金标记表皮生长因子在大肠癌细胞的定位循环
第一军医大学南方医院肿瘤科 广东省广州市 510515
刘国龙，男，1964-09-08生，江苏省溧阳市人，汉族.1987年苏州医学院医学系毕业，主治医师，讲师，主要从事肿瘤的诊治研究，发表相关论文22篇
项目负责人 刘国龙,510515 广东省广州市,第一军医大学南方医院肿瘤科
收搞日期 1995-07-25 接收日期 1996-01-02
Localication dynamics of EGF-R on HT-29 cells by electron-microscope
Guo-Long Liu, Wan-Dai Zhang, Yu-Gang Song, Jin-Han Li and Dian-Yuan Zhou
, http://www.100md.com
Department of Oncology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515 Guangdong Province, China
Abstract
AIMS Observation of the EGF-R location and cycle in HT-29 cells by using Au-EGF.
METHODS Au-EGF as a marker was used in observation of EGF-R in HT-29 cells by transparent electron-microscope continusly for
, http://www.100md.com
120 minites.
RESULTS Au-EGF binded to EGF-R in few minites to 120 minites, Au-EGF-EGF-R mainly located on cellular membrane of the HT-29 cells in frist 10 minites, at 10-20 minites Au-EGF-EGF-R were endocytosised to cytoplasm and few to the nucleus; after 30 minites most Au-EGF-EGF-R disappeared from cytoplasm exept few in the nucleus, some EGF-R returned to cell membrane.
CONCLUSIONS EGF-R are mainly on the membrane of HT-29 cells, but when it binds to EGF, EGF-R endocytosis and cycling occur.
, http://www.100md.com
Subject headings epidermal growth factor-urogastronecolorectal neoplasms microscopy, electron
Liu GL, Zhang WD, Song YG, Li JH,Zhou DY.Localication dynamics of EGF-R on HT-29 cells by electron-microscope.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(9)：485-486
摘要
目的 观察大肠癌细胞上EGF-R与EGF-Au结合后定位、内吞、循环和代谢过程.
, http://www.100md.com
方法 应用透射电镜观察胶体金标记的表皮生长因子(Au-EGF)与HT-29细胞上EGF-R的作用过程.
结果 发现加入Au-EGF数分钟就结合于细胞膜上EGF-R，10 min内金颗粒主要储存中于细胞膜，10-20 min主要散布于细胞浆，细胞核内也有少量金颗粒存在，30-50 min胞浆中金颗粒逐渐减少消失，小部分金颗粒重又返回细胞膜. 完成一个循环约需30-50 min，但细胞核内金颗粒至120 min时仍不消失.
结论 EGF与EGF-R结合后可发生典型的受体内吞和循环再生过程.
主题词 表皮生长因子-尿抑胃素;结肠直肠肿瘤;显微镜检查，电子
, 百拇医药 刘国龙,张万岱,宋于刚,李金瀚,周殿元.金标记表皮生长因子在大肠癌细胞的定位循环.新消化病学杂志,1996；4(9)：485-486
EGF与EGF-R结合后产生第二信使，并促发细胞的快速生长，但其具体的作用机制尚不清楚.本实验应用透射电镜和免疫金标记技术观察金标记的EGF与大肠癌细胞上EGF-R结合后的定位循环和代谢过程.
1 材料和方法
1.1 材料 胶体金标记的EGF购于华美生物试剂公司，颗粒直径15nm.其它化学试剂均为国产分析纯.
1.2 方法 取HT-29细胞悬液500万个(50万/ml无血清RPMI-1640)，加入胶体金标记的EGFR，于反应的 第1，5，10，20，30，60，90及120min时分别取出1ml细胞悬液，加入等量5%戊二醛中止反应，并立即固定，静置30min后离心1000r/min×5min，去上清后加入1ml的血清使细胞重悬，移入特制的琼脂离心管离心3500r/min×15min，取出细胞团重悬于戊二醛固定24h以上，用PBS洗去戊二醛，加入50%的锇酸反应15min，去锇酸，用PBS浸洗过夜，用70%-100%的丙酮进行梯度脱水，加环氧丙烷和聚脂(V：V=1:1)置37℃温箱90min，聚脂浸透包埋24h以上，超薄切片(1μm)，300目网捞片，醋酸铀染色30min，蒸馏水洗净，透射电镜观察各时间点金颗粒的定位.
, 百拇医药
2 结果
加入胶体金约1-5min细胞膜上就有金颗粒出现，以微绒毛处多见，10min内金颗粒主要集中于胞膜上；10-20min主要散布于胞浆内，且有少量结合于细胞核上；30-50min胞浆中金颗粒大部分消失，而此时胞膜处又可见少量金颗粒存在，可能是部分受体经循环后重新返回胞膜；胞核内的金颗粒至120min时仍未消失(图1-4).
3 讨论
EGF与细胞膜上EGF-R结合后通过第二信使传递信号而发挥生物效应，某些细胞核上也存在特异的EGF结合位点，Steven，Yoko和Ulrich
等[1-3]报告在新生小鼠肝细胞核上有EGF的特异结合点.本文发现大肠癌细胞HT-29加入Au-EGF数分钟即可结合于胞膜，且多位于微绒毛上，约5-10min可分布于胞浆内，约30-50min时大部分从胞浆中消失，少部分返回细胞膜.因HT-29细胞是体外长期传代细胞，胞内的溶酶体已退化，所以未见正常细胞受体内吞后在溶酶体内积聚消化的现象.同时发现有少量金颗粒结合于细胞核上，这些金颗粒不参入循环和代谢，是否具有较高的亲和力或参入信息传递尚待进一步探讨.
, 百拇医药
图1 5min胶体金颗粒主要分布细胞膜 ×10000
图2 10min胶体金颗粒主要分布于细胞浆 ×5000
图3，4 20min少量金颗粒主要分布细胞核 ×12000
4 参考文献
1 Ulrich M, Richard KH. Localization of epidermal growth factor receptor in hepatocyte nuclei. Hepatology, 1991;13(10):15-21
, 百拇医药
2 Yoko I, Tadaka H, Tom JP, et al. Characterization of gastrin/CCK receptors on gastric membrance of mastomys
natalensis. Regulatorypeptide, 1993;43(1):149-157
3 Staya N, Harmara CK, Hank PS, et al. Specific binding and growth effects of bombesin relate on mouse colon cancer
cells in vitro. Cancer Res, 1990;50(1):6772-6781, 百拇医药(刘国龙 张万岱 宋于刚 李金瀚 周殿元)
刘国龙，男，1964-09-08生，江苏省溧阳市人，汉族.1987年苏州医学院医学系毕业，主治医师，讲师，主要从事肿瘤的诊治研究，发表相关论文22篇
项目负责人 刘国龙,510515 广东省广州市,第一军医大学南方医院肿瘤科
收搞日期 1995-07-25 接收日期 1996-01-02
Localication dynamics of EGF-R on HT-29 cells by electron-microscope
Guo-Long Liu, Wan-Dai Zhang, Yu-Gang Song, Jin-Han Li and Dian-Yuan Zhou
, http://www.100md.com
Department of Oncology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515 Guangdong Province, China
Abstract
AIMS Observation of the EGF-R location and cycle in HT-29 cells by using Au-EGF.
METHODS Au-EGF as a marker was used in observation of EGF-R in HT-29 cells by transparent electron-microscope continusly for
, http://www.100md.com
120 minites.
RESULTS Au-EGF binded to EGF-R in few minites to 120 minites, Au-EGF-EGF-R mainly located on cellular membrane of the HT-29 cells in frist 10 minites, at 10-20 minites Au-EGF-EGF-R were endocytosised to cytoplasm and few to the nucleus; after 30 minites most Au-EGF-EGF-R disappeared from cytoplasm exept few in the nucleus, some EGF-R returned to cell membrane.
CONCLUSIONS EGF-R are mainly on the membrane of HT-29 cells, but when it binds to EGF, EGF-R endocytosis and cycling occur.
, http://www.100md.com
Subject headings epidermal growth factor-urogastronecolorectal neoplasms microscopy, electron
Liu GL, Zhang WD, Song YG, Li JH,Zhou DY.Localication dynamics of EGF-R on HT-29 cells by electron-microscope.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(9)：485-486
摘要
目的 观察大肠癌细胞上EGF-R与EGF-Au结合后定位、内吞、循环和代谢过程.
, http://www.100md.com
方法 应用透射电镜观察胶体金标记的表皮生长因子(Au-EGF)与HT-29细胞上EGF-R的作用过程.
结果 发现加入Au-EGF数分钟就结合于细胞膜上EGF-R，10 min内金颗粒主要储存中于细胞膜，10-20 min主要散布于细胞浆，细胞核内也有少量金颗粒存在，30-50 min胞浆中金颗粒逐渐减少消失，小部分金颗粒重又返回细胞膜. 完成一个循环约需30-50 min，但细胞核内金颗粒至120 min时仍不消失.
结论 EGF与EGF-R结合后可发生典型的受体内吞和循环再生过程.
主题词 表皮生长因子-尿抑胃素;结肠直肠肿瘤;显微镜检查，电子
, 百拇医药 刘国龙,张万岱,宋于刚,李金瀚,周殿元.金标记表皮生长因子在大肠癌细胞的定位循环.新消化病学杂志,1996；4(9)：485-486
EGF与EGF-R结合后产生第二信使，并促发细胞的快速生长，但其具体的作用机制尚不清楚.本实验应用透射电镜和免疫金标记技术观察金标记的EGF与大肠癌细胞上EGF-R结合后的定位循环和代谢过程.
1 材料和方法
1.1 材料 胶体金标记的EGF购于华美生物试剂公司，颗粒直径15nm.其它化学试剂均为国产分析纯.
1.2 方法 取HT-29细胞悬液500万个(50万/ml无血清RPMI-1640)，加入胶体金标记的EGFR，于反应的 第1，5，10，20，30，60，90及120min时分别取出1ml细胞悬液，加入等量5%戊二醛中止反应，并立即固定，静置30min后离心1000r/min×5min，去上清后加入1ml的血清使细胞重悬，移入特制的琼脂离心管离心3500r/min×15min，取出细胞团重悬于戊二醛固定24h以上，用PBS洗去戊二醛，加入50%的锇酸反应15min，去锇酸，用PBS浸洗过夜，用70%-100%的丙酮进行梯度脱水，加环氧丙烷和聚脂(V：V=1:1)置37℃温箱90min，聚脂浸透包埋24h以上，超薄切片(1μm)，300目网捞片，醋酸铀染色30min，蒸馏水洗净，透射电镜观察各时间点金颗粒的定位.
, 百拇医药
2 结果
加入胶体金约1-5min细胞膜上就有金颗粒出现，以微绒毛处多见，10min内金颗粒主要集中于胞膜上；10-20min主要散布于胞浆内，且有少量结合于细胞核上；30-50min胞浆中金颗粒大部分消失，而此时胞膜处又可见少量金颗粒存在，可能是部分受体经循环后重新返回胞膜；胞核内的金颗粒至120min时仍未消失(图1-4).
3 讨论
EGF与细胞膜上EGF-R结合后通过第二信使传递信号而发挥生物效应，某些细胞核上也存在特异的EGF结合位点，Steven，Yoko和Ulrich
等[1-3]报告在新生小鼠肝细胞核上有EGF的特异结合点.本文发现大肠癌细胞HT-29加入Au-EGF数分钟即可结合于胞膜，且多位于微绒毛上，约5-10min可分布于胞浆内，约30-50min时大部分从胞浆中消失，少部分返回细胞膜.因HT-29细胞是体外长期传代细胞，胞内的溶酶体已退化，所以未见正常细胞受体内吞后在溶酶体内积聚消化的现象.同时发现有少量金颗粒结合于细胞核上，这些金颗粒不参入循环和代谢，是否具有较高的亲和力或参入信息传递尚待进一步探讨.
, 百拇医药
图1 5min胶体金颗粒主要分布细胞膜 ×10000
图2 10min胶体金颗粒主要分布于细胞浆 ×5000
图3，4 20min少量金颗粒主要分布细胞核 ×12000
4 参考文献
1 Ulrich M, Richard KH. Localization of epidermal growth factor receptor in hepatocyte nuclei. Hepatology, 1991;13(10):15-21
, 百拇医药
2 Yoko I, Tadaka H, Tom JP, et al. Characterization of gastrin/CCK receptors on gastric membrance of mastomys
natalensis. Regulatorypeptide, 1993;43(1):149-157
3 Staya N, Harmara CK, Hank PS, et al. Specific binding and growth effects of bombesin relate on mouse colon cancer
cells in vitro. Cancer Res, 1990;50(1):6772-6781, 百拇医药(刘国龙 张万岱 宋于刚 李金瀚 周殿元)