流式细胞光度术研究大鼠肝癌及癌前病变DNA的变化
1山西医科大学第二医院消化科 山西省太原市 030001
2河北省肿瘤研究所 河北省石家庄市
郭文栋，男，1937-10-16生，河南省洛阳市人，汉族. 1962年山西医学院医疗系毕业，内科学教授，主任医师. 中华消化内镜学会委员，中华消化内镜杂志编委，山西医学会消化系病学会副主任委员，本刊编委，主要从事消化内镜和肝病的研究工作，发表论文25篇.
项目负责人 郭文栋，太原市五一路.
Tel:0351-3074231-2398
收搞日期 1996-04-03 接受日期: 1996-08-17
Flow cytometric DNA analysis of hepatic precancerosis and hepatocellular carcinoma in rats
, http://www.100md.com
Wen-Dong Guo, Wen Yang, Ai-Ping Du and Lian-Fu Zuo
Department to Gastroenterology, the Second Teaching Hospital of Shan xi Medical University, Taiyuan 030001, China
Abstract
AIM To investigate the changes of nuclear DNA content of dif ferent hepatic diseases in rats by flow cytometric (FCM) analysis.
METHODS Samples were obtained from normal liver, cirrhosis, dysplasia proliferation and hepatocellular carcinoma (HCC) in rats. These samples were made into single-cell suspension and analysed with FCM.
, 百拇医药
RESULTS From normal liver to HCC, the diploid ratios were signi ficantly increased (71.0±2.2, 75.0±2.8, 76.0±4.4, 80.0±3.9, P<0.05). The tetraploid ratios were significantly decreased (15.0±1.4, 14.0±1.0, 12.0±2.4, 9.9±1.7, P<0.05), and the S-phase fraction ratios increased (8.4±1.4, 10.0±1.0, 10.8±2.5, 11.3±1.8, P<0.05). There were four euploids in the 8 cases of HCC.
CONCLUSION FCM DNA analysis is of significance in early diagno sis of HCC.
, http://www.100md.com
Subject headings Liver neoplasms Carcinoma, hepatocellular Cytometry precancerous conditions; DNA, neoplasms/analysis
GUO WD, Yang W, Du AP, Zuo LF. Flow cytometric DNA analysis of hepatic precancerosis and hepatocellular carcinoma in rats.Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997;5(5):289-290
摘 要目的 用流式细胞光度术(FCM)探讨大鼠肝癌和癌前病变DNA变化的意义.
, 百拇医药
方法 取正常大鼠、肝硬变、非典型增生和肝癌大鼠肝脏组织块，制成单细胞悬液，做FCM分析.
结果 从正常肝组织到肝脏的各级病变，二倍体细胞所占的百分比逐渐增加(71.0±2.2，75.0±2.8，76.0±4.4，80.0±3.9，P<0.05)，四倍体细胞百分比则下降(15.0±1.4，14.0±1.0，12.0±2.4，9.9±1.7，P<0.05)，S期比率(%)升高(8.4±1.4，10.0±1.0，10.8±2.5，11.3±1.8, P<0.05).在肝癌大鼠中50%为异倍体.
结论 FCM分析对肝癌前病变及肝癌的早期诊断有一定的临床意义.
主题词 肝肿瘤 癌，肝细胞 癌前状态 细胞流式术 DNA，肿瘤/分析
, 百拇医药
郭文栋, 杨文, 杜爱萍, 左连富.流式细胞光度术研究大鼠肝癌及癌前病变DNA的变化.新消化病学杂志,1997;5(5):289-290
流式细胞光度术(FCM)是一种快速、定量的细胞分析方法，可对单个细胞核DNA含量作出定量分析，动态了解群体细胞增殖周期的变化，为估价肿瘤细胞的生物特性提供了补充 手段，当前FCM对肝癌的研究，多用于估计预后和恶性程度.本实验通过对大鼠正常肝脏、 肝硬变、非典型增生和肝癌组织的FCM分析，以探讨对肝脏癌前病变程度的估计和肝癌早期诊断的可行性.
1 材料和方法
1.1 材料 取Wistar大鼠70只(山西医科大学实验动物中心提供)，体重120g，雌雄不限. 分为实验组60只，正常对照组10只.实验开始，实验组动物自由饮用1.47mmol/L 二乙基 亚硝胺水溶液(中国科学院南京土壤研究所提供)，正常组饮用自来水.饲养1.5个月后全麻 下，取小块肝组织固定于70%冷酒精中备作FCM分析.另取肝组织10%福尔马林固定，HE染色， 根据病理变化[1]分为正常组、肝硬变组、非典型增生组、肝癌组.从每组中取出8 只原已固定于冷酒精中的组织块做FCM分析.
, http://www.100md.com
1.2 流式细胞测定方法 肝组织剪碎后，0.5%胃蛋白酶消化，制成单细胞悬液(106/ml)，溴化乙啶染色，鸡红细 胞做标准样品，使变异系数小于5%.每份样品检测104个细胞，FACS 420型流式细胞仪检测(美国Becton Dickison 公司生产).DNA指数(DI)=样品细胞G0/G1峰道值
正常细胞G0/G1峰道值.细胞周期时相：G0/G1期、S期、G2M期.统计学处理：数据采用t 检验、方差分析.
2 结果从正常肝组织、肝硬变、非典型增生到肝细胞癌， 二倍体细胞所占比率逐渐增加，四倍体 细胞所占比率逐渐下降，S期比率逐渐增加，且肝癌组与肝硬变、非典型增生组相比均有显 著差异(P<0.05，表1).正常组、肝硬变组DI值均为二倍体，非典型增生组1只为异倍 体，而肝癌组8只大鼠中4只为异倍体.表明FCM检测二倍体、四倍体、S期比率变化及异倍体 的多少可为肝癌早期诊断提供一客观指标.
, 百拇医药
表1 肝细胞DNA倍体分布及S期细胞百分比 (x±s,%)
, http://www.100md.com
aP<0.05，vs 正常组；bP<0.05，vs 肝硬变组；cP<0.05，vs 非典型增生组.
3 讨论人类正常肝脏组织中含有10%～40%的多倍体细胞.肝干细胞是二倍体细胞形式存在.在慢性肝炎、肝硬变和肝癌中，具有干细胞样特性的二倍体细胞增多，多倍体细胞减少.该二倍体细胞具有较强而持久的增殖能力.因此二倍体细胞比率增加表示细胞分化减弱，增生能力加强.有人证实，二倍体细胞基因组进一步发展为癌的危险性大，其发生隐性突变也 相对较高，同时二倍体细胞抗癌基因的作用比多倍体细胞更易缺失[2]. Anti等 [3]对慢性肝炎、肝硬变和肝硬变基础上超声诊断有结节者行FCM分析，结果慢性肝炎、肝硬变二倍体比正常肝脏明显增加，在结节中尤为明显.可见二倍体细胞和多倍体细胞比率的改变在慢性肝病的 动态观察中具有一定的临床意义.DNA指数(DI)表示细胞DNA的相对含量.在正常细胞向癌细胞转变过程中，核酸代谢逐渐增强，DNA合成加速，染色体数目偏离正常，形态不规则.改变程度随着癌的演变及恶性程度递增而逐渐加重.这与肿瘤细胞学观察到的核深染、核仁增大，染色质增多、分布不均相一 致.这些异常改变必将反映在分子基础-DNA含量的变化上，在FCM中表现为异倍体细胞出现 .异倍体是肝癌的共同特征[4，5]，与生存期、肿瘤大小、肿瘤分级、血管浸润级 别、肝内转移及血清AFP水平相关[4].Roncalli等[6]发现一些非典型增生的肝细胞中也可出现异倍体细胞，这和本实验结果相符.因为肝硬变向肝癌演变过程中 ，各类病变间无绝对界限.本实验中各组病变的S期细胞所占的比率随着肝脏病变的严重程度而进行性升高.Anti等[3]在人类慢性肝炎、肝硬变及肝癌中得到类似结果.在细胞分裂周期中，S期最能反 映细胞的增殖活性， 其主要特征是DNA合成旺盛.正常及生长缓慢的组织，S期所占的比率 很小.在慢性肝炎、肝硬变、肝细胞非典型增生及肝癌中，随着细胞增殖，DNA合成加速，S 期比率增大，因此通过对S期测定可反映肝细胞的增殖程度.
, 百拇医药
4 参考文献1 Sakamoto M, Hirohashi S, Shimosato Y. Early stages of multistep hepatocarcinogenesis: adenomatous hyperplasia and
early hepatocellular carcinoma. Hum Pathol, 1991;2(2):172-178
2 Preston-Martin S, Pike MC, Poss PK, et al. Increased cell division as a cause of human cancer. Cancer Res, 1990;50(23):7415-7421
3 Anti M, Marra G, Kapaccini GL, et al. DNA ploidy pattern in human chronic liver diseases and hepatic nodular lesions. Flow cytometric
, 百拇医药
analysis on echo-guided needle liver biopsy. Cancer, 1994;75(2):281-288
4 Fujimoto J, Okamoto E, Yamanaka N, et al. Flow cytometric DNA analysis of hepatocellular carcinoma. Cancer, 1991;67(4):939-944
5 Lin HH, Shyn WC, Chen GL, et al. DNA measurements in chronic hepatitis cirrhosis and hepatocellular carcinoma.
Liver, 1990;10(5):313-318
6 Roncalli M, Borzio M, Brando B, et al. Abnormal DNA content in liver-cell dysplasia: A flow cytometric study.
Int J Cancer, 1987;44(3):204-207, 百拇医药(郭文栋 杨文 杜爱萍 左连富)
2河北省肿瘤研究所 河北省石家庄市
郭文栋，男，1937-10-16生，河南省洛阳市人，汉族. 1962年山西医学院医疗系毕业，内科学教授，主任医师. 中华消化内镜学会委员，中华消化内镜杂志编委，山西医学会消化系病学会副主任委员，本刊编委，主要从事消化内镜和肝病的研究工作，发表论文25篇.
项目负责人 郭文栋，太原市五一路.
Tel:0351-3074231-2398
收搞日期 1996-04-03 接受日期: 1996-08-17
Flow cytometric DNA analysis of hepatic precancerosis and hepatocellular carcinoma in rats
, http://www.100md.com
Wen-Dong Guo, Wen Yang, Ai-Ping Du and Lian-Fu Zuo
Department to Gastroenterology, the Second Teaching Hospital of Shan xi Medical University, Taiyuan 030001, China
Abstract
AIM To investigate the changes of nuclear DNA content of dif ferent hepatic diseases in rats by flow cytometric (FCM) analysis.
METHODS Samples were obtained from normal liver, cirrhosis, dysplasia proliferation and hepatocellular carcinoma (HCC) in rats. These samples were made into single-cell suspension and analysed with FCM.
, 百拇医药
RESULTS From normal liver to HCC, the diploid ratios were signi ficantly increased (71.0±2.2, 75.0±2.8, 76.0±4.4, 80.0±3.9, P<0.05). The tetraploid ratios were significantly decreased (15.0±1.4, 14.0±1.0, 12.0±2.4, 9.9±1.7, P<0.05), and the S-phase fraction ratios increased (8.4±1.4, 10.0±1.0, 10.8±2.5, 11.3±1.8, P<0.05). There were four euploids in the 8 cases of HCC.
CONCLUSION FCM DNA analysis is of significance in early diagno sis of HCC.
, http://www.100md.com
Subject headings Liver neoplasms Carcinoma, hepatocellular Cytometry precancerous conditions; DNA, neoplasms/analysis
GUO WD, Yang W, Du AP, Zuo LF. Flow cytometric DNA analysis of hepatic precancerosis and hepatocellular carcinoma in rats.Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997;5(5):289-290
摘 要目的 用流式细胞光度术(FCM)探讨大鼠肝癌和癌前病变DNA变化的意义.
, 百拇医药
方法 取正常大鼠、肝硬变、非典型增生和肝癌大鼠肝脏组织块，制成单细胞悬液，做FCM分析.
结果 从正常肝组织到肝脏的各级病变，二倍体细胞所占的百分比逐渐增加(71.0±2.2，75.0±2.8，76.0±4.4，80.0±3.9，P<0.05)，四倍体细胞百分比则下降(15.0±1.4，14.0±1.0，12.0±2.4，9.9±1.7，P<0.05)，S期比率(%)升高(8.4±1.4，10.0±1.0，10.8±2.5，11.3±1.8, P<0.05).在肝癌大鼠中50%为异倍体.
结论 FCM分析对肝癌前病变及肝癌的早期诊断有一定的临床意义.
主题词 肝肿瘤 癌，肝细胞 癌前状态 细胞流式术 DNA，肿瘤/分析
, 百拇医药
郭文栋, 杨文, 杜爱萍, 左连富.流式细胞光度术研究大鼠肝癌及癌前病变DNA的变化.新消化病学杂志,1997;5(5):289-290
流式细胞光度术(FCM)是一种快速、定量的细胞分析方法，可对单个细胞核DNA含量作出定量分析，动态了解群体细胞增殖周期的变化，为估价肿瘤细胞的生物特性提供了补充 手段，当前FCM对肝癌的研究，多用于估计预后和恶性程度.本实验通过对大鼠正常肝脏、 肝硬变、非典型增生和肝癌组织的FCM分析，以探讨对肝脏癌前病变程度的估计和肝癌早期诊断的可行性.
1 材料和方法
1.1 材料 取Wistar大鼠70只(山西医科大学实验动物中心提供)，体重120g，雌雄不限. 分为实验组60只，正常对照组10只.实验开始，实验组动物自由饮用1.47mmol/L 二乙基 亚硝胺水溶液(中国科学院南京土壤研究所提供)，正常组饮用自来水.饲养1.5个月后全麻 下，取小块肝组织固定于70%冷酒精中备作FCM分析.另取肝组织10%福尔马林固定，HE染色， 根据病理变化[1]分为正常组、肝硬变组、非典型增生组、肝癌组.从每组中取出8 只原已固定于冷酒精中的组织块做FCM分析.
, http://www.100md.com
1.2 流式细胞测定方法 肝组织剪碎后，0.5%胃蛋白酶消化，制成单细胞悬液(106/ml)，溴化乙啶染色，鸡红细 胞做标准样品，使变异系数小于5%.每份样品检测104个细胞，FACS 420型流式细胞仪检测(美国Becton Dickison 公司生产).DNA指数(DI)=样品细胞G0/G1峰道值
正常细胞G0/G1峰道值.细胞周期时相：G0/G1期、S期、G2M期.统计学处理：数据采用t 检验、方差分析.
2 结果从正常肝组织、肝硬变、非典型增生到肝细胞癌， 二倍体细胞所占比率逐渐增加，四倍体 细胞所占比率逐渐下降，S期比率逐渐增加，且肝癌组与肝硬变、非典型增生组相比均有显 著差异(P<0.05，表1).正常组、肝硬变组DI值均为二倍体，非典型增生组1只为异倍 体，而肝癌组8只大鼠中4只为异倍体.表明FCM检测二倍体、四倍体、S期比率变化及异倍体 的多少可为肝癌早期诊断提供一客观指标.
, 百拇医药
表1 肝细胞DNA倍体分布及S期细胞百分比 (x±s,%)
| 分组 | n | 2N | 4N | S期 |
| 正常 | 8 | 71.0±2.2 | 15.0±1.4 | 8.4±1.4 |
| 肝硬变 | 8 | 75.0±2.8a | 14.0±1.1 | 10.0±1.0 |
| 非典型增生 | 8 | 76.0±4.4a | 12.0±2.4ab | 10.8±2.5a |
| 肝癌 | 8 | 80.0±3.9abc | 9.9±1.7abc | 11.3±1.8 a |
, http://www.100md.com
aP<0.05，vs 正常组；bP<0.05，vs 肝硬变组；cP<0.05，vs 非典型增生组.
3 讨论人类正常肝脏组织中含有10%～40%的多倍体细胞.肝干细胞是二倍体细胞形式存在.在慢性肝炎、肝硬变和肝癌中，具有干细胞样特性的二倍体细胞增多，多倍体细胞减少.该二倍体细胞具有较强而持久的增殖能力.因此二倍体细胞比率增加表示细胞分化减弱，增生能力加强.有人证实，二倍体细胞基因组进一步发展为癌的危险性大，其发生隐性突变也 相对较高，同时二倍体细胞抗癌基因的作用比多倍体细胞更易缺失[2]. Anti等 [3]对慢性肝炎、肝硬变和肝硬变基础上超声诊断有结节者行FCM分析，结果慢性肝炎、肝硬变二倍体比正常肝脏明显增加，在结节中尤为明显.可见二倍体细胞和多倍体细胞比率的改变在慢性肝病的 动态观察中具有一定的临床意义.DNA指数(DI)表示细胞DNA的相对含量.在正常细胞向癌细胞转变过程中，核酸代谢逐渐增强，DNA合成加速，染色体数目偏离正常，形态不规则.改变程度随着癌的演变及恶性程度递增而逐渐加重.这与肿瘤细胞学观察到的核深染、核仁增大，染色质增多、分布不均相一 致.这些异常改变必将反映在分子基础-DNA含量的变化上，在FCM中表现为异倍体细胞出现 .异倍体是肝癌的共同特征[4，5]，与生存期、肿瘤大小、肿瘤分级、血管浸润级 别、肝内转移及血清AFP水平相关[4].Roncalli等[6]发现一些非典型增生的肝细胞中也可出现异倍体细胞，这和本实验结果相符.因为肝硬变向肝癌演变过程中 ，各类病变间无绝对界限.本实验中各组病变的S期细胞所占的比率随着肝脏病变的严重程度而进行性升高.Anti等[3]在人类慢性肝炎、肝硬变及肝癌中得到类似结果.在细胞分裂周期中，S期最能反 映细胞的增殖活性， 其主要特征是DNA合成旺盛.正常及生长缓慢的组织，S期所占的比率 很小.在慢性肝炎、肝硬变、肝细胞非典型增生及肝癌中，随着细胞增殖，DNA合成加速，S 期比率增大，因此通过对S期测定可反映肝细胞的增殖程度.
, 百拇医药
4 参考文献1 Sakamoto M, Hirohashi S, Shimosato Y. Early stages of multistep hepatocarcinogenesis: adenomatous hyperplasia and
early hepatocellular carcinoma. Hum Pathol, 1991;2(2):172-178
2 Preston-Martin S, Pike MC, Poss PK, et al. Increased cell division as a cause of human cancer. Cancer Res, 1990;50(23):7415-7421
3 Anti M, Marra G, Kapaccini GL, et al. DNA ploidy pattern in human chronic liver diseases and hepatic nodular lesions. Flow cytometric
, 百拇医药
analysis on echo-guided needle liver biopsy. Cancer, 1994;75(2):281-288
4 Fujimoto J, Okamoto E, Yamanaka N, et al. Flow cytometric DNA analysis of hepatocellular carcinoma. Cancer, 1991;67(4):939-944
5 Lin HH, Shyn WC, Chen GL, et al. DNA measurements in chronic hepatitis cirrhosis and hepatocellular carcinoma.
Liver, 1990;10(5):313-318
6 Roncalli M, Borzio M, Brando B, et al. Abnormal DNA content in liver-cell dysplasia: A flow cytometric study.
Int J Cancer, 1987;44(3):204-207, 百拇医药(郭文栋 杨文 杜爱萍 左连富)