雷抑素对大鼠移植肝Kupffer细胞的影响
1解放军81医院肿瘤外科 江苏省南京市210002
2长海医院肝胆外科研究所 上海市 200433
王轩，男，1965-05-12生，江苏省扬州市人，汉族. 1986年毕业于上海第二军医大学医疗系，肝胆外科硕士，主治医师，主要从事肝胆及消化道肿瘤的外科治疗和研究，发表论文9篇，文献综述2篇.
项目负责人 王轩,江苏省南京市扬公井34标34号.
Tel: 025-6648090-533.收搞日期 1996-09-14 接受日期 1996-10-23
Effect of leflunomide pretreatment on Kupffer cells in transplanted rat liver
, 百拇医药
Xuan Wang1, Ja-Mei Yang2, Guan-Fu Yin1, Zhen-Chan Xu1, Yi-Qun Yan2 and Meng-Chao Wu2
1Department of Surgical Oncology, Chinese PLA 81 Hospital, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
2Hepatobiliary Research Institute, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China
Abstract
, 百拇医药 AIM To study the effect of leflunomide on rat liver Kupffer cells before liver transplantion.
METHODS SD rats were used as donors and recipients to build ort hotopic liver transplantation models. The recipient rats were pretreated by a 3 -day course of 1% carboxymethylcellulose (1ml/day, PO) in control group or leflunomide (10mg/kg·d, PO) in treatment group. Blood and liver samples were taken at 1, 2, 3 and 24 hours respectively after transplantation. Levels of TNF and ALT in serum, and MDA in liver tissues were measured, ultrastructure of liver and one-week survival rates observed.
, http://www.100md.com
RESULTS The levels of serum TNF (5.3kU/L±0.41kU/L) and MDA in liver tissues (484.6nmol/g±23.6nmol/g) increased rapidly, and TNF expression was strongly positive 3 hours after transplantation in control group. The Lefpretreated recipients had little changes in serum TNF levels (0.9kU/L±0.11kU/L) and MDA in liver tissues (361.8nmol/g±15.4nmol/g), and TNF expression was negative, with a significant difference between the two groups (P<0.01). The Kupffer cells from controls were activated in appearance, while those from pretreated group showed no evidence of activation under electron microscope. Oneweek survival rates for control and treatment groups were 0% and 60%, respectively.
, 百拇医药
CONCLUSION Leflunomide pretreatment can suppress TNF and O2 production and the activation of Kupffer cells in liver transplantation model, thus minimizing cold ischemic reperfusion injury.
Subject headings Isoxazoles/pharmacology; Liver transplantation; Kupffer cells/drug effects
Wang X, Yang JM, Yin GF, Xu ZC,Yan YQ,Wu MC.Effect of leflunomide pretreatment on Kupffer cells in transplanted rat liver.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1997;5(8):487-488
, 百拇医药
摘 要目的 探讨肝移植术前应用雷抑素对大鼠肝Kupffer细胞的影响.
方法 以SD大鼠为供受体建立原位肝移植模型. 受体移植术前3d连续口服1%羧甲基纤维素1ml/d(对照组)或雷抑素10mg/kg·d(用药组). 分别于术后1，2，3，24h采血并取肝组织，检测血清TNF，ALT及肝MDA水平，观察肝超微结构及大鼠1周存活率变化.
结果 对照组移植术后3h血清TNF(5.3kU/L±0.41kU/L),肝MDA(484.6nmol/g±23.6nmol/g)显著增加，TNF表达呈强阳性；而且药组TNF(0.9kU/L±0.11kU/L)肝MDA(361.8nmol/g±15.4nmol/g)无明显变化，TNF表达阴性，两者相差显著P<0.01). 电镜检查，对照组肝Kupffer细胞呈活化表现，而用药组肝Kupffer细胞呈非活化状态. 对照及用药组术后1周存活率分别为0%和60%.
, http://www.100md.com
结论 术前应用雷抑素可抑制移植肝TNF和O2的产生，抑制Kupffer细胞活化，以减轻肝冷缺血再灌注损伤.
主题词 异恶唑类/药理学; 肝移植; 枯否细胞/药物作用
王轩,杨甲梅,殷广福,许正昌,严以群,吴孟超.雷抑素对大鼠移植肝Kupffer细胞的影响.新消化病学杂志, 1997;5(8):487-488
近年来，尽管肝移植已取得巨大进展，但缺血再灌注损伤仍是困绕临床肝移植发展的主要障碍之一. 在介导缺血再灌注损伤的诸多因素中，肝Kupffer细胞的作用愈来愈受到人们的重视. 活化的Kupffer细胞除可释放活性氧外，还可释放蛋白酶、TNF等多种细胞毒因子[1]. 我们利用大鼠原位肝移植模型(orthotopic liver transplantation, OLT)，探讨肝移植术前应用免疫抑制剂雷抑素(leflunomide, Lef)对大鼠肝Kupffer细胞的影响.
, http://www.100md.com
1 材料和方法1.1 材料 雄性健康SD大鼠68只，体重180g～200g，随机配对为供受体，并分为4组(A-D). A，B组大鼠5对，用于观察存活期；C，D组大鼠12对，用于取材. Lef溶于1%羧甲基纤维素中，A，C为对照组，受体术前3d连续口服1%羧甲基纤维素1ml/d；B，D为用药组，受体术前3d连续口服Lef 10mg/kg·d. 供肝取出后，均置于4℃平衡液中保存6h再植入受体. 大鼠原位肝移植操作步骤参照改良Kamada法[2，3].
1.2 方法 对照及用药组于术后1，2h经大鼠尾静脉采血0.5ml，每只大鼠采血不超过1次. 在术后3，24h采血后各处死7只和5只取肝组织. 血样离心后(4℃， 3000r/min,5min)，取上清置-80℃冰箱保存待测. 血清ALT活性用Abbottcc-Ⅰ型生化自动分析仪测定. 血清TNF活性采用以L929细胞为靶细胞的结晶紫法[4]. 免疫组化ABC法测定TNF在肝组织中的表达. 肝组织脂质过氧化产物丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法[5]. 取再灌注后3h各组肝右叶固定部位肝组织以4%戊二醛固定，行电镜检查.统计学处理 资料均数比较用t检验.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 血清TNF、ALT及肝MDA 见表1.对照组5例大鼠均于术后1d～ 2d内死于肝功能衰竭.用药组有3例存活超过7d，1例术后5d死于胆漏，1例术后2d死 于肝上腔静脉漏血. 1周存活率分别为0%和60%.
2.2 Kupffer细胞 再灌注后3h，对照组肝脏TNF免疫组化可见肝Kupffer细胞呈多角形或梭形，染色强阳性，细胞内沉积有棕色颗粒，散在分布于肝窦中. 用药组几乎见不到阳性细胞. 对照组电镜下Kupffer细胞胞体变圆钝，内空泡化，有多数颗粒形成，细胞表面有许多皱褶. 用药组Kupffer细胞表面平滑，无皱褶，呈偏平状，胞内很少有颗粒或空泡形成.
表1 肝移植术后血清TNF，ALT及肝MDA变化 (x±s)
, http://www.100md.com
aP<0.001，vs 对照组；cP<0.01，eP<0.01，vs 对照组.
3 讨论肝Kupffer细胞在缺血再灌注的初期可因补体系统的激活而激活，还可因肝缺血本身所致钙超载或吞噬作用的增强及内毒素(LPS)而自身活化. 由肝缺血直接或经由Kupffer细胞激 活引起的肝细胞损伤又可释放大量蛋白激活补体，进一步刺激肝Kupffer细胞的活化. 因此 ，肝Kupffer细胞活化是临床肝移植术后一个普遍存在的现象. Kupffer细胞在激活时，可释放包括IL-1，IL-6,TNF-a等多种细胞因子，并诱导肝细胞由左旋精氨酸合成具有高度活性的NO，产生活性极强的超氧氮阴离子和羟自由基，对细胞产生毒性作用[1]. 因此，抑制肝Kupffer细胞活化对防止和减轻缺血再灌注损伤具有重要意义.Lef作为一种新型强效免疫抑制剂，具有抗炎、拮抗包括IL-2,IL-6,TNF等多种细胞因子活性 的特点[6]. 实验表明，Lef对大鼠肝Kupffer细胞的活化有明显的抑制作用. 在本 组实验中，对照组大鼠肝移植术后3h, Kupffer细胞呈典型活化表现. 其活化指标TNF，无 论在血浆还是在局部均有显著增加. 反映氧自由基及脂质过氧化活力的MDA水平亦有明显升 高，证实肝移植术后肝Kupffer细胞确实存在活化现象. 相比之下，用药组肝Kupffer细胞在 再灌注后3h则呈梭形，胞膜表面光滑，内无颗粒或空泡形成. 血浆或局部肝组织TNF表达 与移植术前相比均无明显变化，MDA也几乎无改变，说明用药组肝Kupffer细胞在再灌注后处于非活化状态，即Lef抑制了肝Kupffer细胞的活化. 这也与对照组大鼠1周存活率为0%，用药组为60%的结果相一致.总之，肝移植术前受体应用Lef，对大鼠肝Kupffer细胞活化有明显抑制作用. Lef通过抑制 肝Kupffer细胞活化，抑制活性氧、脂质过氧化物和TNF等细胞毒因子的产生，发挥其减轻肝缺血再灌注损伤、保护移植肝功能的作用.
, 百拇医药
4 参考文献1 Clavien PA, Harvey PRC, Strasberg SM. Preservation and reperfusion injuries in liver allograft. Transplantation, 1992;53(5):957-978
2 Kamada N, Calne RY. Orthotopic liver transplantation in the rat: Techniques using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage.
Transplantation, 1979;28(1):47-51
3 严以群，杨甲梅，王轩，等. 大鼠减体积性肝移植模型. 中华器官移植杂志，1996；17(1)：55-58
, http://www.100md.com
4 Ruff M, Gifford GE. Rabbit tumor necrosis factor: mechanism of action. Infect Immun, 1981;31(3):380-385
5 Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animals tissue by thiobarbituric acid reaction.
Anal Biochem, 1979;95(2):351-353
6 王轩(综述). 免疫抑制剂雷抑素研究进展. 国外医学创伤与外科基本问题分册，1996；17(4)：204-207, 百拇医药
2长海医院肝胆外科研究所 上海市 200433
王轩，男，1965-05-12生，江苏省扬州市人，汉族. 1986年毕业于上海第二军医大学医疗系，肝胆外科硕士，主治医师，主要从事肝胆及消化道肿瘤的外科治疗和研究，发表论文9篇，文献综述2篇.
项目负责人 王轩,江苏省南京市扬公井34标34号.
Tel: 025-6648090-533.收搞日期 1996-09-14 接受日期 1996-10-23
Effect of leflunomide pretreatment on Kupffer cells in transplanted rat liver
, 百拇医药
Xuan Wang1, Ja-Mei Yang2, Guan-Fu Yin1, Zhen-Chan Xu1, Yi-Qun Yan2 and Meng-Chao Wu2
1Department of Surgical Oncology, Chinese PLA 81 Hospital, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
2Hepatobiliary Research Institute, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China
Abstract
, 百拇医药 AIM To study the effect of leflunomide on rat liver Kupffer cells before liver transplantion.
METHODS SD rats were used as donors and recipients to build ort hotopic liver transplantation models. The recipient rats were pretreated by a 3 -day course of 1% carboxymethylcellulose (1ml/day, PO) in control group or leflunomide (10mg/kg·d, PO) in treatment group. Blood and liver samples were taken at 1, 2, 3 and 24 hours respectively after transplantation. Levels of TNF and ALT in serum, and MDA in liver tissues were measured, ultrastructure of liver and one-week survival rates observed.
, http://www.100md.com
RESULTS The levels of serum TNF (5.3kU/L±0.41kU/L) and MDA in liver tissues (484.6nmol/g±23.6nmol/g) increased rapidly, and TNF expression was strongly positive 3 hours after transplantation in control group. The Lefpretreated recipients had little changes in serum TNF levels (0.9kU/L±0.11kU/L) and MDA in liver tissues (361.8nmol/g±15.4nmol/g), and TNF expression was negative, with a significant difference between the two groups (P<0.01). The Kupffer cells from controls were activated in appearance, while those from pretreated group showed no evidence of activation under electron microscope. Oneweek survival rates for control and treatment groups were 0% and 60%, respectively.
, 百拇医药
CONCLUSION Leflunomide pretreatment can suppress TNF and O2 production and the activation of Kupffer cells in liver transplantation model, thus minimizing cold ischemic reperfusion injury.
Subject headings Isoxazoles/pharmacology; Liver transplantation; Kupffer cells/drug effects
Wang X, Yang JM, Yin GF, Xu ZC,Yan YQ,Wu MC.Effect of leflunomide pretreatment on Kupffer cells in transplanted rat liver.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1997;5(8):487-488
, 百拇医药
摘 要目的 探讨肝移植术前应用雷抑素对大鼠肝Kupffer细胞的影响.
方法 以SD大鼠为供受体建立原位肝移植模型. 受体移植术前3d连续口服1%羧甲基纤维素1ml/d(对照组)或雷抑素10mg/kg·d(用药组). 分别于术后1，2，3，24h采血并取肝组织，检测血清TNF，ALT及肝MDA水平，观察肝超微结构及大鼠1周存活率变化.
结果 对照组移植术后3h血清TNF(5.3kU/L±0.41kU/L),肝MDA(484.6nmol/g±23.6nmol/g)显著增加，TNF表达呈强阳性；而且药组TNF(0.9kU/L±0.11kU/L)肝MDA(361.8nmol/g±15.4nmol/g)无明显变化，TNF表达阴性，两者相差显著P<0.01). 电镜检查，对照组肝Kupffer细胞呈活化表现，而用药组肝Kupffer细胞呈非活化状态. 对照及用药组术后1周存活率分别为0%和60%.
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结论 术前应用雷抑素可抑制移植肝TNF和O2的产生，抑制Kupffer细胞活化，以减轻肝冷缺血再灌注损伤.
主题词 异恶唑类/药理学; 肝移植; 枯否细胞/药物作用
王轩,杨甲梅,殷广福,许正昌,严以群,吴孟超.雷抑素对大鼠移植肝Kupffer细胞的影响.新消化病学杂志, 1997;5(8):487-488
近年来，尽管肝移植已取得巨大进展，但缺血再灌注损伤仍是困绕临床肝移植发展的主要障碍之一. 在介导缺血再灌注损伤的诸多因素中，肝Kupffer细胞的作用愈来愈受到人们的重视. 活化的Kupffer细胞除可释放活性氧外，还可释放蛋白酶、TNF等多种细胞毒因子[1]. 我们利用大鼠原位肝移植模型(orthotopic liver transplantation, OLT)，探讨肝移植术前应用免疫抑制剂雷抑素(leflunomide, Lef)对大鼠肝Kupffer细胞的影响.
, http://www.100md.com
1 材料和方法1.1 材料 雄性健康SD大鼠68只，体重180g～200g，随机配对为供受体，并分为4组(A-D). A，B组大鼠5对，用于观察存活期；C，D组大鼠12对，用于取材. Lef溶于1%羧甲基纤维素中，A，C为对照组，受体术前3d连续口服1%羧甲基纤维素1ml/d；B，D为用药组，受体术前3d连续口服Lef 10mg/kg·d. 供肝取出后，均置于4℃平衡液中保存6h再植入受体. 大鼠原位肝移植操作步骤参照改良Kamada法[2，3].
1.2 方法 对照及用药组于术后1，2h经大鼠尾静脉采血0.5ml，每只大鼠采血不超过1次. 在术后3，24h采血后各处死7只和5只取肝组织. 血样离心后(4℃， 3000r/min,5min)，取上清置-80℃冰箱保存待测. 血清ALT活性用Abbottcc-Ⅰ型生化自动分析仪测定. 血清TNF活性采用以L929细胞为靶细胞的结晶紫法[4]. 免疫组化ABC法测定TNF在肝组织中的表达. 肝组织脂质过氧化产物丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法[5]. 取再灌注后3h各组肝右叶固定部位肝组织以4%戊二醛固定，行电镜检查.统计学处理 资料均数比较用t检验.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 血清TNF、ALT及肝MDA 见表1.对照组5例大鼠均于术后1d～ 2d内死于肝功能衰竭.用药组有3例存活超过7d，1例术后5d死于胆漏，1例术后2d死 于肝上腔静脉漏血. 1周存活率分别为0%和60%.
2.2 Kupffer细胞 再灌注后3h，对照组肝脏TNF免疫组化可见肝Kupffer细胞呈多角形或梭形，染色强阳性，细胞内沉积有棕色颗粒，散在分布于肝窦中. 用药组几乎见不到阳性细胞. 对照组电镜下Kupffer细胞胞体变圆钝，内空泡化，有多数颗粒形成，细胞表面有许多皱褶. 用药组Kupffer细胞表面平滑，无皱褶，呈偏平状，胞内很少有颗粒或空泡形成.
表1 肝移植术后血清TNF，ALT及肝MDA变化 (x±s)
| n | TNF(kU/L) | ALT(u/L) | MDA(nmol/g) 3h | |||||
| 1h | 2h | 3h | 24h | 3h | 24h | |||
| 对照组 | 7 | 5.7±0.62 | 7.9±0.64 | 5.3±0.41 | 5.8±0.72 | 318.66±58.42 | 356.27±34.58 | 484.6±23.6 |
| 用药组 | 7 | 1.1±0.14a | 1.8±0.19a | 0.9±0.11a | 0.76±0.08a | 227.65±24.13c | 234.16±40.72c | 361.8±15.4e |
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aP<0.001，vs 对照组；cP<0.01，eP<0.01，vs 对照组.
3 讨论肝Kupffer细胞在缺血再灌注的初期可因补体系统的激活而激活，还可因肝缺血本身所致钙超载或吞噬作用的增强及内毒素(LPS)而自身活化. 由肝缺血直接或经由Kupffer细胞激 活引起的肝细胞损伤又可释放大量蛋白激活补体，进一步刺激肝Kupffer细胞的活化. 因此 ，肝Kupffer细胞活化是临床肝移植术后一个普遍存在的现象. Kupffer细胞在激活时，可释放包括IL-1，IL-6,TNF-a等多种细胞因子，并诱导肝细胞由左旋精氨酸合成具有高度活性的NO，产生活性极强的超氧氮阴离子和羟自由基，对细胞产生毒性作用[1]. 因此，抑制肝Kupffer细胞活化对防止和减轻缺血再灌注损伤具有重要意义.Lef作为一种新型强效免疫抑制剂，具有抗炎、拮抗包括IL-2,IL-6,TNF等多种细胞因子活性 的特点[6]. 实验表明，Lef对大鼠肝Kupffer细胞的活化有明显的抑制作用. 在本 组实验中，对照组大鼠肝移植术后3h, Kupffer细胞呈典型活化表现. 其活化指标TNF，无 论在血浆还是在局部均有显著增加. 反映氧自由基及脂质过氧化活力的MDA水平亦有明显升 高，证实肝移植术后肝Kupffer细胞确实存在活化现象. 相比之下，用药组肝Kupffer细胞在 再灌注后3h则呈梭形，胞膜表面光滑，内无颗粒或空泡形成. 血浆或局部肝组织TNF表达 与移植术前相比均无明显变化，MDA也几乎无改变，说明用药组肝Kupffer细胞在再灌注后处于非活化状态，即Lef抑制了肝Kupffer细胞的活化. 这也与对照组大鼠1周存活率为0%，用药组为60%的结果相一致.总之，肝移植术前受体应用Lef，对大鼠肝Kupffer细胞活化有明显抑制作用. Lef通过抑制 肝Kupffer细胞活化，抑制活性氧、脂质过氧化物和TNF等细胞毒因子的产生，发挥其减轻肝缺血再灌注损伤、保护移植肝功能的作用.
, 百拇医药
4 参考文献1 Clavien PA, Harvey PRC, Strasberg SM. Preservation and reperfusion injuries in liver allograft. Transplantation, 1992;53(5):957-978
2 Kamada N, Calne RY. Orthotopic liver transplantation in the rat: Techniques using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage.
Transplantation, 1979;28(1):47-51
3 严以群，杨甲梅，王轩，等. 大鼠减体积性肝移植模型. 中华器官移植杂志，1996；17(1)：55-58
, http://www.100md.com
4 Ruff M, Gifford GE. Rabbit tumor necrosis factor: mechanism of action. Infect Immun, 1981;31(3):380-385
5 Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animals tissue by thiobarbituric acid reaction.
Anal Biochem, 1979;95(2):351-353
6 王轩(综述). 免疫抑制剂雷抑素研究进展. 国外医学创伤与外科基本问题分册，1996；17(4)：204-207, 百拇医药