改良PCR/SSCP和PCR直接测序在基因突变检测中的应用
北京医科大学临床肿瘤学院 北京市肿瘤防治研究所 北京市 100034项目负责人 崔建涛,北京医科大学临床肿瘤学院 北京市肿瘤防治研究所 北京市 100034收搞日期 1996-11-25
Subject headings polymorphism, single stranded conformational;polymerase chain reaction;mutation;genes
主题词 多态现象，单链构象；聚合酶链反应；突变；基因
崔建涛,吕有勇.改良PCR/SSCP和PCR直接测序在基因突变检测中的应用.新消化病学杂志,1997;5(9):593-594
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1 PCR/SSCP银染显示法
1.1 基本原理及应用 PCR/SSCP技术是分子生物学中一项较为常用的技术. 它通过DNA单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移率除与链的碱基数有关外，更重要的是取决于DNA单链所形成的构象. 这种构象由DNA单链碱基顺序决定，相同长度的DNA单链可因单碱基的差别而造成构象的不同，可通过PCR/SSCP技术检测单碱基置换(点突变)、碱基插入突变或移码突变等基因结构改变.早期的SSCP技术是在PCR反应时加入[α_32P]_dCTP，使基其掺入DNA链中或用 同位素标记引物，通过自显影显带. 这种技术一直延用至今，但仍存在一些问题. 主要是同位素污染和受半衰期的限制，另外操作过程较复杂，如需干胶、压片，需要特殊仪器加以辅助. SSCP银染显示法(也称冷SSCP)做为一种非同位素技术避免了这些问题. 采用银染 ，对单链DNA的亲合力较强，这样大大提高了分辨率及检测的敏感性. 我们参考有关文献[1，2]，建立了SSCP银染技术，在检测p53等基因的几个外显子中获得了较好的结果，实验证明：冷SSCP银染显示法是一种检测点突变的有效方法.冷SSCP技术操作简单，重复性好，经济省时. 我们将冷SSCP银染显示法[2]的结果同测序结果对照，结果相符. 冷SSCP银染显示法的单链带型清晰，带与带之间易于识别，而同位素法由于32P具有散射作用，带型有时模糊，不易观察，易出现假阴性结果. 因此说，PCR/SSCP银染显示法是一项值得推广的技术.
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1.2 实验操作步骤
1.2.1 PCR反应 ①反应体系总体积10μl： 1×反应缓冲液，0.2mM dTNP，50μmol/L Primer， 1.5mM MgCl2，0.5U Tap Polymerase, 0.1μg DNA. ②循环参数：PCR反应在PE 9600热循环仪中进行，退火温度根据所用引物进行确定. 反应前94℃充分变性模板，反应后72℃延伸10min. ③产物鉴定：2.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物(100bp以上).
1.2.2 SSCP ①12%聚丙烯酰胺凝胶：0.25×TBE，丙烯酰胺(29∶1). ②电泳：1μl PCR扩增产物加4μl Stop Buffer， 90℃变性5min， 0.25×TBE Buffer中电泳，恒流5mA～10mA，温度最好控制在8℃～10℃. 采用可循环式电泳槽效果最佳(Bio_Rad Ⅲ型).
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1.2.3 银染 10%乙醇固定10min→1%硝酸还原10min→10%冰醋酸终止反应→50%乙醇脱水，干燥保存，将凝胶放置在两层透气性良好的玻璃纸之间，压平，4℃冰箱干燥，可永久保存(图1). 以上各步骤之间用蒸馏水冲洗3次，每次30s.
1.3 实验中出现的问题及解决方法 冷SSCP电泳时可先预电泳1h，再加样. 同时配制冷循环水装置，使胶的温度均匀保持在4℃～10℃. 电泳槽中的缓冲液可提前冷却. PCR产物变性温度应在75℃以上，以90℃为佳， 这样可使PCR产物变性完全，时间5min. 新鲜标本的PCR产物一般取1μl上样，石蜡标本要相应增多. 产物量与染料的比例为1∶4 . 走胶时恒压、恒流均可，经多次实验 证明，恒流效果好.
图1 非同位素SSCP银染显示法结果.
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图示：箭头所示猵53 exon 7突变；N：正常组织标本；45～52：胃癌组织标本；dsDNA：双链DNA；ssDNA：单链DNA
图2 PCR直接测序法结果(USB Kit).
染胶时各步的时间应严格控制，硝酸变性的时间过长，会使胶的颜色发黄. 染色时间过长会使胶变黑，都会影响结果. 染胶各步完成后，应用蒸馏水彻底洗净. 但染色后冲洗不易过长，否则影响显色. 另外，碳酸钠显色时间不易过长，当溶液变为棕色时，应弃掉，换新的碳酸钠继续显色. 当显色完全后，应及时终止，避免凝胶变黑.
2 PCR直接测序法
2.1 基本原理及应用 现行的链终止法是从加减法序列测定技术(Sanger和Coulson，1975)发展来的. 它是通过引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂. 酶法DNA序列测定技术才得以广泛应用[3～5]. 2′,3′ddNTP与普通dNTP不同之处在于它们在脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基， 它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5′三磷酸基因掺入到正在增长的D NA链中，但由于没有3′羟基它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，DNA链的增长被终止. 这样，在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离. 在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每个A、每一个C、每一个G或每个一T的位置上.
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2.2 测序胶的配制 ①6%丙烯酰胺(19∶1)500ml，丙烯酰胺28.5g，N，N′_亚甲双丙烯酰胺1.5g，尿素(超纯)210g，10×TBF Buffer 50ml，加水至500ml，加热至55℃溶解，用0.45μm滤膜过滤，4℃避光保存. ②6%测序胶：6%丙烯酰胺50ml，10% AP 250μl，TEMED 30μl.
2.3 PCR反应制备双链模板 PCR反应扩增50μl～100μl.
2.4 模板的纯化 将PCR产物走4%PAGE胶，EB染色30min后，在紫外灯将所需片段长度切片，装入管中，加入等体积的0.1×TBE(或H2O)浸泡过夜，可重复两次. 酚/氯仿，氯仿/异戊醇抽提，加NaOAC至终浓度2.5M，-70℃无水乙醇沉淀，离心，80%乙醇洗两次，干燥后溶于高压蒸馏水中，2.0%琼脂糖电泳鉴定.
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2.5 测序反应 ①dsDNA (100ng～200ng)与Primer大约3μl～μl(50μl/L)充分混合，煮沸2min，置液氮中冷却. 将ddGTP\,ddTTP\,ddCTP各2.5μl分于小管中，37℃孵育. ②标记反应：Labeling Solution (1∶5稀释) (标记缓冲混合液)3μl，dTT(二硫苏糖醇0.1M) 1μl， Mn2+缓冲液3μl，则序酶(1∶8释放)3μl，[α_35S]_dATP 1μl，与模板_引物混合液混合，总体积16μl，在室温放5min. ③将上述混合液取3.5μl分于ddGTP\,ddATP\,ddTTP\,ddCTP管中，总体积6μl，37℃孵育5min，每个反应管中加入4μl Stop Buffer， 总体积10μl. 75℃ 2min变性后上样电泳.
2.6 电泳 将800ml 1×TBE加热至50℃，加入槽内，60W恒定功率大约2h，使胶达45℃，然后上样，功率仍为60W. 走胶完毕，加固定液固定30min后，将胶揭于光滑的滤纸上，80℃抽干，-70℃曝光. 冲洗胶片后读片(图2).
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2.7 实验中存在的问题及解决方法 DNA序列分析，模板的质量是最主要的因素，因此选用PAGE胶进行纯化为好，以提高模板的纯度. PAGE胶的浓度要掌握好，浓度过高，使胶过硬，模板浸泡时不易分离出，会影响模板的产量；浓度过低，染色时易破损，也不会去除一些非特异性片段，因此应根据所用引物的长度不同，确定所用胶的浓度. 另外，胶在固定过程中，应均匀浸泡，使胶固定并可除去尿素，否则会使凝胶不能彻底干燥，并使之粘在放射自显影片上. 总之，测序实验的各步反应严格控制，以期得到良好的结果.
3 参考文献1 Shiao YH, Rugge M, Correa P, et al. p53 alteration in gastric precancerous lesions. Am J Pathol, 1994;144(3):511-517
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2 Hongyo T, Buzard GS, Calvert TJ, et al. \!Clod SSCP\": a simple, rapid and non_radioactive method for optimized single_strand
conformation polymorphism analysises. Nucleic Acids Res, 1993;21(16):3637-3642
3 张青云，吕有勇，李诤，等. 人胃癌组织p53基因异常的筛选及序列测定. 中华医学杂志，1995；75(3)：75
4 张青云，吕有勇，李诤，等. 人胃癌细胞系p53抑癌基因变异的测定及其序列分析. 生物化学杂志，1995；11(3)：311
5 吕有勇，李诤，孙梅，等. p53基因点空变与胃癌细胞恶性程度及临床预后的关系. 中华医学杂志，1995；75(11)：679, 百拇医药
Subject headings polymorphism, single stranded conformational;polymerase chain reaction;mutation;genes
主题词 多态现象，单链构象；聚合酶链反应；突变；基因
崔建涛,吕有勇.改良PCR/SSCP和PCR直接测序在基因突变检测中的应用.新消化病学杂志,1997;5(9):593-594
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1 PCR/SSCP银染显示法
1.1 基本原理及应用 PCR/SSCP技术是分子生物学中一项较为常用的技术. 它通过DNA单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移率除与链的碱基数有关外，更重要的是取决于DNA单链所形成的构象. 这种构象由DNA单链碱基顺序决定，相同长度的DNA单链可因单碱基的差别而造成构象的不同，可通过PCR/SSCP技术检测单碱基置换(点突变)、碱基插入突变或移码突变等基因结构改变.早期的SSCP技术是在PCR反应时加入[α_32P]_dCTP，使基其掺入DNA链中或用 同位素标记引物，通过自显影显带. 这种技术一直延用至今，但仍存在一些问题. 主要是同位素污染和受半衰期的限制，另外操作过程较复杂，如需干胶、压片，需要特殊仪器加以辅助. SSCP银染显示法(也称冷SSCP)做为一种非同位素技术避免了这些问题. 采用银染 ，对单链DNA的亲合力较强，这样大大提高了分辨率及检测的敏感性. 我们参考有关文献[1，2]，建立了SSCP银染技术，在检测p53等基因的几个外显子中获得了较好的结果，实验证明：冷SSCP银染显示法是一种检测点突变的有效方法.冷SSCP技术操作简单，重复性好，经济省时. 我们将冷SSCP银染显示法[2]的结果同测序结果对照，结果相符. 冷SSCP银染显示法的单链带型清晰，带与带之间易于识别，而同位素法由于32P具有散射作用，带型有时模糊，不易观察，易出现假阴性结果. 因此说，PCR/SSCP银染显示法是一项值得推广的技术.
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1.2 实验操作步骤
1.2.1 PCR反应 ①反应体系总体积10μl： 1×反应缓冲液，0.2mM dTNP，50μmol/L Primer， 1.5mM MgCl2，0.5U Tap Polymerase, 0.1μg DNA. ②循环参数：PCR反应在PE 9600热循环仪中进行，退火温度根据所用引物进行确定. 反应前94℃充分变性模板，反应后72℃延伸10min. ③产物鉴定：2.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物(100bp以上).
1.2.2 SSCP ①12%聚丙烯酰胺凝胶：0.25×TBE，丙烯酰胺(29∶1). ②电泳：1μl PCR扩增产物加4μl Stop Buffer， 90℃变性5min， 0.25×TBE Buffer中电泳，恒流5mA～10mA，温度最好控制在8℃～10℃. 采用可循环式电泳槽效果最佳(Bio_Rad Ⅲ型).
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1.2.3 银染 10%乙醇固定10min→1%硝酸还原10min→10%冰醋酸终止反应→50%乙醇脱水，干燥保存，将凝胶放置在两层透气性良好的玻璃纸之间，压平，4℃冰箱干燥，可永久保存(图1). 以上各步骤之间用蒸馏水冲洗3次，每次30s.
1.3 实验中出现的问题及解决方法 冷SSCP电泳时可先预电泳1h，再加样. 同时配制冷循环水装置，使胶的温度均匀保持在4℃～10℃. 电泳槽中的缓冲液可提前冷却. PCR产物变性温度应在75℃以上，以90℃为佳， 这样可使PCR产物变性完全，时间5min. 新鲜标本的PCR产物一般取1μl上样，石蜡标本要相应增多. 产物量与染料的比例为1∶4 . 走胶时恒压、恒流均可，经多次实验 证明，恒流效果好.
图1 非同位素SSCP银染显示法结果.
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图示：箭头所示猵53 exon 7突变；N：正常组织标本；45～52：胃癌组织标本；dsDNA：双链DNA；ssDNA：单链DNA
图2 PCR直接测序法结果(USB Kit).
染胶时各步的时间应严格控制，硝酸变性的时间过长，会使胶的颜色发黄. 染色时间过长会使胶变黑，都会影响结果. 染胶各步完成后，应用蒸馏水彻底洗净. 但染色后冲洗不易过长，否则影响显色. 另外，碳酸钠显色时间不易过长，当溶液变为棕色时，应弃掉，换新的碳酸钠继续显色. 当显色完全后，应及时终止，避免凝胶变黑.
2 PCR直接测序法
2.1 基本原理及应用 现行的链终止法是从加减法序列测定技术(Sanger和Coulson，1975)发展来的. 它是通过引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂. 酶法DNA序列测定技术才得以广泛应用[3～5]. 2′,3′ddNTP与普通dNTP不同之处在于它们在脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基， 它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5′三磷酸基因掺入到正在增长的D NA链中，但由于没有3′羟基它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，DNA链的增长被终止. 这样，在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离. 在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每个A、每一个C、每一个G或每个一T的位置上.
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2.2 测序胶的配制 ①6%丙烯酰胺(19∶1)500ml，丙烯酰胺28.5g，N，N′_亚甲双丙烯酰胺1.5g，尿素(超纯)210g，10×TBF Buffer 50ml，加水至500ml，加热至55℃溶解，用0.45μm滤膜过滤，4℃避光保存. ②6%测序胶：6%丙烯酰胺50ml，10% AP 250μl，TEMED 30μl.
2.3 PCR反应制备双链模板 PCR反应扩增50μl～100μl.
2.4 模板的纯化 将PCR产物走4%PAGE胶，EB染色30min后，在紫外灯将所需片段长度切片，装入管中，加入等体积的0.1×TBE(或H2O)浸泡过夜，可重复两次. 酚/氯仿，氯仿/异戊醇抽提，加NaOAC至终浓度2.5M，-70℃无水乙醇沉淀，离心，80%乙醇洗两次，干燥后溶于高压蒸馏水中，2.0%琼脂糖电泳鉴定.
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2.5 测序反应 ①dsDNA (100ng～200ng)与Primer大约3μl～μl(50μl/L)充分混合，煮沸2min，置液氮中冷却. 将ddGTP\,ddTTP\,ddCTP各2.5μl分于小管中，37℃孵育. ②标记反应：Labeling Solution (1∶5稀释) (标记缓冲混合液)3μl，dTT(二硫苏糖醇0.1M) 1μl， Mn2+缓冲液3μl，则序酶(1∶8释放)3μl，[α_35S]_dATP 1μl，与模板_引物混合液混合，总体积16μl，在室温放5min. ③将上述混合液取3.5μl分于ddGTP\,ddATP\,ddTTP\,ddCTP管中，总体积6μl，37℃孵育5min，每个反应管中加入4μl Stop Buffer， 总体积10μl. 75℃ 2min变性后上样电泳.
2.6 电泳 将800ml 1×TBE加热至50℃，加入槽内，60W恒定功率大约2h，使胶达45℃，然后上样，功率仍为60W. 走胶完毕，加固定液固定30min后，将胶揭于光滑的滤纸上，80℃抽干，-70℃曝光. 冲洗胶片后读片(图2).
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2.7 实验中存在的问题及解决方法 DNA序列分析，模板的质量是最主要的因素，因此选用PAGE胶进行纯化为好，以提高模板的纯度. PAGE胶的浓度要掌握好，浓度过高，使胶过硬，模板浸泡时不易分离出，会影响模板的产量；浓度过低，染色时易破损，也不会去除一些非特异性片段，因此应根据所用引物的长度不同，确定所用胶的浓度. 另外，胶在固定过程中，应均匀浸泡，使胶固定并可除去尿素，否则会使凝胶不能彻底干燥，并使之粘在放射自显影片上. 总之，测序实验的各步反应严格控制，以期得到良好的结果.
3 参考文献1 Shiao YH, Rugge M, Correa P, et al. p53 alteration in gastric precancerous lesions. Am J Pathol, 1994;144(3):511-517
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2 Hongyo T, Buzard GS, Calvert TJ, et al. \!Clod SSCP\": a simple, rapid and non_radioactive method for optimized single_strand
conformation polymorphism analysises. Nucleic Acids Res, 1993;21(16):3637-3642
3 张青云，吕有勇，李诤，等. 人胃癌组织p53基因异常的筛选及序列测定. 中华医学杂志，1995；75(3)：75
4 张青云，吕有勇，李诤，等. 人胃癌细胞系p53抑癌基因变异的测定及其序列分析. 生物化学杂志，1995；11(3)：311
5 吕有勇，李诤，孙梅，等. p53基因点空变与胃癌细胞恶性程度及临床预后的关系. 中华医学杂志，1995；75(11)：679, 百拇医药