HBV DNA不同基因区功能及其变异
云南省昆明市第三人民医院 650041项目负责人 庄林,云南省昆明市第三人民医院 650041收搞日期 1996-09-19 接受日期 1996-11-11
Subject headings Hepatitis B virus DNA, viral HBsAg Genes, viral Mutation
主题词 肝炎病毒，乙型 DNA，病毒 乙型，肝炎表面抗原 基因，病毒 突变
庄林,游晶,马永良.HBV DNA不同基因区功能及其变异.新消化病学杂志,1997;5(5):331-332
, 百拇医药
1 HBV DNA前S/S基因区的变异HBV基因组S基因区编码病毒外膜蛋白(HBsAg)，分为S区、前S1区和S2区，每个区域均有 起始密码(ATG)，而仅于S区羧基端有一个共同的终止密码，每个区域均有中和位点，具有高抗原性，和抗_HBs有高亲和力.前S2区的基因产物与HBV感染密切相关，其免疫原性较S蛋白强，可被机体的免疫系统所辩认，产生具有中和作用的前S2抗体.前S1区为高可变区，也具有免疫原性，并能增强前S2及S蛋白的免疫原性.因此S基因区序列相当重要，其变异可能会使产生的病毒变异株的免疫原性发生改变，从而逃避宿主的免疫系统，造成病毒的持续感染或重复感染.近年来，国外有许多关于HBV表面抗原基因发生突变而产生所谓免疫逃避突变体的报道[1-5]. 意大利、日本、赞比亚等国均从接受疫苗者分离出变异株，多数血清均有高水平的抗_HBs，可能为免疫压力所致，我国也从血清HBsAg及抗_HBs阳性患者分离出HBsAg区的变异株.S基因α肽段(AA124～147)是高度保守、有高度免疫原性的亚型共同表位，个别残基的变异，尤其是AA145的甘氨酸被精氨酸所替代，就足以改变其抗原反应和免疫应答[1].任红等[6]研究发现各种可能形成免疫逃避的S抗原变异体中包括144，142，141，126及145等，其中145位的甘氨酸由精氨酸替代变异为重要的免疫逃避突变体，它可逃避抗_HBs的中和保护作用，使变异的病毒具有感染性，从而造成患者的持续慢性感染.此外，还有研究[7]发现在HBsAg(-)肝炎检出α表位的紧前、AA122～124之间有2～3个残基的插入变异.已有研究表明特异性免疫治疗可诱发产生HBV变异株，而S基因区的变异会使变异株逃避宿主的免疫应答清除作用，导致病毒感染的持续存在.
, 百拇医药
2 前C/C基因区的变异C基因区是HBV基因组的高保守区，编码HBV的核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)，内含有2个框内转录起始密码子(ATGs)，被87bp的前C区分隔开，前C区和C区含有一个共同的终止密码子，如果翻译起始于C区的第1个起始密码子，则合成Mr17 000的HBeAg，如果翻译起始于第2个密码子，则合成Mr 21 000的HBcAg.在前C/C区的基因具有多种重要功能，表达HBV的核心蛋白及表达HBeAg蛋白，是病毒核酸的包装信号、调控RNA转录的启动区、调控RNA转录的加强子二区、也是直接重复末端、蛋白—DNA的结合部位，HBV C区基因组发生变异可影响HBV的复制及免疫原性，前C区变异可影响病毒的包装信号区的构形因而丧失包装病毒RNA的能力，仅有少数部位的变异可以不影响其功能.前C基因变异最常发生于该区第83位核苷酸(即HBV全基因组第1896位核苷酸)，绝大多数为点突变，由鸟嘌呤核苷酸(G)原位转变成腺嘌呤核苷酸(A)，使原来编码色氨酸的第28位密码子TGG转变成翻译终止密码子TAG，使HBeAg合成终止[8]，这也是最常见的HBV变异.该变异最先于1989年由Carman等[9]在地中海的抗_HBe(+)患者中发现.前C区终止密码变异主要在抗_HBe(+)的活动性肝病患者中检出，但也可在一部分HBeAg(+)患者中检出[10].这种点突变位置包括1896，1899，1909，1856，1898，1838，1846等位核苷酸，其中最重要的是第1896位的点突变，并产生翻译终止密码子，因而HBeAg不能产生.Carman等[11]还证实在抗_HBe(+)的中国患者中存在第15位密码子的点突变，这种突变与29位密码子的突变有关，但与第28位密码子的突变无关.C基因区AA48～60，84～101聚集变异在慢性进展性肝病中比较常见，其中97ATC→CTC替代最多，终28和L97是HBV变异的热点.目前报道HBV前C/C基因突变株的存在有日益广泛和增多的趋势，以地中海和远东地区多见，存在于各型HBV感染者中，而绝大部分(约40%)见于重型肝炎.该种突变株感染易使CHB活动性加剧和易引起暴发性乙型肝炎(FHB)的观点已为多数学者公认.国外学者[11-15]及国 内刘华瑞[16]，田琦琦[17]，骆抗先等[18]报告均提示前C区变异与肝病严重性相关，在FHB患者中，几乎全部均存在前C区变异，而在AHB患者中则罕见，但在日本的某些地区，这种突变株感染病情常较轻[10].最近Laskus等[19]研究认为前C区突变罕见于美国的FHB. 近年研究发现CHB患者HBeAg向HBeAb自然转换或干扰素治疗后HBe系统血清转换时，均可发现HBV前C突变.胡德昌等[20]提示干扰素治疗可能导致HBV前C突变，HBV得以继续存在.已有研究认为突变株感染与肝细胞癌的发生关系密切，由于基因突变使病毒逃避了免疫清除，使感染持续存在，长期持续的HBV感染促使癌变发生.
, 百拇医药
3 P基因区的变异P基因区(2307～1621位)最长，占整个基因组的75%，所编码的DNA聚合酶(DNA-P)为Mr 95 000的富于组氨酸的多肽.在双股DNA中，DNA-P位于短股3′端，此酶可使短股从该处起延长达到固定的5′端形成完整的双股DNA.DNA-P还同时具有逆转录的作用.HBV复制过程：病毒HBV脱去外膜进入宿主肝细胞核内，复制时首先以长股即L(-)为膜板合成2.4kb及2.1kb mRNA，并合成RNA前基因(+)，然后前基因(+)在胞浆中经DNA-P合成DNA(-)，同时RNA(+)即为RNase所分解，最后以DNA(-)为膜板合成DNA(+).因此，在HBV DNA的复制过程中，聚合酶基因产物有着极其重要的作用，P基因区变异可导致HBV DNA复制的改变或被阻断，HBV复制停止.Blum等从人的肝组织中克隆了复制缺陷的HBV变异株，在全病毒基因中测得众多的变异，其中P基因存在2798位A→C及2820位G→C的变异，由于变异的P基因产物导致前基因组RNA不能包装进核心颗粒，从而阻断病毒DNA的合成.复制的缺陷可被构建的全长野生型P基因反式补充.4 X基因区的变异X基因区编码具有转录反式激活功能的蛋白.研究发现X基因至少有两个功能区.X蛋白可反式激活HBV增强子和多个启动子，在转染细胞内促进S蛋白和C蛋白的表达和核心颗粒的形成.X基因区变异可使HBxAg合成障碍.HBV X区的第1825～1832位缺失变异，出现终止密码子，从而抑制X蛋白的转录活性和增强子Ⅱ及启动子的作用，使HBV DNA复制的表达下降，造成血清中各项HBV标志均阴性，但HBV DNA为阳性，表明存在有HBV感染.日本报道X区突变株在AHB中占25%，CHB中占5%.总之，由于HBV复制方式的一个最显著的特点是信使RNA中间体进行逆转录，这一过程因缺乏核对酶而容易发生错误，以致在HBV DNA序列内引起一些变异.HBV DNA 4个编码区均可能发生变异.S基因区变异可引起HBsAg亚型转变及血清HBsAg(-)HB；C基因区变异则与血清抗-HBc(-)HB有关；前C基因区变异与血清抗-HBe(+)而HBeAg(-)的HBV感染有关；P基因区变异可导致HBV复制停止；X基因区变异可使HBxAg合成障碍.由于某些选择机制，HBV前C基因区及S基因区特定位点突变株容易生存下来，并导致临床上出现各种不同的疾病谱和血清学表现.
, 百拇医药
5 参考文献1 Carman WF, Zanetti AR, Karayianuis R, et al. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus. Lancet, 1990;336(8700):325-328
2 Harrison TJ, Cheng JO, Zuckerman AJ, et al. Independent emergence of a vaccine -induced escape mutant of hepatitis B virus.
Hepatology, 1991;13(1):105-108
3 McMahon G, Ehnick PH, Monslafa ZA, et al. Genetic alternation in gene encoding the major HBsAg: DNA and immunological analysis
, http://www.100md.com
of recurrent HBsAg derived from monoclonal antibody treat liver transplant patients. Hepatology, 1992;15(5):757-766
4 Okamoto H. Mutation within the S gene of hepatitis B virus transmitted from mothers to babies immunized with hepatitis B immune
globulin and vaccine. Pediatr Res, 1992;32(3):264-270
5 Yamamoto M, Okamoto H, Mayumi A, et al. Naturally occurring escape mutant of hepatitis B virus with various mutants in the S gene
, 百拇医药
in carriers seropositive for antibody to hepatitis surface antigen. Virology, 1994;68(6):2671-2675
6 任红，Tim H. 乙型肝炎表面抗原“免疫逃避”突变体在哺乳动物细胞中的表达.肝脏病杂志，1994；2(3)：134-137
7 Hou JL, Karayianuis P, Luo KX, et al. Identification and sequencing of a new hepatitis B virus variant in HBsAg negative Chinese paid
blood and patients with liver disease. Hepatology, 1994;21(1):S72-80
, 百拇医药
8 Carman WF. Vaccine-associated mutants of hepatitis B virus. In: NishiokaK, SuZuki H, Mishiro S, eds. Viral hepatitis and liver disease.
Tokyo/Berlin/Heidenberg: Springer-Verlag, 1994:243-249
9 Carman WF, Jacyna MR, Hadziyannis S, et al. Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis
B infection. Lancet, 1989;2(8358):588-593
, 百拇医药
10 Okamoto H, Yotsumoto S, Akahane Y, et al. Hepatitis B viruses with precore region defects prevail in persistently infected hosts along
with seroconversion to the antibody against e antigen. Virology, 1990;64(3):1298-1302
11 Carman WF, Fagan EA, Hadziyannis S, et al. Association of a precore genomic variant of hepatitis B virus with fulminant hepatitis.
Hepatology,1991;14(2):219-223
, http://www.100md.com
12 Liang TJ, Hasegawa K, Rimon N, et al. Hepatitis B virus mutant associatedwith an epidemic of fulminant hepatitis. N Engl J Med,1991;324(24):1705-1709
13 Omata M, Ehata T, Yokosuka O, et al. Mutations in the precore region of hepatitis B virus DNA in patients with fulminant and
severe hepatitis. N Engl J Med, 1991;324(24):1699-1704
14 Kosaka Y, Takase K, Kojima M, et al. Fulminant hepatitis B: induction by hepatitis B virus mutants defective in the precore region
, http://www.100md.com
and incapable of encoding e antigen. Gastroenterology, 1991;100(4):1087-1094
15 Hasegawa K,Huang J, Wands JR, et al. Association of hepatitis B virus precore mutations with fulminant hepatitis B in Japan. Virology,1991;185(1):460-466
16 刘华瑞，王小飞，王绵蓉，等.乙肝病毒基因前C区突变株感染的检测及临床意义.肝脏病杂志，1994；2(3)：138-140
17 田琦琦，贾克明.我国乙型肝炎病毒前C区变异的动态观察.肝脏病杂志，1994；2(3)：166
18 骆抗先，候金林，梁炽森.乙型肝炎病毒感染及病毒变异.中华传染病杂志，1996；14(2)：101-104
, 百拇医药
19 Laskus T, Persing DH, Nowicki M, et al. Nucleotide sequence analysis of the pre-core region in patients with fulminant hepatitis B
in the USA. In: Nishioka K, ed. Viral hepatitis and liver disease. Tokyo/Berlin/New York: Springer-Verlag, 1994:265-269
20 胡德昌，李晓芳，熊思东，等.慢性乙型肝炎患者HBV前基因突变与干扰素关系的初步研究.肝脏病杂志，1994；2(3)：147-149, 百拇医药(庄林 游晶 马永良)
Subject headings Hepatitis B virus DNA, viral HBsAg Genes, viral Mutation
主题词 肝炎病毒，乙型 DNA，病毒 乙型，肝炎表面抗原 基因，病毒 突变
庄林,游晶,马永良.HBV DNA不同基因区功能及其变异.新消化病学杂志,1997;5(5):331-332
, 百拇医药
1 HBV DNA前S/S基因区的变异HBV基因组S基因区编码病毒外膜蛋白(HBsAg)，分为S区、前S1区和S2区，每个区域均有 起始密码(ATG)，而仅于S区羧基端有一个共同的终止密码，每个区域均有中和位点，具有高抗原性，和抗_HBs有高亲和力.前S2区的基因产物与HBV感染密切相关，其免疫原性较S蛋白强，可被机体的免疫系统所辩认，产生具有中和作用的前S2抗体.前S1区为高可变区，也具有免疫原性，并能增强前S2及S蛋白的免疫原性.因此S基因区序列相当重要，其变异可能会使产生的病毒变异株的免疫原性发生改变，从而逃避宿主的免疫系统，造成病毒的持续感染或重复感染.近年来，国外有许多关于HBV表面抗原基因发生突变而产生所谓免疫逃避突变体的报道[1-5]. 意大利、日本、赞比亚等国均从接受疫苗者分离出变异株，多数血清均有高水平的抗_HBs，可能为免疫压力所致，我国也从血清HBsAg及抗_HBs阳性患者分离出HBsAg区的变异株.S基因α肽段(AA124～147)是高度保守、有高度免疫原性的亚型共同表位，个别残基的变异，尤其是AA145的甘氨酸被精氨酸所替代，就足以改变其抗原反应和免疫应答[1].任红等[6]研究发现各种可能形成免疫逃避的S抗原变异体中包括144，142，141，126及145等，其中145位的甘氨酸由精氨酸替代变异为重要的免疫逃避突变体，它可逃避抗_HBs的中和保护作用，使变异的病毒具有感染性，从而造成患者的持续慢性感染.此外，还有研究[7]发现在HBsAg(-)肝炎检出α表位的紧前、AA122～124之间有2～3个残基的插入变异.已有研究表明特异性免疫治疗可诱发产生HBV变异株，而S基因区的变异会使变异株逃避宿主的免疫应答清除作用，导致病毒感染的持续存在.
, 百拇医药
2 前C/C基因区的变异C基因区是HBV基因组的高保守区，编码HBV的核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)，内含有2个框内转录起始密码子(ATGs)，被87bp的前C区分隔开，前C区和C区含有一个共同的终止密码子，如果翻译起始于C区的第1个起始密码子，则合成Mr17 000的HBeAg，如果翻译起始于第2个密码子，则合成Mr 21 000的HBcAg.在前C/C区的基因具有多种重要功能，表达HBV的核心蛋白及表达HBeAg蛋白，是病毒核酸的包装信号、调控RNA转录的启动区、调控RNA转录的加强子二区、也是直接重复末端、蛋白—DNA的结合部位，HBV C区基因组发生变异可影响HBV的复制及免疫原性，前C区变异可影响病毒的包装信号区的构形因而丧失包装病毒RNA的能力，仅有少数部位的变异可以不影响其功能.前C基因变异最常发生于该区第83位核苷酸(即HBV全基因组第1896位核苷酸)，绝大多数为点突变，由鸟嘌呤核苷酸(G)原位转变成腺嘌呤核苷酸(A)，使原来编码色氨酸的第28位密码子TGG转变成翻译终止密码子TAG，使HBeAg合成终止[8]，这也是最常见的HBV变异.该变异最先于1989年由Carman等[9]在地中海的抗_HBe(+)患者中发现.前C区终止密码变异主要在抗_HBe(+)的活动性肝病患者中检出，但也可在一部分HBeAg(+)患者中检出[10].这种点突变位置包括1896，1899，1909，1856，1898，1838，1846等位核苷酸，其中最重要的是第1896位的点突变，并产生翻译终止密码子，因而HBeAg不能产生.Carman等[11]还证实在抗_HBe(+)的中国患者中存在第15位密码子的点突变，这种突变与29位密码子的突变有关，但与第28位密码子的突变无关.C基因区AA48～60，84～101聚集变异在慢性进展性肝病中比较常见，其中97ATC→CTC替代最多，终28和L97是HBV变异的热点.目前报道HBV前C/C基因突变株的存在有日益广泛和增多的趋势，以地中海和远东地区多见，存在于各型HBV感染者中，而绝大部分(约40%)见于重型肝炎.该种突变株感染易使CHB活动性加剧和易引起暴发性乙型肝炎(FHB)的观点已为多数学者公认.国外学者[11-15]及国 内刘华瑞[16]，田琦琦[17]，骆抗先等[18]报告均提示前C区变异与肝病严重性相关，在FHB患者中，几乎全部均存在前C区变异，而在AHB患者中则罕见，但在日本的某些地区，这种突变株感染病情常较轻[10].最近Laskus等[19]研究认为前C区突变罕见于美国的FHB. 近年研究发现CHB患者HBeAg向HBeAb自然转换或干扰素治疗后HBe系统血清转换时，均可发现HBV前C突变.胡德昌等[20]提示干扰素治疗可能导致HBV前C突变，HBV得以继续存在.已有研究认为突变株感染与肝细胞癌的发生关系密切，由于基因突变使病毒逃避了免疫清除，使感染持续存在，长期持续的HBV感染促使癌变发生.
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3 P基因区的变异P基因区(2307～1621位)最长，占整个基因组的75%，所编码的DNA聚合酶(DNA-P)为Mr 95 000的富于组氨酸的多肽.在双股DNA中，DNA-P位于短股3′端，此酶可使短股从该处起延长达到固定的5′端形成完整的双股DNA.DNA-P还同时具有逆转录的作用.HBV复制过程：病毒HBV脱去外膜进入宿主肝细胞核内，复制时首先以长股即L(-)为膜板合成2.4kb及2.1kb mRNA，并合成RNA前基因(+)，然后前基因(+)在胞浆中经DNA-P合成DNA(-)，同时RNA(+)即为RNase所分解，最后以DNA(-)为膜板合成DNA(+).因此，在HBV DNA的复制过程中，聚合酶基因产物有着极其重要的作用，P基因区变异可导致HBV DNA复制的改变或被阻断，HBV复制停止.Blum等从人的肝组织中克隆了复制缺陷的HBV变异株，在全病毒基因中测得众多的变异，其中P基因存在2798位A→C及2820位G→C的变异，由于变异的P基因产物导致前基因组RNA不能包装进核心颗粒，从而阻断病毒DNA的合成.复制的缺陷可被构建的全长野生型P基因反式补充.4 X基因区的变异X基因区编码具有转录反式激活功能的蛋白.研究发现X基因至少有两个功能区.X蛋白可反式激活HBV增强子和多个启动子，在转染细胞内促进S蛋白和C蛋白的表达和核心颗粒的形成.X基因区变异可使HBxAg合成障碍.HBV X区的第1825～1832位缺失变异，出现终止密码子，从而抑制X蛋白的转录活性和增强子Ⅱ及启动子的作用，使HBV DNA复制的表达下降，造成血清中各项HBV标志均阴性，但HBV DNA为阳性，表明存在有HBV感染.日本报道X区突变株在AHB中占25%，CHB中占5%.总之，由于HBV复制方式的一个最显著的特点是信使RNA中间体进行逆转录，这一过程因缺乏核对酶而容易发生错误，以致在HBV DNA序列内引起一些变异.HBV DNA 4个编码区均可能发生变异.S基因区变异可引起HBsAg亚型转变及血清HBsAg(-)HB；C基因区变异则与血清抗-HBc(-)HB有关；前C基因区变异与血清抗-HBe(+)而HBeAg(-)的HBV感染有关；P基因区变异可导致HBV复制停止；X基因区变异可使HBxAg合成障碍.由于某些选择机制，HBV前C基因区及S基因区特定位点突变株容易生存下来，并导致临床上出现各种不同的疾病谱和血清学表现.
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5 参考文献1 Carman WF, Zanetti AR, Karayianuis R, et al. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus. Lancet, 1990;336(8700):325-328
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of recurrent HBsAg derived from monoclonal antibody treat liver transplant patients. Hepatology, 1992;15(5):757-766
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globulin and vaccine. Pediatr Res, 1992;32(3):264-270
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in carriers seropositive for antibody to hepatitis surface antigen. Virology, 1994;68(6):2671-2675
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8 Carman WF. Vaccine-associated mutants of hepatitis B virus. In: NishiokaK, SuZuki H, Mishiro S, eds. Viral hepatitis and liver disease.
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9 Carman WF, Jacyna MR, Hadziyannis S, et al. Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis
B infection. Lancet, 1989;2(8358):588-593
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10 Okamoto H, Yotsumoto S, Akahane Y, et al. Hepatitis B viruses with precore region defects prevail in persistently infected hosts along
with seroconversion to the antibody against e antigen. Virology, 1990;64(3):1298-1302
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severe hepatitis. N Engl J Med, 1991;324(24):1699-1704
14 Kosaka Y, Takase K, Kojima M, et al. Fulminant hepatitis B: induction by hepatitis B virus mutants defective in the precore region
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15 Hasegawa K,Huang J, Wands JR, et al. Association of hepatitis B virus precore mutations with fulminant hepatitis B in Japan. Virology,1991;185(1):460-466
16 刘华瑞，王小飞，王绵蓉，等.乙肝病毒基因前C区突变株感染的检测及临床意义.肝脏病杂志，1994；2(3)：138-140
17 田琦琦，贾克明.我国乙型肝炎病毒前C区变异的动态观察.肝脏病杂志，1994；2(3)：166
18 骆抗先，候金林，梁炽森.乙型肝炎病毒感染及病毒变异.中华传染病杂志，1996；14(2)：101-104
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19 Laskus T, Persing DH, Nowicki M, et al. Nucleotide sequence analysis of the pre-core region in patients with fulminant hepatitis B
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20 胡德昌，李晓芳，熊思东，等.慢性乙型肝炎患者HBV前基因突变与干扰素关系的初步研究.肝脏病杂志，1994；2(3)：147-149, 百拇医药(庄林 游晶 马永良)