照片，用测试格计算单位面积内的金颗粒数.结合密度用每平方微米金颗粒的均数表示.
2 结果
实验组B6肝细胞中可见内质网上有大量金标记抗体结合，而细胞核和线粒体上则缺如.对照组B6无结合的金颗粒可见.无论实验组或对照组的D2肝细胞内均未见有金标记抗体结合.用免疫前血清替代第1抗体的免疫细胞化学对照实验，其结合未发现有金标记抗体结合.
2.1 β-NF对P450 1A1/1A2的诱导与时间的关系 如图1所示，诱导剂注射后24h，B6肝细胞中P450 1A1/1A2活性开始增高(38.6±3.7)，至48h达高峰(76.4±5.8)，继而缓慢下降(72h时为74.6±6.5，96h时为71.3±4.9.
, http://www.100md.com
图1 β-NF对P450 1A1/1A2的诱导与时间的关系
2.2 不同剂量诱导剂对P450 1A1/1A2活性的影响 接受200mg/kg体重的B6小鼠48h时其胶体金标记抗体结合数为72.4±4.6，300mg的B6为76.4±5.8，500mg的为78.6±6.5.3种剂量间的金颗粒数无显著性差异(P>0.05)，提示增加剂量并不相应增加单个肝细胞中该酶活性的诱导，而D2小鼠在任何剂量下均未发现有该酶活性诱导发生.
3 讨论
, 百拇医药
目前已发现[1]由17个基因簇所编码的不同的P450酶，其中P4501A1/1A2指能被MC类诱导剂诱导的P450酶，如β-NF等[2].本文应用免疫细胞化学方法亦证实由MC类诱导剂诱发的P450 1A1/1A2只发生在B6，而D2则无反应，同其它方法所得到的结果相同.免疫电镜发现，诱导后产生的酶活性分布于肝细胞的内质网上，其它细胞结构则缺乏该酶活性，说明内质网在药物代谢中的重要地位，这与Nebert等[1]用制成细胞匀浆后分离微粒体以探讨该酶分布的研究结果相同.诱导剂注入后24h，P450 1A1/1A2活性开始升高，48h达高峰，继而缓慢下降.诱导后的酶活性较诱导前增高约66倍左右，这同其它直接测定酶活性的方法所报道的50-100倍结果一致[1].有学者应用不同剂量的3-methylcholanthrene对大鼠肝脏内的P450 1A1/1A2的分布进行研究[3]，结果发现低剂量时，酶活性呈不均态分布，以中央静脉周围最高；高剂量时则呈均态分布.我们以不同剂量的β-NF研究小鼠个体肝细胞中酶活性的诱导，发现200mg/kg体重已在B6小鼠个体肝细胞中诱导出最大酶活性，再增大剂量并不相应增加酶活性的诱导.D2小鼠则在任何剂量下均未发现有酶活性诱导的发生.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Nebert DW. The ah locus: genetic differences in toxicity, cancer, mutation and birth defects. Crit Rev Toxicol,1989;20(3):153-174
2 Jnchau MR. Substrate speclities and functions of the P450 cytochromes. Life Sci, 1990;47(26):2385-2394
3 Sliedregt AV, Bezooijen CFA. Effect of different doses of 3-methylcholanthrene on the localization of the
3-methylcholanthrene-inducible isozymes of cytochrome P450 within the centrilobular and periportal zones of the rat liver.
Biochem Pharm, 1990;39(11):1703-1708, http://www.100md.com(赵聪 周耀霞)