特异性杂交瘤细胞ELISA检测血清胃癌抗原
南京军区81医院中心实验科 江苏省南京市 210002
项目负责人 张苏玲,210002,江苏省南京市,南京军区81医院中心实验科 收搞日期 1995-09-28 接收日期 1995-10-12
Specific hybridoma cell ELISA in detaction of serum gastric cancer antigen
Su-Ling Zhang, Hui-Ying Chen, Wen-Hu Liu and Ting-Yu Xia
Department of Gastroenterology, Chinese PLA 81 Hospital, Nanjng 210002 , Jiangsu Province, China
, http://www.100md.com
Abstract
AIMS Using specific hybridoma cell as natural antibody carrier, we established a SHC-ELISA in detection of serum gastric cancer.
METHODS A series of the malignant tumor sera of digestive tract gastric cancer, 69; other digestive tract cancer, 63; benign gastric diseases, 35; and healthy subjects, 84 were detected by SHC-ELISA.
, 百拇医药
RESULTS The range of normal value was 0.076%-0.076%(x-±2s), specific inhibition rate was 73%, recovery rate 68.4%,with in run and between run CVS were 5.2% to 8.9% and 11.7% to 17.6%.
CONCLUSIONS SHC-ELISA is simpl, specific, sensitive, and may be used chinically.
Subject headings hybridoma antigens, neoplasms stomach neoplasms enzyme-linked immuno sorbeat assay
, 百拇医药
Zhang SL, Chen HY, Liu WH,Xia TY.Specific hybridoma cell ELISA in detaction of serum gastric cancer antigen.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(12)：675-676
摘要
目的 将携带特异性抗体的杂交瘤细胞作为天然抗体-载体，进行血清学相关抗原检测的方法学研究。
方法 运用特异性杂交瘤细胞ELISA双抗体夹心法，测定一组消化道癌标本包括胃癌69例，其他消化道癌63例，胃良性病35例，以及健康体检者84例。
, 百拇医药 结果 正常值判定为0.076±0.076(±2s),特异性阻断试验为73%，回收率为68.4%，批内CV值为5.2%-8.9%，批间CV值为11.7%-17.6%。
结论 特异性杂交瘤细胞ELISA方法测定血清中肿瘤相关抗原，方法简单，具有较强的特异性及敏感性，可应用于临床。
主题词 杂交瘤;胃肿瘤;抗原，肿瘤;酶联免疫吸附测定
张苏玲,陈惠英,刘文虎,夏廷玉.特异性杂交瘤细胞ELISA检测血清胃癌抗原.新消化病学杂志,1996；4(12)：675-676
近年来，特异性杂交瘤细胞在肿瘤血清学方面的应用价值研究少见.我们依据杂交瘤细胞能在体外大量繁殖及分泌特异性抗体等特性，将表面已携带了抗体的杂交瘤细胞作为天然抗体-载体复合物，建立了特异性杂交瘤细胞酶联免疫吸附分析(specific hybridoma cell enzyme-linked immunosorbent assay, SHC-ELISA)检测方法，并进行了方法学探讨.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 经常规细胞融合术，制备了鼠抗人胃管状腺癌单克隆抗体MG-3c7，经免疫细胞及免疫组织化学鉴定证实，该单抗对人胃管状腺癌具有一定的特异性及敏感性.抗体经纯化后，标记辣根过氧化物酶，ELISA方法测定效价为1∶2000.用分泌旺盛生长良好的杂交瘤细胞，调整细胞数为5×107/ml 于40孔酶标板中，100μl/孔，37℃，5% CO2培养24h，弃上清，用0.025%戊二醛固定，4℃ 1h，弃上清制成杂交瘤细胞酶标板，置4℃，保存备用.取经方阵滴定后的小鼠腹水McAb MG-3c7 1∶5000，用0.01mol/L pH 7.4 PBS稀释后包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，制成McAb MG-3c7酶标板以备与SHC-ELISA测定对照.取本室建立并传代培养的胃管状腺癌细胞株NGCC 8310细胞，消化洗涤后收集，用SDS裂解细胞后低温高速离心，得粗提MAg，Lowry法测蛋白含量，低温保存.
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1.2 方法 采集健康体检者84例，胃癌69例，其它消化道癌63例，胃良性病35例，分离血清后低温保存SHC-ELISA测定.取出杂交瘤细胞板， 用0.01mol/L pH 7.4 PBST洗涤3次，加正常鼠血清(1∶100)封闭，100μl/孔，37℃，1h，PBST洗涤3次，加鼠抗人McAb MG-3c7-HRP(1∶2000)，50μl/孔，37℃ 1h PBST洗3次，OPD底物液显色100μl/孔，显色后，2N H2SO4 50μl/孔，终止反应，于酶联比色仪490nm处读取A值.阳性对照孔加GTAC-MAg，阴性对照孔加PBS.
常规双抗体夹心法ELISA测定.取McAb MG-3c7 抗体(1∶5000)100μl/孔包被的酶标板，同上述SHC-ELISA法测定.
统计学分析：所得数据经t检验和相关回归分析进行统计学处理.
, 百拇医药
2 结果
2.1 正常值 以GTAC-MAg 0.57mg/ml作1∶6倍比稀释，测得吸光度在0.06-0.38 (0.073-95μg/ml)处成线性，依A值作标准曲线，按95%可信限测得正常值为0.076±0.076(x-±2s)，A>0.15为阳性判断值.
2.2 阻断试验[2] 取实际测定中胃癌、食管癌、肺癌标本各500μl，加等量经PBS洗涤后的杂交瘤培养细胞(比包被量大10倍).同时另取500μl标本加等量PBS作对照，摇匀后置4℃过夜，次日，37℃，1h，3000rpm，离心10min，取上清测定特异性阻断率分别为73%，46%，14%.
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2.3 回收实验 取实验测定中的强阳性标本(0.35)和弱阳性标本(0.18)各1份，二者等量混合为混合标本，前者与PBS等量混合为阳性对照，后者与PBS等量混合为本底对照，经4次重复，测得A值为0.19，0.18，0.05，求得回收率为68.4%.
2.4 重复性实验 5份标本作36孔测定，批内CV值为5.2%-8.9%，5份标本，6次板间测定，批间CV值为1.7%-17.6%.
2.5 稳定性实验 呈色反应37℃，20min达高峰，终止反应后，24h内标本减去本底吸光度值无变化.另取4℃下1年后的杂交瘤细胞板进行正常对照组血清测定，结果间无显著性差异(P>0.05).
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表1 癌症患者血清MG-3c7相关抗原值 (x-±s)
bP<0.01.
, 百拇医药
2.6 两种方法比较 不同稀释度的MAg 加至SHC-ELISA板和MG-3c7 ELISA板进行测定，两实验方法的相关回归分析结果显示：r=0.976，回归方程为Y=0.92X+0.04.
2.7 测定值 表1.
3 讨论
寻求特异高表达率的抗体，灵敏而准确的检测手段，仍是胃癌血清学诊断的难题.迄今，依据载体种类不同包被抗体或抗原进行血清学ELISA研究已有诸多报道[1，3].但由于胃癌是一种混合体癌，在正常人群中胃癌相关抗原表达阈值的升高，无疑造成肿瘤阳性检出率的降低.我们运用自制的一株胃管状腺癌单克隆抗体MG-3c7的杂交瘤细胞，作为天然抗体载体包被在酶联板上，用以检测各类肿瘤患者血清中相关抗原-抗体免疫复合物的表达.经方法学考证和病例检测证实，该方法具有较强的特异性和良好的重复性.SHC-ELISA测定中，胃癌阳性表达率为66.7%，虽不如在组织学中抗体的阳性检出率高，但用于胃癌患者血清学研究及临床诊断的辅助指标，仍不失为一种安全、快速、简便、特异的检测手段.该杂交瘤细胞板经固定液固定后，于低温可长期存放，血清用量少，适用于肿瘤普查、回顾性研究及患者预后指标的观察.
4 参考文献
1 张学庸，张积仁，陈希陶，等.MG-Ags检测在消化系肿瘤血清诊断中的应用.中华消化杂志，1990；10(2)：120
2 杨元兵，韩玲霞，徐乌格，等.单克隆抗体检测胸腔积液和脑脊液中白细胞介素1β的含量.临床检验杂志，1994；12(3)：123-124
3 徐壅，沈静，唐淑珍，等.酶联免疫吸附法检测血清抗内皮细胞抗体.中华医学检验杂志，1994；17(6)：354-356, 百拇医药(张苏玲 陈惠英 刘文虎 夏廷玉)
项目负责人 张苏玲,210002,江苏省南京市,南京军区81医院中心实验科 收搞日期 1995-09-28 接收日期 1995-10-12
Specific hybridoma cell ELISA in detaction of serum gastric cancer antigen
Su-Ling Zhang, Hui-Ying Chen, Wen-Hu Liu and Ting-Yu Xia
Department of Gastroenterology, Chinese PLA 81 Hospital, Nanjng 210002 , Jiangsu Province, China
, http://www.100md.com
Abstract
AIMS Using specific hybridoma cell as natural antibody carrier, we established a SHC-ELISA in detection of serum gastric cancer.
METHODS A series of the malignant tumor sera of digestive tract gastric cancer, 69; other digestive tract cancer, 63; benign gastric diseases, 35; and healthy subjects, 84 were detected by SHC-ELISA.
, 百拇医药
RESULTS The range of normal value was 0.076%-0.076%(x-±2s), specific inhibition rate was 73%, recovery rate 68.4%,with in run and between run CVS were 5.2% to 8.9% and 11.7% to 17.6%.
CONCLUSIONS SHC-ELISA is simpl, specific, sensitive, and may be used chinically.
Subject headings hybridoma antigens, neoplasms stomach neoplasms enzyme-linked immuno sorbeat assay
, 百拇医药
Zhang SL, Chen HY, Liu WH,Xia TY.Specific hybridoma cell ELISA in detaction of serum gastric cancer antigen.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(12)：675-676
摘要
目的 将携带特异性抗体的杂交瘤细胞作为天然抗体-载体，进行血清学相关抗原检测的方法学研究。
方法 运用特异性杂交瘤细胞ELISA双抗体夹心法，测定一组消化道癌标本包括胃癌69例，其他消化道癌63例，胃良性病35例，以及健康体检者84例。
, 百拇医药 结果 正常值判定为0.076±0.076(±2s),特异性阻断试验为73%，回收率为68.4%，批内CV值为5.2%-8.9%，批间CV值为11.7%-17.6%。
结论 特异性杂交瘤细胞ELISA方法测定血清中肿瘤相关抗原，方法简单，具有较强的特异性及敏感性，可应用于临床。
主题词 杂交瘤;胃肿瘤;抗原，肿瘤;酶联免疫吸附测定
张苏玲,陈惠英,刘文虎,夏廷玉.特异性杂交瘤细胞ELISA检测血清胃癌抗原.新消化病学杂志,1996；4(12)：675-676
近年来，特异性杂交瘤细胞在肿瘤血清学方面的应用价值研究少见.我们依据杂交瘤细胞能在体外大量繁殖及分泌特异性抗体等特性，将表面已携带了抗体的杂交瘤细胞作为天然抗体-载体复合物，建立了特异性杂交瘤细胞酶联免疫吸附分析(specific hybridoma cell enzyme-linked immunosorbent assay, SHC-ELISA)检测方法，并进行了方法学探讨.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 经常规细胞融合术，制备了鼠抗人胃管状腺癌单克隆抗体MG-3c7，经免疫细胞及免疫组织化学鉴定证实，该单抗对人胃管状腺癌具有一定的特异性及敏感性.抗体经纯化后，标记辣根过氧化物酶，ELISA方法测定效价为1∶2000.用分泌旺盛生长良好的杂交瘤细胞，调整细胞数为5×107/ml 于40孔酶标板中，100μl/孔，37℃，5% CO2培养24h，弃上清，用0.025%戊二醛固定，4℃ 1h，弃上清制成杂交瘤细胞酶标板，置4℃，保存备用.取经方阵滴定后的小鼠腹水McAb MG-3c7 1∶5000，用0.01mol/L pH 7.4 PBS稀释后包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，制成McAb MG-3c7酶标板以备与SHC-ELISA测定对照.取本室建立并传代培养的胃管状腺癌细胞株NGCC 8310细胞，消化洗涤后收集，用SDS裂解细胞后低温高速离心，得粗提MAg，Lowry法测蛋白含量，低温保存.
, http://www.100md.com
1.2 方法 采集健康体检者84例，胃癌69例，其它消化道癌63例，胃良性病35例，分离血清后低温保存SHC-ELISA测定.取出杂交瘤细胞板， 用0.01mol/L pH 7.4 PBST洗涤3次，加正常鼠血清(1∶100)封闭，100μl/孔，37℃，1h，PBST洗涤3次，加鼠抗人McAb MG-3c7-HRP(1∶2000)，50μl/孔，37℃ 1h PBST洗3次，OPD底物液显色100μl/孔，显色后，2N H2SO4 50μl/孔，终止反应，于酶联比色仪490nm处读取A值.阳性对照孔加GTAC-MAg，阴性对照孔加PBS.
常规双抗体夹心法ELISA测定.取McAb MG-3c7 抗体(1∶5000)100μl/孔包被的酶标板，同上述SHC-ELISA法测定.
统计学分析：所得数据经t检验和相关回归分析进行统计学处理.
, 百拇医药
2 结果
2.1 正常值 以GTAC-MAg 0.57mg/ml作1∶6倍比稀释，测得吸光度在0.06-0.38 (0.073-95μg/ml)处成线性，依A值作标准曲线，按95%可信限测得正常值为0.076±0.076(x-±2s)，A>0.15为阳性判断值.
2.2 阻断试验[2] 取实际测定中胃癌、食管癌、肺癌标本各500μl，加等量经PBS洗涤后的杂交瘤培养细胞(比包被量大10倍).同时另取500μl标本加等量PBS作对照，摇匀后置4℃过夜，次日，37℃，1h，3000rpm，离心10min，取上清测定特异性阻断率分别为73%，46%，14%.
, http://www.100md.com
2.3 回收实验 取实验测定中的强阳性标本(0.35)和弱阳性标本(0.18)各1份，二者等量混合为混合标本，前者与PBS等量混合为阳性对照，后者与PBS等量混合为本底对照，经4次重复，测得A值为0.19，0.18，0.05，求得回收率为68.4%.
2.4 重复性实验 5份标本作36孔测定，批内CV值为5.2%-8.9%，5份标本，6次板间测定，批间CV值为1.7%-17.6%.
2.5 稳定性实验 呈色反应37℃，20min达高峰，终止反应后，24h内标本减去本底吸光度值无变化.另取4℃下1年后的杂交瘤细胞板进行正常对照组血清测定，结果间无显著性差异(P>0.05).
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表1 癌症患者血清MG-3c7相关抗原值 (x-±s)
| 组别 | n | MG-3c7-Ag | 阳性率(%) |
| 胃 癌 | 69 | 0.19±0.06 | 66.7(46/69)b |
| 其 它 癌 | 63 | 0.14±0.05 | 41.3(26/63)b |
| 胃良性病 | 35 | 0.08±0.03 | 5.7(2/35) |
| 正 常 人 | 84 | 0.08±0.04 | 2.4(2/84) |
bP<0.01.
, 百拇医药
2.6 两种方法比较 不同稀释度的MAg 加至SHC-ELISA板和MG-3c7 ELISA板进行测定，两实验方法的相关回归分析结果显示：r=0.976，回归方程为Y=0.92X+0.04.
2.7 测定值 表1.
3 讨论
寻求特异高表达率的抗体，灵敏而准确的检测手段，仍是胃癌血清学诊断的难题.迄今，依据载体种类不同包被抗体或抗原进行血清学ELISA研究已有诸多报道[1，3].但由于胃癌是一种混合体癌，在正常人群中胃癌相关抗原表达阈值的升高，无疑造成肿瘤阳性检出率的降低.我们运用自制的一株胃管状腺癌单克隆抗体MG-3c7的杂交瘤细胞，作为天然抗体载体包被在酶联板上，用以检测各类肿瘤患者血清中相关抗原-抗体免疫复合物的表达.经方法学考证和病例检测证实，该方法具有较强的特异性和良好的重复性.SHC-ELISA测定中，胃癌阳性表达率为66.7%，虽不如在组织学中抗体的阳性检出率高，但用于胃癌患者血清学研究及临床诊断的辅助指标，仍不失为一种安全、快速、简便、特异的检测手段.该杂交瘤细胞板经固定液固定后，于低温可长期存放，血清用量少，适用于肿瘤普查、回顾性研究及患者预后指标的观察.
4 参考文献
1 张学庸，张积仁，陈希陶，等.MG-Ags检测在消化系肿瘤血清诊断中的应用.中华消化杂志，1990；10(2)：120
2 杨元兵，韩玲霞，徐乌格，等.单克隆抗体检测胸腔积液和脑脊液中白细胞介素1β的含量.临床检验杂志，1994；12(3)：123-124
3 徐壅，沈静，唐淑珍，等.酶联免疫吸附法检测血清抗内皮细胞抗体.中华医学检验杂志，1994；17(6)：354-356, 百拇医药(张苏玲 陈惠英 刘文虎 夏廷玉)