培养人胎肝细胞的形态与功能研究
第三军医大学西南医院全军传染病中心 重庆市 630038
国家自然科学基金项目(No.39370189)
王英杰，男，1960-10-03生，陕西省延安市人，汉族. 1985年延安大学医学系本科毕业，博士学位，讲师、主治医师，主要从事重型病毒性肝炎发病机理及治疗的研究，发表论文40篇.
项目负责人 王英杰，重庆市沙坪坝区高滩岩.
Tel: 023-65302135
收搞日期 1996-03-01 接受日期 1996-07-08
Morphology and function of cultured human fetal hepatocytes
, 百拇医药
Ying_Jie Wang, Yu_Ming Wang and Meng_Dong Li
Chinese PLA Centre of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third M ilitary Medical College, Chongqing 630038, China
Abstract
AIMS To study a simplified method of isolation and culture of human fetal hepatocytes.
METHODS Human fetal hepatocytes were isolated by a single two_stage perfusion method and cultured in a conditioned medium, their morphology and function were observed dynamically.
, 百拇医药
RESULTS The hepatocyte viability using the perfusion method was 95% approximately by trypan blue exclusion and the hepatocytes can be cultured fo r 2 weeks with preservation of normal morphologic appearance as well as producti on and secretion of proteins characteristic of fetal (alpha_fetoprotein, AFP) an d adult (albumin) life.
CONCLUSIONS The fetal hepatocytes isolated and cultured by the above method have a good function, which may be used as donors for hepatocyte transplantation.
, 百拇医药
Subject headings Liver/embryology; Liver/cytology; Cells, cultured; Cell separation; Cell transplantation
Wang YJ, Wang YM, Li MD. Morphology and function of cultured human fetal hepatocytes.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997;5(5):291-292
摘 要目的 探讨人胎肝细胞分离与培养的简易方法.
, 百拇医药
方法 采用体外两步灌流法分离人胎肝细胞，选择条件培养液加以培养， 并进行形态学和蛋白分泌功能的动态观察.
结果 用该法分离的肝细胞经台盼蓝拒染试验证实存活率在95%以上，培养 时间可达2周，并保持正常形态和良好的蛋白合成分泌功能.
结论 用酶灌流分离和条件培养的胎肝细胞性能良好，可用作肝细胞移植 的供体.
主题词 肝/胚胎学 肝/细胞学 细胞，培养的 细胞分离细胞移植
王英杰, 王宇明, 李梦东.培养人胎肝细胞的形态与功能研究.新消化病学杂志,1997;5(5):291-292
, 百拇医药
胎肝细胞移植早已用于严重肝病治疗，但因机械分离法对胎肝细胞损害较大，疗效有限. 为进一步探索分离培养胎肝细胞的实用方法，作者采用体外简易两步灌流法分离肝细胞，选择条件培养液对胎肝细胞进行培养，并对其形态学和蛋白合成功能进行了动态观察，报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 14周～29周龄水囊引产死胎儿由本院妇产科提供. 试剂Collagenase Ⅳ，EDTA，trypsin in hibitor, collagenⅠ和胰高血糖素购于Sigma公司，RPMI 1640培养液为Gibco产品，N_270 0 Nuaire CO2培养箱及培养瓶皿分别为Nuair和Nunc公司产品，其它试剂和物品购于华美 生物工程公司.
1.2 方法 采用体外灌流法分离肝细胞，操作简述如下：取水囊引产死胎儿置无菌托盘中，常规消毒后打开腹腔，分别自门静脉及下腔静脉灌注37℃前灌流液，至大部分肝叶呈灰白色，将肝 脏分叶切开，再以4ml/min灌注37℃ 0.05%的胶原酶液，待肝组织完全软化、肝包 膜下组织液化后钝性撕碎，37℃下振荡、消化15min，3层纱布过滤，50g×3min离心3次，收集肝细胞于1640培养液内. 以RPMI 1640培养液为基础，加入下列主 要成分，终浓度分别为：地塞米松10-9mol/L，胰岛素10-9mol/L，胰高血糖素10-9mol/L，L-谷氨酸300mg/L，卡那霉素30mg/L和人AB血清10%. 按2×105个细胞/ml接种培养，每24h更换1次培养液，2周后酌情终止培养. 采用Olympus倒置相差生物显微镜及全自动显微摄影装置对培养肝细胞进 行动态观察，按不同时相收集胎肝细胞培养上清测定蛋白含量，指标有总蛋白(双缩脲法)、 白蛋白 (溴甲酚绿法)和甲胎蛋白(羊抗人火箭免疫电泳放射自显影法).
, 百拇医药
2 结果
2.1 胎肝细胞的分离与培养 采用简滋逋饬讲焦次实验，每个胎肝可分离出4×(108-1010)个肝细胞，平均4×109个肝细胞. 按台盼蓝排除法测定，分离胎肝细胞的即时存活率均在95%以上，最高可达98%，在接种后72h，存活率仍达75%左右. 在条件培养液中可维持正常活性和50%以上的存活率至2周，与普通1640培养液培养相比，存活时间延长1周以上.
2.2 胎肝细胞的形态 用倒置相差生物显微镜对培养胎肝细胞进行连续动态观察显示：胎肝细胞接种后1h开始贴壁、伸展；24h后细胞由圆球形转变为多边形，细胞相互连接呈串状，大部分 肝细胞呈双核；2d～4d肝细胞间相互接触、满布培养瓶(图1)，此种状态可维持至9d～10d；10d以后肝细胞渐出现形态不规则，胞浆明显颗粒化，并有空泡形成、细胞边缘不清和部分细胞核消失等变化；培养至14d左右肝细胞逐渐从培养瓶壁脱落.
, 百拇医药
图1 培养3d胎肝细胞相互连接，双核细胞多见×200
图2 培养人胎肝细胞总蛋白及白蛋白的合成
图3 培养人胎肝细胞甲胎蛋白的合成
2.3 胎肝细胞功能 接种1d培养胎肝细胞合成白蛋白平均为(7.3±1.4)μg/L·d. 以后逐 渐增加，5d达高峰，平均(12.6±2.0)μg/L·d，并基本维持至10 d. 此后逐渐减少直至终止培养，但仍高于接种第1d的合成量. 总蛋白合成变化 与白蛋白大致相仿(图2). 培养胎肝细胞甲胎蛋白的合成于1d即处于较高水平，3d达高峰后急剧下降，培养结束时几乎测不出(图3).
, http://www.100md.com
3 讨论目前，国内用于严重肝病治疗的肝细胞移植仍主要采用胎肝细胞悬液注入法，且多为简单的机械研磨分离制成肝细胞匀浆后使用[1]. 由于机械方法使肝实质细胞普遍损伤， 收集的细胞活性下降或丧失；即使少数具有活力，注入机体后数小时也即迅速失活，故其疗 效显然有限. 国外学者长期致力于培养肝细胞植入方法治疗肝病的研究，但受来源与法律的 限制，有关胎肝细胞分离、培养的研究尚少. 作者改进Seglen[2]的方法，设计采用了体外简易两步灌流法分离肝细胞，不仅使胎肝细胞的存活率达到95%以上，而 且具有胶原酶消耗量大大降低，不需特殊装置、操作简便的优点，并避免混杂较多的间皮 细胞和红细胞，可望为肝细胞移植提供简便、实用、高效的肝细胞分离方法. 体外肝 细胞培养是较长时间贮存肝细胞旱耐揪吨华. 作者通过添加糖皮质激素、 胰高血糖素等多种成分构成条件培养液，可使胎肝细胞的培养存活时间达到2周. 动态观察其生物合成功能发现，白蛋白及总蛋白的合成能力可保持较高水平达10d左右. 反映肝细胞再生能力的甲胎蛋白的合成高峰在培养的第3天，第7天后逐渐下降，提示选择培养3- 7d的胎肝细胞作为肝细胞移植的供体，可因其具有良好的肝细胞活性和功能而发挥最 佳效果. 已知，正常肝细胞在解除接触抑制后，肝细胞失去表面调节因子(CSM)的抑制作用，通过系列反馈效应，产生肝细胞再生因子(HGF)和肝再 生刺激物质(HSS)，后者被认为是胎肝细胞悬液输注治疗肝衰竭的主要机理之一[4]. 故从胎肝细胞分离和培养过程中产生的大量HGF与HSS，不仅可促进胎肝细胞本身的存活和 增殖，而且可作为肝细胞悬液中的主要成分之一，与培养胎肝细胞一同输注，可能对大块肝 坏死起到更好的支持治疗作用.
, 百拇医药
4 参考文献1 陈从新，李景民，陈宗炳，等.胎肝细胞肝内移植治疗30例肝硬变疗效的随访.中华器官移植杂志，1995；16(2)：75-76
2 Seglen PO. Preparation of rat liver cells. Ⅱ. Effects of ions and chelators on tissue dispersion. Exp Cell Res, 1973;76(1):25-30
3 李锋.肝细胞移植的实验研究.中华器官移植杂志，1993；14(2)：95-96
4 Habibullah CM, Syed IH, Qamar A, et al. Human fetal hepatocyte transplantation in patients with fulminant hepatic failure.
Transplantation, 1994;58(8):951-952, 百拇医药(王英杰 王宇明 李梦东)
国家自然科学基金项目(No.39370189)
王英杰，男，1960-10-03生，陕西省延安市人，汉族. 1985年延安大学医学系本科毕业，博士学位，讲师、主治医师，主要从事重型病毒性肝炎发病机理及治疗的研究，发表论文40篇.
项目负责人 王英杰，重庆市沙坪坝区高滩岩.
Tel: 023-65302135
收搞日期 1996-03-01 接受日期 1996-07-08
Morphology and function of cultured human fetal hepatocytes
, 百拇医药
Ying_Jie Wang, Yu_Ming Wang and Meng_Dong Li
Chinese PLA Centre of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third M ilitary Medical College, Chongqing 630038, China
Abstract
AIMS To study a simplified method of isolation and culture of human fetal hepatocytes.
METHODS Human fetal hepatocytes were isolated by a single two_stage perfusion method and cultured in a conditioned medium, their morphology and function were observed dynamically.
, 百拇医药
RESULTS The hepatocyte viability using the perfusion method was 95% approximately by trypan blue exclusion and the hepatocytes can be cultured fo r 2 weeks with preservation of normal morphologic appearance as well as producti on and secretion of proteins characteristic of fetal (alpha_fetoprotein, AFP) an d adult (albumin) life.
CONCLUSIONS The fetal hepatocytes isolated and cultured by the above method have a good function, which may be used as donors for hepatocyte transplantation.
, 百拇医药
Subject headings Liver/embryology; Liver/cytology; Cells, cultured; Cell separation; Cell transplantation
Wang YJ, Wang YM, Li MD. Morphology and function of cultured human fetal hepatocytes.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997;5(5):291-292
摘 要目的 探讨人胎肝细胞分离与培养的简易方法.
, 百拇医药
方法 采用体外两步灌流法分离人胎肝细胞，选择条件培养液加以培养， 并进行形态学和蛋白分泌功能的动态观察.
结果 用该法分离的肝细胞经台盼蓝拒染试验证实存活率在95%以上，培养 时间可达2周，并保持正常形态和良好的蛋白合成分泌功能.
结论 用酶灌流分离和条件培养的胎肝细胞性能良好，可用作肝细胞移植 的供体.
主题词 肝/胚胎学 肝/细胞学 细胞，培养的 细胞分离细胞移植
王英杰, 王宇明, 李梦东.培养人胎肝细胞的形态与功能研究.新消化病学杂志,1997;5(5):291-292
, 百拇医药
胎肝细胞移植早已用于严重肝病治疗，但因机械分离法对胎肝细胞损害较大，疗效有限. 为进一步探索分离培养胎肝细胞的实用方法，作者采用体外简易两步灌流法分离肝细胞，选择条件培养液对胎肝细胞进行培养，并对其形态学和蛋白合成功能进行了动态观察，报道如下.
1 材料和方法
1.1 材料 14周～29周龄水囊引产死胎儿由本院妇产科提供. 试剂Collagenase Ⅳ，EDTA，trypsin in hibitor, collagenⅠ和胰高血糖素购于Sigma公司，RPMI 1640培养液为Gibco产品，N_270 0 Nuaire CO2培养箱及培养瓶皿分别为Nuair和Nunc公司产品，其它试剂和物品购于华美 生物工程公司.
1.2 方法 采用体外灌流法分离肝细胞，操作简述如下：取水囊引产死胎儿置无菌托盘中，常规消毒后打开腹腔，分别自门静脉及下腔静脉灌注37℃前灌流液，至大部分肝叶呈灰白色，将肝 脏分叶切开，再以4ml/min灌注37℃ 0.05%的胶原酶液，待肝组织完全软化、肝包 膜下组织液化后钝性撕碎，37℃下振荡、消化15min，3层纱布过滤，50g×3min离心3次，收集肝细胞于1640培养液内. 以RPMI 1640培养液为基础，加入下列主 要成分，终浓度分别为：地塞米松10-9mol/L，胰岛素10-9mol/L，胰高血糖素10-9mol/L，L-谷氨酸300mg/L，卡那霉素30mg/L和人AB血清10%. 按2×105个细胞/ml接种培养，每24h更换1次培养液，2周后酌情终止培养. 采用Olympus倒置相差生物显微镜及全自动显微摄影装置对培养肝细胞进 行动态观察，按不同时相收集胎肝细胞培养上清测定蛋白含量，指标有总蛋白(双缩脲法)、 白蛋白 (溴甲酚绿法)和甲胎蛋白(羊抗人火箭免疫电泳放射自显影法).
, 百拇医药
2 结果
2.1 胎肝细胞的分离与培养 采用简滋逋饬讲焦次实验，每个胎肝可分离出4×(108-1010)个肝细胞，平均4×109个肝细胞. 按台盼蓝排除法测定，分离胎肝细胞的即时存活率均在95%以上，最高可达98%，在接种后72h，存活率仍达75%左右. 在条件培养液中可维持正常活性和50%以上的存活率至2周，与普通1640培养液培养相比，存活时间延长1周以上.
2.2 胎肝细胞的形态 用倒置相差生物显微镜对培养胎肝细胞进行连续动态观察显示：胎肝细胞接种后1h开始贴壁、伸展；24h后细胞由圆球形转变为多边形，细胞相互连接呈串状，大部分 肝细胞呈双核；2d～4d肝细胞间相互接触、满布培养瓶(图1)，此种状态可维持至9d～10d；10d以后肝细胞渐出现形态不规则，胞浆明显颗粒化，并有空泡形成、细胞边缘不清和部分细胞核消失等变化；培养至14d左右肝细胞逐渐从培养瓶壁脱落.
, 百拇医药
图1 培养3d胎肝细胞相互连接，双核细胞多见×200
图2 培养人胎肝细胞总蛋白及白蛋白的合成
图3 培养人胎肝细胞甲胎蛋白的合成
2.3 胎肝细胞功能 接种1d培养胎肝细胞合成白蛋白平均为(7.3±1.4)μg/L·d. 以后逐 渐增加，5d达高峰，平均(12.6±2.0)μg/L·d，并基本维持至10 d. 此后逐渐减少直至终止培养，但仍高于接种第1d的合成量. 总蛋白合成变化 与白蛋白大致相仿(图2). 培养胎肝细胞甲胎蛋白的合成于1d即处于较高水平，3d达高峰后急剧下降，培养结束时几乎测不出(图3).
, http://www.100md.com
3 讨论目前，国内用于严重肝病治疗的肝细胞移植仍主要采用胎肝细胞悬液注入法，且多为简单的机械研磨分离制成肝细胞匀浆后使用[1]. 由于机械方法使肝实质细胞普遍损伤， 收集的细胞活性下降或丧失；即使少数具有活力，注入机体后数小时也即迅速失活，故其疗 效显然有限. 国外学者长期致力于培养肝细胞植入方法治疗肝病的研究，但受来源与法律的 限制，有关胎肝细胞分离、培养的研究尚少. 作者改进Seglen[2]的方法，设计采用了体外简易两步灌流法分离肝细胞，不仅使胎肝细胞的存活率达到95%以上，而 且具有胶原酶消耗量大大降低，不需特殊装置、操作简便的优点，并避免混杂较多的间皮 细胞和红细胞，可望为肝细胞移植提供简便、实用、高效的肝细胞分离方法. 体外肝 细胞培养是较长时间贮存肝细胞旱耐揪吨华. 作者通过添加糖皮质激素、 胰高血糖素等多种成分构成条件培养液，可使胎肝细胞的培养存活时间达到2周. 动态观察其生物合成功能发现，白蛋白及总蛋白的合成能力可保持较高水平达10d左右. 反映肝细胞再生能力的甲胎蛋白的合成高峰在培养的第3天，第7天后逐渐下降，提示选择培养3- 7d的胎肝细胞作为肝细胞移植的供体，可因其具有良好的肝细胞活性和功能而发挥最 佳效果. 已知，正常肝细胞在解除接触抑制后，肝细胞失去表面调节因子(CSM)的抑制作用，通过系列反馈效应，产生肝细胞再生因子(HGF)和肝再 生刺激物质(HSS)，后者被认为是胎肝细胞悬液输注治疗肝衰竭的主要机理之一[4]. 故从胎肝细胞分离和培养过程中产生的大量HGF与HSS，不仅可促进胎肝细胞本身的存活和 增殖，而且可作为肝细胞悬液中的主要成分之一，与培养胎肝细胞一同输注，可能对大块肝 坏死起到更好的支持治疗作用.
, 百拇医药
4 参考文献1 陈从新，李景民，陈宗炳，等.胎肝细胞肝内移植治疗30例肝硬变疗效的随访.中华器官移植杂志，1995；16(2)：75-76
2 Seglen PO. Preparation of rat liver cells. Ⅱ. Effects of ions and chelators on tissue dispersion. Exp Cell Res, 1973;76(1):25-30
3 李锋.肝细胞移植的实验研究.中华器官移植杂志，1993；14(2)：95-96
4 Habibullah CM, Syed IH, Qamar A, et al. Human fetal hepatocyte transplantation in patients with fulminant hepatic failure.
Transplantation, 1994;58(8):951-952, 百拇医药(王英杰 王宇明 李梦东)