PCR法检测胃粘膜中的幽门螺杆菌
北京医科大学第一医院消化内科 北京市 100034
王蔚虹，女，1964-10-23生，1988年北京医科大学医学系毕业，博士学位，主治医师.
项目负责人:王蔚虹
收稿日期:1996-01-06
Detection of Helicobacter pylori from gastric mucosa by using polymerase chain reaction
Wei-Hong Wang, Fu-Lian Hu, Bo-Qi Jia and Hua-Hong Wang
Department of Gastroenterology, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To establish the polymerase chain reaction(PCR) method for the detection of H.pylori-from gastric mucosa specimens and to study its value in diagnosing H.pylori infection and confirming H.pylori eradication.
METHODS A synthetic oligonucleotide primer pair derived from the 16S rRNA gene was used to develop PCR for the detection of H.pylori from gastric mucosa specimens and the results were compared to that of routine methods.
, 百拇医药
RESULTS A 500bp fragment was amplified in 2 H.pylori reference strains and 50 clinically isolated strains, whereas 13 other bacterial species and normal human gastric mucosa were found not to yield amplified products. PCR can detect as little as 0.1pg of DNA, corresponding to about 100 bacteria cells. By comparing PCR with urease test, culture and Warthin_Starry stain in 96 patients with upper gastrointestinal symptoms and 21 patients with H.pylori associated duodenal ulcer after treatment, it is demonstrated that PCR was more sensitive than routine methods for detecting small numbers of bacteria which could not be detected by the routine diagnostic tests.
, http://www.100md.com
CONCLUSION PCR is a rapid, sensitive and specific method for the detection of H.pylori. It can be used to diagnose H.pylori infect ion and to confirm eradication of H.pylori after treatment.
Subject headings Gastric mucosa/microbiology;Helicobacter pylori/genetics;DNA, bacterial/analysis;Polymerase chain reaction
Wang WH, Hu FL, Jia BQ,Wang HH.Detection of Helicobacter pylori from gastricmucosa by using polymerase chain reaction.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1997；5(1)：11-12
, http://www.100md.com
摘要目的 建立检测幽门螺杆菌(Hp)的更为敏感的聚合酶链反应(PCR)，并探讨它在Hp感染的诊断及根除效果判定中的应用.
方法 以一对合成的与Hp 16S rRNA基因互补的寡核苷酸为引物(CP1/CP2)，建立了从胃粘膜中检测Hp的PCR反应，并与常规检测方法进行比较.
结果 PCR方法检测Hp标准菌株及50株临床分离菌株均产生500bp片段，检出的最小DNA量为0.1pg，相当于100个细菌细胞；所有13株其它细菌及无Hp感染的人胃粘膜则无扩增产物出现.用该方法检测96名初诊患者Hp感染情况及21名药物治疗后患者Hp根除情况，并与胃粘膜活组织尿素酶试验、细菌培养及银染色方法比较，证实PCR方法可以检出常规方法不能检出的少量Hp.
, http://www.100md.com
结论 PCR是检测Hp的最为敏感的方法，有助于Hp感染的诊断和Hp根除的精确判断.
主题词 胃粘膜/微生物学;螺杆菌，幽门/遗传学;DNA，细菌/分析;聚合酶链反应
王蔚虹,胡伏莲,贾博琦,王化虹.PCR法检测胃粘膜中的幽门螺杆菌.新消化病学杂志,1997；5(1)：11-12
诊断幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染的方法很多，但都缺乏敏感性，以确定治疗后细菌是否被彻底根除，因此，需要一种快速、可靠，具有高度敏感性的检测方法.聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)用于检测Hp感染国外已有报道[1-3]，国内也有人用此方法检测唾液中的Hp[4].作者报道用PCR技术从胃粘膜活组织中检测Hp，并探讨了该方法在Hp感染的诊断和在评价治疗后根除效果中的意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 PCR方法的建立 Hp标准菌株NCTC11637，NCTC11848及空肠弯曲菌NCTC11351来自伦敦国家标准培养物收藏中心(National Collection of Type Culture).50株Hp临床菌株来自因上胃肠症状在本院行内镜检查的胃窦活组织标本培养3-7d.根据菌落形态、革兰染色，以及尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶试验阳性进行细菌鉴定.金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、克雷白肺炎杆菌、伤寒杆菌、阴沟杆菌、弗氏痢疾杆菌及胎儿弯曲菌由本院临床药理研究所提供.以氯化苄方法[5]提取细菌DNA，用分光光度计测定Hp NCTC11637 DNA的OD260及OD280，计算DNA浓度.CP1/CP2引物来自Hp 16s rRNA基因，参考Hoshina等[1]提供的序列，由中国科学院遗传所合成并纯化. CP1：5′-GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG-3′， CP2：5′-GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC-3′，扩增片段长度500bp. 采用50μl扩增体系：扩增从υ赑erkin-Elmer公司的DNA Thermal Cycler 480上进行：96. 5min，1个循环；94 1?min变性，55 1min退火，72 1.5min延伸，35个循环；最后于72继续延伸10min.反应中以Hp NCTC 11637做阳性对照，以去离子水代替模板DNA做阴性对照.扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.
, 百拇医药
1.2 PCR检测胃粘膜中的Hp 因上胃肠症状行内镜检查的患者96名及因Hp感染经抗生素根除治疗后复查内镜的患者25名，于胃窦部取粘膜活组织，分别做尿素酶试验(兰州军区学校生产试剂盒)，细菌培养及Warthin_Starry银染色检查(由本院专职病理医师完成).另取胃窦粘膜活组织标本1块，置500μl TE(10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA) (pH 8.0)缓冲液中研碎，加10% SDS 30μl，蛋白酶K (20mg/ml)3μl，50消化1h，以等体积苯酚_氯仿提取模板DNA用于PCR检测.以缓冲液作阴性对照. 统计学分析 采用配对四格表资料的χ2检验.
2 结果
2.1 PCR方法的敏感性和特异性 采用10倍系列稀释的HpNCTC 11637 DNA检测PCR反应的敏感性.1μg-0.1pg的DNA扩 增后在1%琼脂糖凝胶上均产生可见的条滞，检出的最低Hp DNA量为0.1pg，相当于100个 细菌细胞[2].引物CP1/CP2对Hp标准菌株NCTC 11637，NCTC 11848及50株临床 分离的Hp菌株扩增后均可产生500bp预期片段，而对13株非Hp菌株，包括金黄色葡萄球菌 、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、克雷白肺炎杆菌、伤寒杆菌、阴沟杆菌、弗氏痢疾杆菌、胎儿弯曲杆菌及空肠弯曲菌NCTC 11351均呈阴性反应；对无Hp感染的人胃粘膜也呈阴性反应.
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2.2 PCR与常规方法的比较 用PCR方法检测了96名因上胃肠症状首次行内镜和胃粘膜活组织检查的患者，并与尿素酶试 验、细菌培养和Warthin_Starry银染色等常规检测方法进行了比较(表1).在4项检查方法中，PCR检出的阳性患者最多，与尿素酶试验和细菌培养结果比较有显著性差异(P<0.05).PCR方法还检出2例上述3项常规检测方法均为阴性的Hp感染者.所有细菌培养或银染色阳性的患者，用PCR检测均呈阳性.用PCR方法检测了25名十二指肠溃疡伴Hp感染经不同抗生素方案治疗的患者，并与尿素酶试验、细菌培养及银染色方法比较(表2).发现其中20名患者常规3项检测方法均为阴性，认为Hp已被根欢肞CR方法检测却发现在这20名所谓Hp已被根除的患者中有4例Hp仍为阳性.对这4名患者中的3名于停药后5-6个月复查，发现2名患者尿素酶试验、细菌培养及银染色均转为阳性.证明PCR能检出治疗后用常规方法不能检出的少量Hp.
表1 胃粘膜活组织4种方法检测Hp的结果
, 百拇医药
aP<005，vs PCR方法.
表2 十二指肠溃疡伴Hp感染者治疗后检测结果
3 讨论
当前，临床上应用最广泛的检测Hp的方法仍是通过内镜取胃粘膜活组织做尿素酶试验、细菌培养及组织学染色(Warthin_Starry银染色)后做显微镜检查.尿素酶试验快速、简便，但常有假阳性和假阴性.细菌培养则要尽可能缩短接种前标本的转运时间，细菌生长缓慢且需要特殊的培养条件，球形Hp则不易培养成活.银染色后做显微镜检查虽然敏感性和特异性均高，但操作较烦琐，要求技术上熟练程度高，且费时，价格较贵.非侵入性的方法如14C或13C呼气试验虽具有快速、可靠、无痛苦的优点，但费用较高，且接触同位素.血清抗体的检测则主要用于流行病学研究.PCR方法不仅快速、简便，而且证实引物CP1/CP2对Hp的扩增是特异的，而对其它细菌和无Hp感染的人胃粘膜则无扩增产物出现.该方法只需要从胃粘膜活检标本中粗提模板DNA，其检出的最小Hp DNA量为0.1pg，相当于100个细菌细胞，与文献报道结果相似[2]. 本研究中将PCR技术用于Hp感染的诊断，并与传统的尿素酶试验、细菌培养及银染色方法进行了比较.表1可以看出，7例尿素酶试验阴性，9例细菌培养阴性及2例银染色阴性者，用PCR检测则全部为阳性.PCR技术确实较常规检测方法更为敏感，可以检出常规方法不能检出的Hp.Hp感染治疗后易短期内复发的原因是：药物治疗后Hp数量减少，生长受到抑制，但细菌并未彻底根除.由于常规检测方法不够敏感，使得部分Hp未彻底根除的患者不能被检出，而误认为Hp已经根除不再继续治疗.本研究中将PCR技术用于抗生素治疗后检测Hp是否被根除，发现20例3项常规检测方法均为阴性认为Hp已被根除的患者，用PCR方法检测证实其中4例Hp仍为阳性.说明药物治疗并未使这4名患者感染的Hp彻底根除，只是细菌数量减少，用常规检查方法难以检出.
, 百拇医药
4 参考文献1 Hoshina S, Kahn SM, Jiang W, et al . Direct detection and amplification of Helicobacter pylori ribosomal
16S gene segments from gastric endoscopic biopsies. Diagn Microbiol Infect Dis, 1990;13(6):473-479
2 Ho SA, Hoyle JA, Lewis FA, et al. Direct polymerase chain reaction test for detection of Helicobacter
pylori in humans and animals. J Clin Mirrobiol, 1991;29(11):2543-2549
, 百拇医药
3 Clayton CL, Kleanthous H, Coates PJ, et al. Sensitive detection of Helicobacter pylori by using
polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1992;30(1):1922-200
4 宋敏.用巢式聚合酶链反应在唾液中检测出幽门螺杆菌.中华流行病杂志，1993；14(4)：237-240
5 Zhu H, Qu F, Zhu LH. Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride.
Nucleic Acids Res, 1993;21(22):5279-5280, http://www.100md.com
王蔚虹，女，1964-10-23生，1988年北京医科大学医学系毕业，博士学位，主治医师.
项目负责人:王蔚虹
收稿日期:1996-01-06
Detection of Helicobacter pylori from gastric mucosa by using polymerase chain reaction
Wei-Hong Wang, Fu-Lian Hu, Bo-Qi Jia and Hua-Hong Wang
Department of Gastroenterology, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To establish the polymerase chain reaction(PCR) method for the detection of H.pylori-from gastric mucosa specimens and to study its value in diagnosing H.pylori infection and confirming H.pylori eradication.
METHODS A synthetic oligonucleotide primer pair derived from the 16S rRNA gene was used to develop PCR for the detection of H.pylori from gastric mucosa specimens and the results were compared to that of routine methods.
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RESULTS A 500bp fragment was amplified in 2 H.pylori reference strains and 50 clinically isolated strains, whereas 13 other bacterial species and normal human gastric mucosa were found not to yield amplified products. PCR can detect as little as 0.1pg of DNA, corresponding to about 100 bacteria cells. By comparing PCR with urease test, culture and Warthin_Starry stain in 96 patients with upper gastrointestinal symptoms and 21 patients with H.pylori associated duodenal ulcer after treatment, it is demonstrated that PCR was more sensitive than routine methods for detecting small numbers of bacteria which could not be detected by the routine diagnostic tests.
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CONCLUSION PCR is a rapid, sensitive and specific method for the detection of H.pylori. It can be used to diagnose H.pylori infect ion and to confirm eradication of H.pylori after treatment.
Subject headings Gastric mucosa/microbiology;Helicobacter pylori/genetics;DNA, bacterial/analysis;Polymerase chain reaction
Wang WH, Hu FL, Jia BQ,Wang HH.Detection of Helicobacter pylori from gastricmucosa by using polymerase chain reaction.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1997；5(1)：11-12
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摘要目的 建立检测幽门螺杆菌(Hp)的更为敏感的聚合酶链反应(PCR)，并探讨它在Hp感染的诊断及根除效果判定中的应用.
方法 以一对合成的与Hp 16S rRNA基因互补的寡核苷酸为引物(CP1/CP2)，建立了从胃粘膜中检测Hp的PCR反应，并与常规检测方法进行比较.
结果 PCR方法检测Hp标准菌株及50株临床分离菌株均产生500bp片段，检出的最小DNA量为0.1pg，相当于100个细菌细胞；所有13株其它细菌及无Hp感染的人胃粘膜则无扩增产物出现.用该方法检测96名初诊患者Hp感染情况及21名药物治疗后患者Hp根除情况，并与胃粘膜活组织尿素酶试验、细菌培养及银染色方法比较，证实PCR方法可以检出常规方法不能检出的少量Hp.
, http://www.100md.com
结论 PCR是检测Hp的最为敏感的方法，有助于Hp感染的诊断和Hp根除的精确判断.
主题词 胃粘膜/微生物学;螺杆菌，幽门/遗传学;DNA，细菌/分析;聚合酶链反应
王蔚虹,胡伏莲,贾博琦,王化虹.PCR法检测胃粘膜中的幽门螺杆菌.新消化病学杂志,1997；5(1)：11-12
诊断幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染的方法很多，但都缺乏敏感性，以确定治疗后细菌是否被彻底根除，因此，需要一种快速、可靠，具有高度敏感性的检测方法.聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)用于检测Hp感染国外已有报道[1-3]，国内也有人用此方法检测唾液中的Hp[4].作者报道用PCR技术从胃粘膜活组织中检测Hp，并探讨了该方法在Hp感染的诊断和在评价治疗后根除效果中的意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 PCR方法的建立 Hp标准菌株NCTC11637，NCTC11848及空肠弯曲菌NCTC11351来自伦敦国家标准培养物收藏中心(National Collection of Type Culture).50株Hp临床菌株来自因上胃肠症状在本院行内镜检查的胃窦活组织标本培养3-7d.根据菌落形态、革兰染色，以及尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶试验阳性进行细菌鉴定.金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、克雷白肺炎杆菌、伤寒杆菌、阴沟杆菌、弗氏痢疾杆菌及胎儿弯曲菌由本院临床药理研究所提供.以氯化苄方法[5]提取细菌DNA，用分光光度计测定Hp NCTC11637 DNA的OD260及OD280，计算DNA浓度.CP1/CP2引物来自Hp 16s rRNA基因，参考Hoshina等[1]提供的序列，由中国科学院遗传所合成并纯化. CP1：5′-GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG-3′， CP2：5′-GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC-3′，扩增片段长度500bp. 采用50μl扩增体系：扩增从υ赑erkin-Elmer公司的DNA Thermal Cycler 480上进行：96. 5min，1个循环；94 1?min变性，55 1min退火，72 1.5min延伸，35个循环；最后于72继续延伸10min.反应中以Hp NCTC 11637做阳性对照，以去离子水代替模板DNA做阴性对照.扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.
, 百拇医药
1.2 PCR检测胃粘膜中的Hp 因上胃肠症状行内镜检查的患者96名及因Hp感染经抗生素根除治疗后复查内镜的患者25名，于胃窦部取粘膜活组织，分别做尿素酶试验(兰州军区学校生产试剂盒)，细菌培养及Warthin_Starry银染色检查(由本院专职病理医师完成).另取胃窦粘膜活组织标本1块，置500μl TE(10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA) (pH 8.0)缓冲液中研碎，加10% SDS 30μl，蛋白酶K (20mg/ml)3μl，50消化1h，以等体积苯酚_氯仿提取模板DNA用于PCR检测.以缓冲液作阴性对照. 统计学分析 采用配对四格表资料的χ2检验.
2 结果
2.1 PCR方法的敏感性和特异性 采用10倍系列稀释的HpNCTC 11637 DNA检测PCR反应的敏感性.1μg-0.1pg的DNA扩 增后在1%琼脂糖凝胶上均产生可见的条滞，检出的最低Hp DNA量为0.1pg，相当于100个 细菌细胞[2].引物CP1/CP2对Hp标准菌株NCTC 11637，NCTC 11848及50株临床 分离的Hp菌株扩增后均可产生500bp预期片段，而对13株非Hp菌株，包括金黄色葡萄球菌 、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、克雷白肺炎杆菌、伤寒杆菌、阴沟杆菌、弗氏痢疾杆菌、胎儿弯曲杆菌及空肠弯曲菌NCTC 11351均呈阴性反应；对无Hp感染的人胃粘膜也呈阴性反应.
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2.2 PCR与常规方法的比较 用PCR方法检测了96名因上胃肠症状首次行内镜和胃粘膜活组织检查的患者，并与尿素酶试 验、细菌培养和Warthin_Starry银染色等常规检测方法进行了比较(表1).在4项检查方法中，PCR检出的阳性患者最多，与尿素酶试验和细菌培养结果比较有显著性差异(P<0.05).PCR方法还检出2例上述3项常规检测方法均为阴性的Hp感染者.所有细菌培养或银染色阳性的患者，用PCR检测均呈阳性.用PCR方法检测了25名十二指肠溃疡伴Hp感染经不同抗生素方案治疗的患者，并与尿素酶试验、细菌培养及银染色方法比较(表2).发现其中20名患者常规3项检测方法均为阴性，认为Hp已被根欢肞CR方法检测却发现在这20名所谓Hp已被根除的患者中有4例Hp仍为阳性.对这4名患者中的3名于停药后5-6个月复查，发现2名患者尿素酶试验、细菌培养及银染色均转为阳性.证明PCR能检出治疗后用常规方法不能检出的少量Hp.
表1 胃粘膜活组织4种方法检测Hp的结果
| PCR | n | 尿素酶 | 细菌培养 | 银染色 | |||
| 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | ||
| 阳性 | 65 | 58 | 7 | 56 | 0 | 63 | 2 |
| 阴性 | 31 | 1 | 30 | 0 | 31 | 0 | 31 |
| 总计 | 96 | 59 | 37 | 56 | 31 | 63 | 53 |
| 61.5% | 58.3% | 65.6% |
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aP<005，vs PCR方法.
表2 十二指肠溃疡伴Hp感染者治疗后检测结果
| n | 尿素酶试验 | 细菌培养 | 银染色 | PCR |
| 16 | - | - | - | - |
| 4 | + | + | + | + |
| 1 | - | -- | + | |
| 4 | - | - | - | + |
3 讨论
当前，临床上应用最广泛的检测Hp的方法仍是通过内镜取胃粘膜活组织做尿素酶试验、细菌培养及组织学染色(Warthin_Starry银染色)后做显微镜检查.尿素酶试验快速、简便，但常有假阳性和假阴性.细菌培养则要尽可能缩短接种前标本的转运时间，细菌生长缓慢且需要特殊的培养条件，球形Hp则不易培养成活.银染色后做显微镜检查虽然敏感性和特异性均高，但操作较烦琐，要求技术上熟练程度高，且费时，价格较贵.非侵入性的方法如14C或13C呼气试验虽具有快速、可靠、无痛苦的优点，但费用较高，且接触同位素.血清抗体的检测则主要用于流行病学研究.PCR方法不仅快速、简便，而且证实引物CP1/CP2对Hp的扩增是特异的，而对其它细菌和无Hp感染的人胃粘膜则无扩增产物出现.该方法只需要从胃粘膜活检标本中粗提模板DNA，其检出的最小Hp DNA量为0.1pg，相当于100个细菌细胞，与文献报道结果相似[2]. 本研究中将PCR技术用于Hp感染的诊断，并与传统的尿素酶试验、细菌培养及银染色方法进行了比较.表1可以看出，7例尿素酶试验阴性，9例细菌培养阴性及2例银染色阴性者，用PCR检测则全部为阳性.PCR技术确实较常规检测方法更为敏感，可以检出常规方法不能检出的Hp.Hp感染治疗后易短期内复发的原因是：药物治疗后Hp数量减少，生长受到抑制，但细菌并未彻底根除.由于常规检测方法不够敏感，使得部分Hp未彻底根除的患者不能被检出，而误认为Hp已经根除不再继续治疗.本研究中将PCR技术用于抗生素治疗后检测Hp是否被根除，发现20例3项常规检测方法均为阴性认为Hp已被根除的患者，用PCR方法检测证实其中4例Hp仍为阳性.说明药物治疗并未使这4名患者感染的Hp彻底根除，只是细菌数量减少，用常规检查方法难以检出.
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4 参考文献1 Hoshina S, Kahn SM, Jiang W, et al . Direct detection and amplification of Helicobacter pylori ribosomal
16S gene segments from gastric endoscopic biopsies. Diagn Microbiol Infect Dis, 1990;13(6):473-479
2 Ho SA, Hoyle JA, Lewis FA, et al. Direct polymerase chain reaction test for detection of Helicobacter
pylori in humans and animals. J Clin Mirrobiol, 1991;29(11):2543-2549
, 百拇医药
3 Clayton CL, Kleanthous H, Coates PJ, et al. Sensitive detection of Helicobacter pylori by using
polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1992;30(1):1922-200
4 宋敏.用巢式聚合酶链反应在唾液中检测出幽门螺杆菌.中华流行病杂志，1993；14(4)：237-240
5 Zhu H, Qu F, Zhu LH. Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride.
Nucleic Acids Res, 1993;21(22):5279-5280, http://www.100md.com