HGF对VP-16诱导肝癌细胞凋亡及bcl-2基因表达的影响
第二军医大学 1长征医院消化科 2基础部病理解剖教研室
3东方肝胆外科医院 上海市 200003
杨秀疆，男，1960-10-05生，重庆市人，汉族. 1984年重庆中国人民解放军第三军医大学毕业，第二军医大学长征医院消化内科博士研究生，发表论文12篇.
项目负责人 杨秀疆,上海市凤阳路415号第二军医大学长征医院消化内科.
Tel: 021-63275997-362
收搞日期 1996-08-16 接受日期 1996-11-01
Effect of HGF on etoposideinduced apoptosis and bcl-2 gene expression for hepatocellular carcinoma
, 百拇医药
Xiu-Jiang Yang1, Shi-Bao Chen1, Jian-Zhong Bao2, Yi Wang3, Zhong-Bing Zhang1, Xian-Kan Zhang1 and Xing-Rong Zhang11Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital
2Department of Pathology, 3Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Abstract
, 百拇医药
AIM To study the hepatocyte growth factor (HGF) in etoposide (VP-16)-induced apoptosis and bcl-2 gene.
METHODS Apoptosis (hepatic cancer cell line, SMMC-7721) was in duced by VP-16 (0.5, 1, 5μM/L), HGF (10, 20, 30μg/L)+VP-16 (0.5μM/L) and physiological salt solution served as control. The morphology of apoptosis was o bserved by HE staining. By Western blot, the expressions of bcl2 and PCNA prot ein were analyzed in induced apoptosis.
, 百拇医药
RESULTS Apotosis was found after 5h, 7 days and 72h in VP-16 5μM/L, 0.5μM/L and HGF (10, 20, 30μg/L)+VP-16 (0.5μM/L) groups, respectively. It was not killed completely by single 0.5μM/L VP16 after 7 days. Western blot analysis of bcl-2 showed that the expressions were reduced in VP-16 5μM/L group for 24h, 1μM/L for 72h, HGF+VP-16 for 96h, respectively. No expression of the oncoprotein was seen after 120h. The expressions of PCNA were the highest in VP-16+HGF group.
, 百拇医药
CONCLUSION HGF might improve etoposideinduced apoptosis in hepatic carcinoma cells. The proliferating carcinoma cells may be regulated, and bcl-2 gene altered by their combination.
Subject headings Hepatocyte growth factor/pharmacology; Etoposide/pharmacology; Apoptosis/drug effects; Liver neoplasms/drug the rapy; Proto_oncogenes/drug effects; Gene/expression/drug effects
Yang XJ, Chen SB, Bao JZ,Wang Y, Zhang ZB, Zhang XK,Zhang XR.Effect of HGF on etoposide-induced apoptosis and bcl-2 gene expression for hepatocellular carcinoma.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1997;5(8):518-519
, 百拇医药
摘 要目的 研究肝细胞生长因子(HGF)对VP-16诱导肝癌细胞凋亡及bcl-2基因表达的影响.
方法 我们用VP-16联合HGF处理肝癌SMMC-7721细胞. 肝癌细胞处理分3组：VP-16(0.5,1,5μM/L); HGF(10,20,30μg/L)+VP-16(0.5μM/L);生理盐水对照组. Western blot分析bcl-2及核增殖抗原(PCNA)表达，DNA凝胶电泳，倒置显微镜及HE染色观察细胞形态.
结果 应用VP-165μM/L,0.5μM/L,HGF+VP-16,细胞凋亡分别在5h,7d和72h后发生，单用0.5μM/L VP-16诱发凋亡不明显. DNA电泳∶0.5～1μM/L VP-16处理1h对DNA无影响，24h时1μM/L和5μM/L组DNA在180bp左右形成条带. 36h后，HGF+VP-16 0.5μM/L组也在180bp处集中. Western blot:SMMC-7721细胞均不同程度表达PCNA,VP-16+HGF组表达量最高. bcl-2在5μM/L组处理后24h，1μM/L组72h，HGF+VP-16(0.5μM/L)96h表达下降，120h后未见表达.
, http://www.100md.com
结论 HGF促进VP-16诱发肝癌细胞凋亡，两者合用能够调节癌细胞增生及引起bcl-2基因表达改变.
主题词 肝细胞生长因子/药理学 依托泊甙/药理学 脱噬作用/药物作用 肝肿瘤/药物疗法 原癌基因/药物作用 基因表达/药物作用
杨秀疆,陈士葆,宝建中,王一,张忠兵,张贤康,张兴荣.HGF对VP-16诱导肝癌细胞凋亡及bcl-2基因表达的影响.新消化病学杂志,1997;5(8):518-519
细胞凋亡(apoptosis)在癌放疗及化疗中具有重要作用，疗效与调亡密切相关[1]. bcl_2基因可抑制多种细胞形成凋亡，在某些肿瘤细胞中该基因表达上调，使肿瘤细胞逃逸死亡和寿命延长[2]. 肝细胞生长因子能明显刺激细胞分裂、增殖，促进肝细胞分化. 对于肿瘤细胞可分别产生抑制和生长作用，能抑制肝癌细胞的生长[3]. 应用VP-16诱导后，以肝细胞生长因子进一步刺激，有可能加强肝癌细胞的诱导凋亡效应及影响凋亡相关基因的表达. 作者报道应用VP-16+HGF两者处理肝癌细胞(SMMC_7721)出现的凋亡及引起的bcl_2表达变化.
, 百拇医药
1 材料和方法1.1 肝癌细胞 SMMC_7721为传代肝癌细胞株(本校病理教研室建系). PRMI_1640，10%小牛血清孵育，隔天换液. 长至对数期，分别用下述处理：①生理盐水对照组；②HSS(肝细胞生长刺激物质，本校高分子生物实验室生产)，HGF(Sigma)10，20，30μg/L；3)VP-16(etoposide,上海浦东制药厂)，0.5，1和5μM/L组，预处理60min后洗去，分别加生理盐水，HGF各剂量组持续处理，1，24，48，72h及96h直至7d，作细胞倒置显微镜观察和HE染色.
1.2 方法 ①DNA电泳：按《分子克隆实验指南》[4]，取TBS洗处理后细胞，以缓冲液收集细胞并匀浆，快速酚氯法抽提DNA，2%琼脂糖(上海东风化工厂)加EB电泳，紫外线投射仪(上海长明光学电子仪器厂)观察并拍照. ②Western blot：以90mm大平皿用上法处理细胞，上样缓冲液(85℃预热)收集细胞，12% SDS_PAGE凝胶电泳(SDS，过硫酸胺购自华美生物工程公司)，双丙酰胺，TEMED(Sigma产品)，DTT，甘氨酸(上海东风化工厂)，按《分子克隆指南》作聚丙酰烯胺电泳(电泳仪，江苏兴化市生产，垂直电泳槽，上海求精仪器厂). 电泳4h，凝胶以石墨电极板硝酸纤维素膜转移(硝酸纤维素膜，0.4U，浙江黄岩化工厂)，转移毕丽春红-S染色条代清晰，加下述一抗：bcl_2，PCNA(DAKO产品，华美生物工程公司分装)，5%脱脂奶粉1∶80稀释，0.1ml/cm，4℃温育过夜，PBS洗涤，NaCl_Tris液洗，滴加二抗羊抗鼠_HRP(华美公司产品)，DAB显色.
, 百拇医药
图1 肝癌凋亡细胞倒置显微镜改变
图2 SMMC-7721凋亡细胞DNA电泳
图3 PCNA癌基因蛋白印渍改变
图4 凋亡细胞的bcl_2蛋白印滞改变
2 结果细胞培养，VP-16 5μM/L，0.5μM/L组细胞细胞凋亡分别在5h，7d后发生，24h时1μM/L可见约20%细胞呈凋亡表现(图1)，而5μM/L者几乎全部细胞死亡，各者处理1h细胞均无凋亡表现. HGF(10，20，30μg/L)+VP-16 0.5μM/L组72h后随HGF剂量增加凋亡逐渐增加，表现为生长素的特有刺激表现，呈扁平状生长，发生调亡时细胞核相对变小胞体变圆. 生理盐水及单用HGF处理组均无明显凋亡发生，HGF不引起细胞数增加. DNA电泳：单用0.5μM/L～1μM/L VP-16处理1h对DNA无影响，24h时1μM/L和5μM/L组DNA在180bp左右 形成条带.36h后，HGF+VP-16 0.5μM/L组也在180bp处集中(图2). Western blot: SMMC-7721细胞均不同程度表达PCNA，VP-16+HGF组表达量最高(图3). bcl_2在5μM/L组处理后24h，1μM/L组72h,HGF+VP-16(0.5μM/L)96h表达下降，120h后未见表达. HGF及单用0.5μM/L组对bcl_2影响不大(图4).
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3 讨论本结果表明，用VP-16短暂处理后继之以HGF刺激，SMMC-7721癌细胞呈扁平状生长，72h后出现明显细胞凋亡，随作用时间延长及HGF剂量加大，作用变强. 肝细胞生长因子增加了VP-16对肝癌细胞诱导凋亡作用. VP-16可与DNA链形成复合物引起DNA单链短暂断裂，导致基因表达改变[5]. 有报道EGF在不同细胞可分别诱导凋亡及减轻凋亡. Liu等[6]作肝癌细胞免疫组化显示其met基因表达下降. HGF对相同起源的正常和恶性肿瘤为何表现出相反的作用，其机制仍不清楚，相似的表现在许多正常和对应的新生细胞中观察到[7]. 本结果有类似表现，SMMC-7721细胞由对HGF无刺激反应转向促进凋亡，提示VP-16能够诱导SMMC-7721细胞对HGF产生反应可能增强凋亡效应. bcl_2对抗多种刺激诱发细胞凋亡. 但不少研究指出，bcl_2下调有利凋亡形成. 给红白血病撤除IL-3处理引发TF-1细胞凋亡并伴有bcl_2基因表达下降[8]. 本结果提示，经VP-16联合HGF能够影响bcl_2的表达，在近完成或引起大量凋亡时bcl_2呈表达下降，其下调对形成SMMC-7721细胞的凋亡起有利作用.
, 百拇医药
4 参考文献1 Korsmeyer SJ. Regulators of cell death. TIG, 1995;11(3):101-105
2 Packham G, Cleveland JL. c-Myc and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta “Reviews on Cancer”, 1995;1242(1):11-28
3 Rubin JS, Bottaro DP, Aaronoson SA. Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, the c-met proto-oncogene product.
Biochimica et biophsica Acta “Reviews on Cancer”, 1993;1155(4):357-371
, 百拇医药
4 金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆实验指南. 北京：科学出版社，1993：304
5 Hashimooto H, Chatterjee S, Berger NA. Inhibition of etoposde_induced DNA recombination and mutant frequency by bcl_2 protein
over expression. Cancer Research, 1995;55(9):4029-4035
6 Liu ML, Mars WM, Michalopoulos GK. Hepatocyte growth factor inhibits cell proliferation in vivo of rat hepatocellular carcinomas induced
, 百拇医药 by diethylnitrosamine. Carcinogenesis, 1995;16(4):841-843
7 Shiota G, Rhoads DB, Wang TC, et al. Hepatocyte growth factor inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci
USA, 1992;89(1):373-377
8 Rinaudo MS, Su K, Falk LA, et al. Human interleukin_3 receptor modulates bcl_2 mRNA and protein levels through protein kinase C in
TF_1 cells. Blood, 1995;86(1):80-88, http://www.100md.com
3东方肝胆外科医院 上海市 200003
杨秀疆，男，1960-10-05生，重庆市人，汉族. 1984年重庆中国人民解放军第三军医大学毕业，第二军医大学长征医院消化内科博士研究生，发表论文12篇.
项目负责人 杨秀疆,上海市凤阳路415号第二军医大学长征医院消化内科.
Tel: 021-63275997-362
收搞日期 1996-08-16 接受日期 1996-11-01
Effect of HGF on etoposideinduced apoptosis and bcl-2 gene expression for hepatocellular carcinoma
, 百拇医药
Xiu-Jiang Yang1, Shi-Bao Chen1, Jian-Zhong Bao2, Yi Wang3, Zhong-Bing Zhang1, Xian-Kan Zhang1 and Xing-Rong Zhang11Department of Gastroenterology, Changzheng Hospital
2Department of Pathology, 3Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Abstract
, 百拇医药
AIM To study the hepatocyte growth factor (HGF) in etoposide (VP-16)-induced apoptosis and bcl-2 gene.
METHODS Apoptosis (hepatic cancer cell line, SMMC-7721) was in duced by VP-16 (0.5, 1, 5μM/L), HGF (10, 20, 30μg/L)+VP-16 (0.5μM/L) and physiological salt solution served as control. The morphology of apoptosis was o bserved by HE staining. By Western blot, the expressions of bcl2 and PCNA prot ein were analyzed in induced apoptosis.
, 百拇医药
RESULTS Apotosis was found after 5h, 7 days and 72h in VP-16 5μM/L, 0.5μM/L and HGF (10, 20, 30μg/L)+VP-16 (0.5μM/L) groups, respectively. It was not killed completely by single 0.5μM/L VP16 after 7 days. Western blot analysis of bcl-2 showed that the expressions were reduced in VP-16 5μM/L group for 24h, 1μM/L for 72h, HGF+VP-16 for 96h, respectively. No expression of the oncoprotein was seen after 120h. The expressions of PCNA were the highest in VP-16+HGF group.
, 百拇医药
CONCLUSION HGF might improve etoposideinduced apoptosis in hepatic carcinoma cells. The proliferating carcinoma cells may be regulated, and bcl-2 gene altered by their combination.
Subject headings Hepatocyte growth factor/pharmacology; Etoposide/pharmacology; Apoptosis/drug effects; Liver neoplasms/drug the rapy; Proto_oncogenes/drug effects; Gene/expression/drug effects
Yang XJ, Chen SB, Bao JZ,Wang Y, Zhang ZB, Zhang XK,Zhang XR.Effect of HGF on etoposide-induced apoptosis and bcl-2 gene expression for hepatocellular carcinoma.Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1997;5(8):518-519
, 百拇医药
摘 要目的 研究肝细胞生长因子(HGF)对VP-16诱导肝癌细胞凋亡及bcl-2基因表达的影响.
方法 我们用VP-16联合HGF处理肝癌SMMC-7721细胞. 肝癌细胞处理分3组：VP-16(0.5,1,5μM/L); HGF(10,20,30μg/L)+VP-16(0.5μM/L);生理盐水对照组. Western blot分析bcl-2及核增殖抗原(PCNA)表达，DNA凝胶电泳，倒置显微镜及HE染色观察细胞形态.
结果 应用VP-165μM/L,0.5μM/L,HGF+VP-16,细胞凋亡分别在5h,7d和72h后发生，单用0.5μM/L VP-16诱发凋亡不明显. DNA电泳∶0.5～1μM/L VP-16处理1h对DNA无影响，24h时1μM/L和5μM/L组DNA在180bp左右形成条带. 36h后，HGF+VP-16 0.5μM/L组也在180bp处集中. Western blot:SMMC-7721细胞均不同程度表达PCNA,VP-16+HGF组表达量最高. bcl-2在5μM/L组处理后24h，1μM/L组72h，HGF+VP-16(0.5μM/L)96h表达下降，120h后未见表达.
, http://www.100md.com
结论 HGF促进VP-16诱发肝癌细胞凋亡，两者合用能够调节癌细胞增生及引起bcl-2基因表达改变.
主题词 肝细胞生长因子/药理学 依托泊甙/药理学 脱噬作用/药物作用 肝肿瘤/药物疗法 原癌基因/药物作用 基因表达/药物作用
杨秀疆,陈士葆,宝建中,王一,张忠兵,张贤康,张兴荣.HGF对VP-16诱导肝癌细胞凋亡及bcl-2基因表达的影响.新消化病学杂志,1997;5(8):518-519
细胞凋亡(apoptosis)在癌放疗及化疗中具有重要作用，疗效与调亡密切相关[1]. bcl_2基因可抑制多种细胞形成凋亡，在某些肿瘤细胞中该基因表达上调，使肿瘤细胞逃逸死亡和寿命延长[2]. 肝细胞生长因子能明显刺激细胞分裂、增殖，促进肝细胞分化. 对于肿瘤细胞可分别产生抑制和生长作用，能抑制肝癌细胞的生长[3]. 应用VP-16诱导后，以肝细胞生长因子进一步刺激，有可能加强肝癌细胞的诱导凋亡效应及影响凋亡相关基因的表达. 作者报道应用VP-16+HGF两者处理肝癌细胞(SMMC_7721)出现的凋亡及引起的bcl_2表达变化.
, 百拇医药
1 材料和方法1.1 肝癌细胞 SMMC_7721为传代肝癌细胞株(本校病理教研室建系). PRMI_1640，10%小牛血清孵育，隔天换液. 长至对数期，分别用下述处理：①生理盐水对照组；②HSS(肝细胞生长刺激物质，本校高分子生物实验室生产)，HGF(Sigma)10，20，30μg/L；3)VP-16(etoposide,上海浦东制药厂)，0.5，1和5μM/L组，预处理60min后洗去，分别加生理盐水，HGF各剂量组持续处理，1，24，48，72h及96h直至7d，作细胞倒置显微镜观察和HE染色.
1.2 方法 ①DNA电泳：按《分子克隆实验指南》[4]，取TBS洗处理后细胞，以缓冲液收集细胞并匀浆，快速酚氯法抽提DNA，2%琼脂糖(上海东风化工厂)加EB电泳，紫外线投射仪(上海长明光学电子仪器厂)观察并拍照. ②Western blot：以90mm大平皿用上法处理细胞，上样缓冲液(85℃预热)收集细胞，12% SDS_PAGE凝胶电泳(SDS，过硫酸胺购自华美生物工程公司)，双丙酰胺，TEMED(Sigma产品)，DTT，甘氨酸(上海东风化工厂)，按《分子克隆指南》作聚丙酰烯胺电泳(电泳仪，江苏兴化市生产，垂直电泳槽，上海求精仪器厂). 电泳4h，凝胶以石墨电极板硝酸纤维素膜转移(硝酸纤维素膜，0.4U，浙江黄岩化工厂)，转移毕丽春红-S染色条代清晰，加下述一抗：bcl_2，PCNA(DAKO产品，华美生物工程公司分装)，5%脱脂奶粉1∶80稀释，0.1ml/cm，4℃温育过夜，PBS洗涤，NaCl_Tris液洗，滴加二抗羊抗鼠_HRP(华美公司产品)，DAB显色.
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图1 肝癌凋亡细胞倒置显微镜改变
图2 SMMC-7721凋亡细胞DNA电泳
图3 PCNA癌基因蛋白印渍改变
图4 凋亡细胞的bcl_2蛋白印滞改变
2 结果细胞培养，VP-16 5μM/L，0.5μM/L组细胞细胞凋亡分别在5h，7d后发生，24h时1μM/L可见约20%细胞呈凋亡表现(图1)，而5μM/L者几乎全部细胞死亡，各者处理1h细胞均无凋亡表现. HGF(10，20，30μg/L)+VP-16 0.5μM/L组72h后随HGF剂量增加凋亡逐渐增加，表现为生长素的特有刺激表现，呈扁平状生长，发生调亡时细胞核相对变小胞体变圆. 生理盐水及单用HGF处理组均无明显凋亡发生，HGF不引起细胞数增加. DNA电泳：单用0.5μM/L～1μM/L VP-16处理1h对DNA无影响，24h时1μM/L和5μM/L组DNA在180bp左右 形成条带.36h后，HGF+VP-16 0.5μM/L组也在180bp处集中(图2). Western blot: SMMC-7721细胞均不同程度表达PCNA，VP-16+HGF组表达量最高(图3). bcl_2在5μM/L组处理后24h，1μM/L组72h,HGF+VP-16(0.5μM/L)96h表达下降，120h后未见表达. HGF及单用0.5μM/L组对bcl_2影响不大(图4).
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3 讨论本结果表明，用VP-16短暂处理后继之以HGF刺激，SMMC-7721癌细胞呈扁平状生长，72h后出现明显细胞凋亡，随作用时间延长及HGF剂量加大，作用变强. 肝细胞生长因子增加了VP-16对肝癌细胞诱导凋亡作用. VP-16可与DNA链形成复合物引起DNA单链短暂断裂，导致基因表达改变[5]. 有报道EGF在不同细胞可分别诱导凋亡及减轻凋亡. Liu等[6]作肝癌细胞免疫组化显示其met基因表达下降. HGF对相同起源的正常和恶性肿瘤为何表现出相反的作用，其机制仍不清楚，相似的表现在许多正常和对应的新生细胞中观察到[7]. 本结果有类似表现，SMMC-7721细胞由对HGF无刺激反应转向促进凋亡，提示VP-16能够诱导SMMC-7721细胞对HGF产生反应可能增强凋亡效应. bcl_2对抗多种刺激诱发细胞凋亡. 但不少研究指出，bcl_2下调有利凋亡形成. 给红白血病撤除IL-3处理引发TF-1细胞凋亡并伴有bcl_2基因表达下降[8]. 本结果提示，经VP-16联合HGF能够影响bcl_2的表达，在近完成或引起大量凋亡时bcl_2呈表达下降，其下调对形成SMMC-7721细胞的凋亡起有利作用.
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4 参考文献1 Korsmeyer SJ. Regulators of cell death. TIG, 1995;11(3):101-105
2 Packham G, Cleveland JL. c-Myc and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta “Reviews on Cancer”, 1995;1242(1):11-28
3 Rubin JS, Bottaro DP, Aaronoson SA. Hepatocyte growth factor/scatter factor and its receptor, the c-met proto-oncogene product.
Biochimica et biophsica Acta “Reviews on Cancer”, 1993;1155(4):357-371
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4 金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆实验指南. 北京：科学出版社，1993：304
5 Hashimooto H, Chatterjee S, Berger NA. Inhibition of etoposde_induced DNA recombination and mutant frequency by bcl_2 protein
over expression. Cancer Research, 1995;55(9):4029-4035
6 Liu ML, Mars WM, Michalopoulos GK. Hepatocyte growth factor inhibits cell proliferation in vivo of rat hepatocellular carcinomas induced
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7 Shiota G, Rhoads DB, Wang TC, et al. Hepatocyte growth factor inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci
USA, 1992;89(1):373-377
8 Rinaudo MS, Su K, Falk LA, et al. Human interleukin_3 receptor modulates bcl_2 mRNA and protein levels through protein kinase C in
TF_1 cells. Blood, 1995;86(1):80-88, http://www.100md.com