结直肠癌组织中人乳头瘤病毒DNA的研究
河南医科大学第一附属医院消化科 河南省郑州市 450052
徐芸，女，1962-04-13生，湖南省长沙市人，回族.1985年河南医科大学本科毕业，1991年获消化科硕士学位，毕业后从事医疗、教学及临床实验室工 作至今.
项目负责人：徐芸河南省郑州市建设路1号.
Telephone:0371-6967785-3226
收稿日期：1996-01-07 修回日期：1996-06-14
Study on human papillomavirus DNA in colorectal carcinoma
, 百拇医药
Xu Yun, Guo Gian-Cheng and Zhang Lian-Feng
Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Hen an Medical University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
AbstractAIM To study the relationship between human papillomavirus ( HPV) and colorectal carcinoma.
METHODS HPV DNA was detected with general consensus primers and type-specific primers by polymerase chair reaction (PCR).
, 百拇医药
RESULTS In 123 samples biopsied from colonic mucosa, including colorectal cancer (n=35), papillo-adenoma (n=17), inflammatory polyp (n=11), colitis (n=30) and normal colonic mucosa (n=30), HPV DNA was detected in 14.6% of the specimens, two of 71 (33%) in normal tissue, colorectitis and inflammatary polyp, three of 17 (17.6%) in papillo-adenom as and thirteen of 35 (37.1%) in colorectal carcinoma. Type-18 of HPV DNA was detected in 3 patients with papillo-adenomas and 13 patients with colorectal ca rcinoma. The detection rate of HPV DNA gradually rose in the normal, adjacent an d carcinoma tissues. HPV infection rates were 28.6%, 14% and 2.6% in rectum, left colon and right colon, respectively.
, http://www.100md.com
CONCLUSION There is a relationship between colorectal carcinom a and type 16, 18 HPV infection. Type-18 HPV infection is dominant in adenocarc inoma. The HPV infection rate is higher in rectum and left colon than in right c olon.
Subject headings Colorectal neoplasms/virology; Papillomavir us, human/genetics; DNA, viral/analysis; Adenocarcinoma/virology
摘 要目的 研究16、18型人乳头瘤病毒(HPV)是否与结直肠癌的发生有关.
, 百拇医药
方法 结直肠粘膜活检组织123例，其中结直肠癌35例，乳头状腺瘤17例，炎性息肉11例，结肠炎30例，以及正常结肠粘膜30例，用对各型HPV高度保守的通用引物和16、18型特异性引物作聚合酶链反应(PCR)检测HPV DNA.
结果 HPV DNA总检出率14.6%，正常粘膜，结肠炎和炎性息肉组为3.3% (2/71),乳头状腺瘤7.6%(3/17)，结直肠腺癌为37.1%(13/35).在正常粘膜，结肠炎和炎性息肉组未发现16、18型HPV DNA，在乳头状腺瘤组有3例为18型HPV DNA阳性，结直肠腺癌组13例HPV阳性病例中有3例为16型，9例为18型感染；在正常组织、癌旁组织和癌组织中HPV DNA检出率依次增高.HPV在直肠、左半结肠，右半结肠感染率依次为28.6%，14%，2.6%.
结论 结肠癌的发生与HPV16、18型有关，腺癌以18型感染为主.HPV DNA检 出率在右半结肠，左半结肠和直肠依次增高.
, 百拇医药
主题词 结肠直肠肿瘤/病毒学;乳头状瘤病毒，人/遗传学;DNA，病毒/分析;腺癌/病毒学
HPV可以感染其它器官的鳞状上皮[1]，腺上皮HPV感染与腺癌发生的关系结论不甚 相同[2-3].我们采用人乳头瘤病毒的高度保守的通用引物和E6，E7区的16、1 8型特异引物，对123例结肠镜下结直肠活检标本作聚合酶链反应(PCR)，检测HPV DNA，目的 在于了解公认的与生殖器肿瘤发生有关的16、18型HPV是否也与结直肠癌的发生有关.
1 材料和方法1.1 材料 标本取自我市各医院结肠镜下结直肠活检组织标本共123例，每例于病变部位取4块，其中结 直肠癌35例，分别在癌组织、癌旁组织(病变周围5 cm以内)和正常组织(病变周围5 cm以 外的正常处)，各取4块，2块用福尔马林固定，待作病理检查，常规石蜡包埋，HE染色，由两位有经验的病理医生诊断，35例结直肠癌组织全为腺癌. 有些病例有术后标本病理诊 断.2块放入盛有TE(0.5mol/L Tris pH 9.0， 0.02mol/L EDTA，0.01mol/L NaCl)缓冲液中，15 mg组织/ml， 于-20℃保存.
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1.2 方法 提取模板按Rogers方法加以改良，将保存组织块的溶液融化后，加蛋白酶K至终浓度250 μg/ml，在48℃水浴3 h，再加蛋白酶K至终浓度500 μg/ml水浴过夜.用酚-氯 仿-异戊醇(50∶49∶1)抽提，乙醇沉淀，溶于20 μl双蒸水中，待作PCR.PCR试剂由北京科海生物工程公司提供.100 μl反应液中，含10 mmol/L Tris_HCl (pH 8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.02%明胶，40μmol/L 4×dNTP，0.4μmol/L每对引物(表1)，2μ Taq DNA聚合酶及5?μl模板，94℃预变性300S后，94℃ 45S，58℃ 30S，72℃ 60S，35个循环，扩增产物在2%的用EB染色的琼脂糖凝胶上电泳30?min，紫外灯下观察荧光带.通用引物和16、18型特异物的扩增产物分别是450，252和201 bp.
统计学处理 用卡方检验.
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表1 通用引物和16、18型特异引物
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2 结果用通用引物及16、18型特异引物可在结直肠组织中扩增出各型HPV DNA.将123例结直肠癌组 织活检标本用HPV通用引物扩增出18例HPV DNA阳性的标本，阳性率为146%，再分别用16、 18型特异引物扩增(表2).正常粘膜、结肠炎和炎性息肉三组共71例，HPV DNA阳性2例，阳 性率3.3%，结直肠乳头状腺瘤17例，阳性3例，阳性率为17.6%，结直肠癌35例，阳性13例 ，阳性率为37.1%，将这三组比较，X2=22.14，P<0.01.差异非常显著.结直肠癌HPV DNA感染率明显高于其它组.我们并发现除在乳头状腺瘤组有3 例16、18型HPV DNA检出外，其它良性病变中均未发现有HPV 16、18型的感染.而在结直肠腺癌中13例HPV DNA阳性的病例有12例为16或18型感染.将35例结直肠癌病例的 癌组织、癌旁组织和正常组织进行HPV DNA检测，发现正常组织(2.9%)，癌旁组织(5.7%)，和癌组织HPV DNA检出率(37.1%)依次增高.在123例结直肠活检标本中，有35例取自直肠，50例取自左半结肠，38例取自右半结肠，HPV检出率以左半结肠以下较高，右半结肠仅1例(表3).
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表2 各类结直肠病变中HPV DNA的检出情况
, 百拇医药
表3 结直肠不同部位HPV感染情况
, http://www.100md.com
3 讨论结肠癌与HPV的关系报道少见，我们发现在结直肠粘膜组织中可以检测到HPV DNA，并发现在 正常组织、癌旁组织和癌组织中HPV DNA的检出率依次升高[4].一般认为16型与鳞 癌发生关系较密切，而18型多与腺癌有关，我们看到，在结直肠腺癌中HPV感染也以18型占 多数，16型与18型之比为1/3.Koulos[5]报道HPV DNA阳性的肛门癌8例，2例鳞癌均为HPV 16型阳性，6例腺癌均为18型阳性.另外3例腺瘤样息肉和7例结直肠腺癌均无HPV DNA存在.相反，许多学者[6-8]报道各型结肠腺瘤或腺癌及结肠癌细胞系中都证明有HPV抗原存在，或HPV DNA存在.这些差异有待进一步研究.Lewensohn[1]和Chang[6]认为，肿瘤的发生是16、18型HPV可使p53基因突变而使之异常表达，或HPV的E6蛋白与P53蛋白的相互作用而影响抑癌基因正常发挥所致.众 所周知，HPV作为性传染病常感染会阴部，它对结肠的感染无疑也是上行性的.所以直肠和左 半结肠比右半结肠有更多接触HPV的机会.我们的结果也表明了HPV DNA检出率右半结肠、左 半结肠和直肠HPV DNA检出率依次增高.
, 百拇医药
总之，通过用HPV高度保守的通用引物对123例结直肠组织用PCR检测HPV DNA，阳性率为14 .6%，结直肠癌组明显高于其它两组，有癌变可能性的结直肠乳头状腺瘤HPV DNA检出率也 有17.6%，并且癌组织比癌旁组织和正常组织HPV DNA检出率明显增高，说明结直肠癌的发 生与HPV，特别是其18型有一定关系.同时发现，越是接近肛门HPV感染机会就越多.
4 参考文献1 Lewensohn FI, Munck WE, Berke Z, et al. Involvement of aberrant P53 expression and human papillomavirus in carcinoma of the
head, neak and esophagus. Anticancer Res, 1994;14(38):1281-1285
, 百拇医药 2 Shroyer KR, Kim GJ, Manos MM, et al. Papillomavirus found ianorectal squa mous carcinoma not in colon adenocarcinoma. Arch Surg,1992;127(6):741-744
3 Kirgan D, Manalo P, Hall M, et al. Association of human papillomavirus an d colon neoplasms. Arch Surg, 1990;125(7):862-865
4 Cooper K. Human papillomavirus DNA sequences in esophagus sequamous cell carc inoma. Gastroenterology, 1994;107(1):128-136
, 百拇医药 5 Koulos J, Symmans F, Chumas J, et al. Human papillomavirus detection in adenocacinoma of the anus. Mod Pathol, 1991;4(1):58-61
6 Chang F, Syrjanen S, Tervahauta A, et al. Frequent mutations of P53 in es ophageal sequamous cell carcinomas with and without
human papillomavirus (HPV) involvment suggest the dominant role of enviranmental carcinomas in oesophageal carcinogenesis. Br J
Cancer, 1994;70(2):346-351
7 Cheng JY, Shen LF, Lin JC, et al. Detection of human papillomavirus DNA i n colorectal adenomas. Arch Surg, 1995;130(1):73-76
8 Cheng JY, Meng CL, Chao CF, et al. Human papillomavirus 16 DNA in NIH3T3 cells transformed by colonic cancer cellular DNA.
Gut, 1993;34(12):1710-1713, http://www.100md.com(徐芸 郭建成 张连峰)
徐芸，女，1962-04-13生，湖南省长沙市人，回族.1985年河南医科大学本科毕业，1991年获消化科硕士学位，毕业后从事医疗、教学及临床实验室工 作至今.
项目负责人：徐芸河南省郑州市建设路1号.
Telephone:0371-6967785-3226
收稿日期：1996-01-07 修回日期：1996-06-14
Study on human papillomavirus DNA in colorectal carcinoma
, 百拇医药
Xu Yun, Guo Gian-Cheng and Zhang Lian-Feng
Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Hen an Medical University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
AbstractAIM To study the relationship between human papillomavirus ( HPV) and colorectal carcinoma.
METHODS HPV DNA was detected with general consensus primers and type-specific primers by polymerase chair reaction (PCR).
, 百拇医药
RESULTS In 123 samples biopsied from colonic mucosa, including colorectal cancer (n=35), papillo-adenoma (n=17), inflammatory polyp (n=11), colitis (n=30) and normal colonic mucosa (n=30), HPV DNA was detected in 14.6% of the specimens, two of 71 (33%) in normal tissue, colorectitis and inflammatary polyp, three of 17 (17.6%) in papillo-adenom as and thirteen of 35 (37.1%) in colorectal carcinoma. Type-18 of HPV DNA was detected in 3 patients with papillo-adenomas and 13 patients with colorectal ca rcinoma. The detection rate of HPV DNA gradually rose in the normal, adjacent an d carcinoma tissues. HPV infection rates were 28.6%, 14% and 2.6% in rectum, left colon and right colon, respectively.
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CONCLUSION There is a relationship between colorectal carcinom a and type 16, 18 HPV infection. Type-18 HPV infection is dominant in adenocarc inoma. The HPV infection rate is higher in rectum and left colon than in right c olon.
Subject headings Colorectal neoplasms/virology; Papillomavir us, human/genetics; DNA, viral/analysis; Adenocarcinoma/virology
摘 要目的 研究16、18型人乳头瘤病毒(HPV)是否与结直肠癌的发生有关.
, 百拇医药
方法 结直肠粘膜活检组织123例，其中结直肠癌35例，乳头状腺瘤17例，炎性息肉11例，结肠炎30例，以及正常结肠粘膜30例，用对各型HPV高度保守的通用引物和16、18型特异性引物作聚合酶链反应(PCR)检测HPV DNA.
结果 HPV DNA总检出率14.6%，正常粘膜，结肠炎和炎性息肉组为3.3% (2/71),乳头状腺瘤7.6%(3/17)，结直肠腺癌为37.1%(13/35).在正常粘膜，结肠炎和炎性息肉组未发现16、18型HPV DNA，在乳头状腺瘤组有3例为18型HPV DNA阳性，结直肠腺癌组13例HPV阳性病例中有3例为16型，9例为18型感染；在正常组织、癌旁组织和癌组织中HPV DNA检出率依次增高.HPV在直肠、左半结肠，右半结肠感染率依次为28.6%，14%，2.6%.
结论 结肠癌的发生与HPV16、18型有关，腺癌以18型感染为主.HPV DNA检 出率在右半结肠，左半结肠和直肠依次增高.
, 百拇医药
主题词 结肠直肠肿瘤/病毒学;乳头状瘤病毒，人/遗传学;DNA，病毒/分析;腺癌/病毒学
HPV可以感染其它器官的鳞状上皮[1]，腺上皮HPV感染与腺癌发生的关系结论不甚 相同[2-3].我们采用人乳头瘤病毒的高度保守的通用引物和E6，E7区的16、1 8型特异引物，对123例结肠镜下结直肠活检标本作聚合酶链反应(PCR)，检测HPV DNA，目的 在于了解公认的与生殖器肿瘤发生有关的16、18型HPV是否也与结直肠癌的发生有关.
1 材料和方法1.1 材料 标本取自我市各医院结肠镜下结直肠活检组织标本共123例，每例于病变部位取4块，其中结 直肠癌35例，分别在癌组织、癌旁组织(病变周围5 cm以内)和正常组织(病变周围5 cm以 外的正常处)，各取4块，2块用福尔马林固定，待作病理检查，常规石蜡包埋，HE染色，由两位有经验的病理医生诊断，35例结直肠癌组织全为腺癌. 有些病例有术后标本病理诊 断.2块放入盛有TE(0.5mol/L Tris pH 9.0， 0.02mol/L EDTA，0.01mol/L NaCl)缓冲液中，15 mg组织/ml， 于-20℃保存.
, http://www.100md.com
1.2 方法 提取模板按Rogers方法加以改良，将保存组织块的溶液融化后，加蛋白酶K至终浓度250 μg/ml，在48℃水浴3 h，再加蛋白酶K至终浓度500 μg/ml水浴过夜.用酚-氯 仿-异戊醇(50∶49∶1)抽提，乙醇沉淀，溶于20 μl双蒸水中，待作PCR.PCR试剂由北京科海生物工程公司提供.100 μl反应液中，含10 mmol/L Tris_HCl (pH 8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.02%明胶，40μmol/L 4×dNTP，0.4μmol/L每对引物(表1)，2μ Taq DNA聚合酶及5?μl模板，94℃预变性300S后，94℃ 45S，58℃ 30S，72℃ 60S，35个循环，扩增产物在2%的用EB染色的琼脂糖凝胶上电泳30?min，紫外灯下观察荧光带.通用引物和16、18型特异物的扩增产物分别是450，252和201 bp.
统计学处理 用卡方检验.
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表1 通用引物和16、18型特异引物
| 型别 | 序列 | 产物 |
| 通用引物PL1 | 5’-CGTCCAAGAGGAAACTGATC_3' | 450bp |
| 通用引物PL2 | 5'-GCACAGGGACATAATAATGG-3' | |
| 16型特异引物1 | 5'-CCCAGCTGTAATCATGCATGGAGA-3' | 253bp |
| 16型特异引物2 | 5'-GTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCA-3' | |
| 18型特异引物1 | 5'-CGACAGGAACGACTCCAACGA-3' | 201bp |
| 18型特异引物2 | 5'-GCTGGTAAATGTTGATGATTTAACT-3' |
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2 结果用通用引物及16、18型特异引物可在结直肠组织中扩增出各型HPV DNA.将123例结直肠癌组 织活检标本用HPV通用引物扩增出18例HPV DNA阳性的标本，阳性率为146%，再分别用16、 18型特异引物扩增(表2).正常粘膜、结肠炎和炎性息肉三组共71例，HPV DNA阳性2例，阳 性率3.3%，结直肠乳头状腺瘤17例，阳性3例，阳性率为17.6%，结直肠癌35例，阳性13例 ，阳性率为37.1%，将这三组比较，X2=22.14，P<0.01.差异非常显著.结直肠癌HPV DNA感染率明显高于其它组.我们并发现除在乳头状腺瘤组有3 例16、18型HPV DNA检出外，其它良性病变中均未发现有HPV 16、18型的感染.而在结直肠腺癌中13例HPV DNA阳性的病例有12例为16或18型感染.将35例结直肠癌病例的 癌组织、癌旁组织和正常组织进行HPV DNA检测，发现正常组织(2.9%)，癌旁组织(5.7%)，和癌组织HPV DNA检出率(37.1%)依次增高.在123例结直肠活检标本中，有35例取自直肠，50例取自左半结肠，38例取自右半结肠，HPV检出率以左半结肠以下较高，右半结肠仅1例(表3).
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表2 各类结直肠病变中HPV DNA的检出情况
| 病变类型 | n | HPV+ | % | HPV分型 | |
| 16型 | 18型 | ||||
| 正常粘膜 | 30 | 1 | 0 | 0 | |
| 结肠炎 | 30 | 1 | 3.3 | 0 | 0 |
| 炎性息肉 | 11 | 0 | 0 | 0 | |
| 乳头状腺瘤 | 17 | 3 | 17.6 | 0 | 3 |
| 原位癌 | 9 | 3 | 1 | 2 | |
| 浸润癌 | 26 | 10 | 37.1 | 2 | 7 |
| 合计 | 123 | 18 | 14.6 | 3 | 12 |
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表3 结直肠不同部位HPV感染情况
| 病变类型 | 直肠 | 左半结肠 | 右半结肠 | ||||||
| n | HPV+ | % | n | HPV+ | % | n | HPV+ | % | |
| 正常粘膜 | 10 | 1 | 10 | 0 | 10 | 0 | |||
| 结肠炎 | 10 | 0 | 10 | 1 | 10 | 0 | |||
| 炎性息肉 | 3 | 0 | 4 | 0 | 4 | 0 | |||
| 乳头状腺瘤 | 3 | 2 | 10 | 1 | 4 | 0 | |||
| 原位癌 | 1 | 1 | 3 | 2 | 5 | 0 | |||
| 浸润癌 | 8 | 6 | 13 | 3 | 5 | 1 | |||
| 合计 | 35 | 10 | 28.6 | 50 | 7 | 14.0 | 38 | 1 | 2.6 |
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3 讨论结肠癌与HPV的关系报道少见，我们发现在结直肠粘膜组织中可以检测到HPV DNA，并发现在 正常组织、癌旁组织和癌组织中HPV DNA的检出率依次升高[4].一般认为16型与鳞 癌发生关系较密切，而18型多与腺癌有关，我们看到，在结直肠腺癌中HPV感染也以18型占 多数，16型与18型之比为1/3.Koulos[5]报道HPV DNA阳性的肛门癌8例，2例鳞癌均为HPV 16型阳性，6例腺癌均为18型阳性.另外3例腺瘤样息肉和7例结直肠腺癌均无HPV DNA存在.相反，许多学者[6-8]报道各型结肠腺瘤或腺癌及结肠癌细胞系中都证明有HPV抗原存在，或HPV DNA存在.这些差异有待进一步研究.Lewensohn[1]和Chang[6]认为，肿瘤的发生是16、18型HPV可使p53基因突变而使之异常表达，或HPV的E6蛋白与P53蛋白的相互作用而影响抑癌基因正常发挥所致.众 所周知，HPV作为性传染病常感染会阴部，它对结肠的感染无疑也是上行性的.所以直肠和左 半结肠比右半结肠有更多接触HPV的机会.我们的结果也表明了HPV DNA检出率右半结肠、左 半结肠和直肠HPV DNA检出率依次增高.
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总之，通过用HPV高度保守的通用引物对123例结直肠组织用PCR检测HPV DNA，阳性率为14 .6%，结直肠癌组明显高于其它两组，有癌变可能性的结直肠乳头状腺瘤HPV DNA检出率也 有17.6%，并且癌组织比癌旁组织和正常组织HPV DNA检出率明显增高，说明结直肠癌的发 生与HPV，特别是其18型有一定关系.同时发现，越是接近肛门HPV感染机会就越多.
4 参考文献1 Lewensohn FI, Munck WE, Berke Z, et al. Involvement of aberrant P53 expression and human papillomavirus in carcinoma of the
head, neak and esophagus. Anticancer Res, 1994;14(38):1281-1285
, 百拇医药 2 Shroyer KR, Kim GJ, Manos MM, et al. Papillomavirus found ianorectal squa mous carcinoma not in colon adenocarcinoma. Arch Surg,1992;127(6):741-744
3 Kirgan D, Manalo P, Hall M, et al. Association of human papillomavirus an d colon neoplasms. Arch Surg, 1990;125(7):862-865
4 Cooper K. Human papillomavirus DNA sequences in esophagus sequamous cell carc inoma. Gastroenterology, 1994;107(1):128-136
, 百拇医药 5 Koulos J, Symmans F, Chumas J, et al. Human papillomavirus detection in adenocacinoma of the anus. Mod Pathol, 1991;4(1):58-61
6 Chang F, Syrjanen S, Tervahauta A, et al. Frequent mutations of P53 in es ophageal sequamous cell carcinomas with and without
human papillomavirus (HPV) involvment suggest the dominant role of enviranmental carcinomas in oesophageal carcinogenesis. Br J
Cancer, 1994;70(2):346-351
7 Cheng JY, Shen LF, Lin JC, et al. Detection of human papillomavirus DNA i n colorectal adenomas. Arch Surg, 1995;130(1):73-76
8 Cheng JY, Meng CL, Chao CF, et al. Human papillomavirus 16 DNA in NIH3T3 cells transformed by colonic cancer cellular DNA.
Gut, 1993;34(12):1710-1713, http://www.100md.com(徐芸 郭建成 张连峰)