原发肝癌N-ras基因点突变研究
第三军医大学西南医院消化科 重庆市 630038
作者简介 杜清书，男，1964-09-17生，重庆市人，汉族. 1986年第三军医大学医学系本科毕业，主治医师，讲师，主要从事消化病诊治研究，发表论文3篇[重庆市高滩岩路1号. 电话(023)65318301-73094].(收稿 1997-02-28 修回 1997-05-29)
N-ras gene point mutation in primary hepatocellular cancer
DU Qing-Shu, FANG Dian-Chun, LUO Yuan-Hui, LU Rong and LIU Wei-Wen
Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 630038, China
, http://www.100md.com
Subject headings liver neoplasms/genetics; genes, ras; point mutation
Abstract
AIM To study the role of oncogene N-ras mutation in the progression of primary hepatocellular cancer (HCC).
METHODS Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphims (PCR-RFLP) analysis were performed in 30 surgically resected HCC specimens to determine the point mutations at codon 12 of N-ras gene.
, 百拇医药
RESULTS Point mutation was detected in 5 of 30 (16.7%) of HCC specimens. No significant correlation was found between the positivity of N-ras mutation and the status of background lesions, tumor size, differentiation, metastasis and hepatitis B virus (P>0.05).
CONCLUSION The point mutation at codon 12 of N-ras gene is involved in the development of HCC.
主题词 肝肿瘤/遗传学； 基因，ras； 点突变
, 百拇医药
中国图书资料分类号 R735.7
摘要
目的 研究N-ras基因第12位密码子突变与原发性肝癌(HCC)发生发展的关系.
方法 采用聚合酶链延伸反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)对30例HCC手术切除标本N-ras第12密码子点突变进行检测.
结果 在30例HCC中，发现N-ras第12密码子点突变5例，突变率为16.7%. 点突变与肿瘤大小、分化程度、有无转移及HBV感染无显著相关
(P<0.05).
, 百拇医药 结论 N-ras基因第12位密码子突变参与了部分HCC的发生与发展.
原发肝癌的发生也是由多因素参与和经历多阶段的演变过程，在其发生发展过程中可能涉及到多种癌基因的激活和抑癌基因的失活. 顾健人等[1]报告原发肝癌N-ras mRNA的表达水平明显增高. 林月珍等[2]亦发现，在二乙基亚硝胺诱发大鼠实验性肝癌的早期，N-ras mRNA的表达水平即明显升高. 关于N-ras基因突变研究国内鲜见报道，作者采用PCR-RFLP技术对原发肝癌的点突变进行研究.
1 材料和方法
1.1 材料 原发性肝癌30例为我院1993年6月～1995年10月手术切除标本. 手术切下肿瘤后立即收集癌组织，剔除出血、坏死部分后-80℃冻存. 按文献方法提取基因组DNA[3]. 冰冻切片染色证实所检测癌组织肿瘤细胞数均在70%以上.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增 N-ras和HBV-S基因扩增的引物由中科院上海细胞生物所合成，引物序列表1. 取1μg组织DNA加入20μl PCR反应液中(含10mmol/L Tris HCl, 50mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl2， 20pmol上游及下游引物，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各200μmol/L， Taq DNA聚合酶(2～4μmol/L)，在PCR扩增仪(Perkin Elmer Cetus)上操作，反应条件：95℃变性40s，56℃复性40s， 72℃延伸60s，循环35次. 最后一个循环后，置72℃继续反应10min.
1.2.2 RFLP分析 取扩增N-ras基因产物10μl，应用限制内切酶(表1)酶解12h，消化后的DNA在8%聚丙酰胺凝胶中进行电泳分离，溴乙锭染色，紫外光下观察并照像. HBV-S基因扩增产物不用酶切，直接行3%琼脂糖凝胶电泳.N-ras基因第12编码区点突变分析：N-ras基因第12编码区周围无限制性内切酶识别位点，根据引物3′端有误配碱基不影响PCR扩增的原理[4]，本文将正链引物3′端第11密码子的G改为C，这样形成CCAGG-BstN1识别位点. 扩增片段长98bp,野生型被切为19+79bp，两个片段，突变型则不能被酶切，故仍为98bp.
, 百拇医药
1.2.3 HBV-S基因扩增产物分析 HBV-S基因经PCR扩增，扩增片段长413bp，以去离子水和正常血清作对照均为阴性，电泳位置符合预计值.
表1 使用引物序列
, 百拇医药
2 结果
原发肝癌组织30例中检出N-ras第12密码子突变5例，突变率为16.7%(图1)， HBV-S基因阳性25例，阳性率83.3%(图2). 将30例原发肝癌按血清AFP水平、有无肝硬变、肿瘤大小、分化程度及有无转移的不同进行分组，N-ras突变与临床病理参数的关系表2. 经统计学处理，各组间N-ras基因突变率均无显著差别(P>0.05). HBV-S基因阳性与阴性组间N-ras基因突变率均无显著差别(P>0.05，表3).
表2 肝癌N-ras突变与临床病理参数的关系
, 百拇医药
表3 肝癌N-ras突变与HBV感染的关系
图1 原发肝癌N-ras基因第12密码子点突变分析 M：PBR 322/Hae Ⅲ； P：扩增产物未酶切；N：正常组织；T：肿瘤组织.
图2 HBV-S基因PCR扩增产物.
, http://www.100md.com
3 讨论
ras基因家族包括3个功能基因，即H-ras,K-ras和N-ras. 点突变是ras基因活化的重要方式，突变热点集中在第12，13和61位密码子. 近年不少作者通过动物实验观察不同致癌剂对鼠肝癌致突变作用，均发现化学诱发肝癌中存在H-ras第61密码子点突变. Manam等[5]采用动物实验证明，化学致癌剂可致鼠肝癌N-ras第12位和13位密码子的G-T突变首次证明N-ras突变在鼠肝癌的发生中起重要作用. 国内顾健人等[1]从mRNA水平对原发肝癌N-ras的表达进行研究. 21例肝癌中发现有17例有N-ras mRNA的过量表达. 作者采用PCR-RFLP技术对原发肝癌N-ras第12位密码子点突变进行检测，结果发现30例肝癌中有5例发生第12位密码子突变，突变率为16.7%，提示N-ras第12密码子突变参与了部分肝癌的发生和发展.
, http://www.100md.com
Challen等[6]对19例原发肝癌N-ras基因第61位密码子进行检测发现突变3例，突变均发生于伴有肝硬变肝癌患者. 从本文病例来看，伴有肝硬变肝癌突变率为19.0%，而无肝硬变突变率为11.1%，两者无显著差别，提示原发肝癌N-ras基因突变与基础病变似无密切关系. 此外，本文亦未发现原发肝癌N-ras第12密码子突变与血清APF水平，肿瘤大小，分化程度和有无转移有明确关系.
流行病学和临床资料证明HBV慢性感染与原发肝癌的发生有相关性. 近年的研究发现，原发性肝癌中存在HBV的整合[7]. HBV可“俘获”细胞癌基因，以突变的形式使整合的基因组转化为具有致癌活性的癌基因[7]. 作者采用PCR方法，对原发性肝癌组织HBV进行检测，30例中有25例检出HBV，阳性率高达83.3%. 但通过分析HBV存在状态与N-ras突变的关系，未发现HBV感染与N-ras第12编码区的突变有显著的关系，说明N-ras基因异常与HBV整合可能无密切关系.
, 百拇医药
4 参考文献
1 顾健人，陈渊卿，蒋惠秋，等. 人原发肝癌的癌基因谱. 肿瘤，1988；8(6)：289-291
2 林月珍，丁濂，陈晋彦. 癌前变异肝细胞C-myc, N-ras mRNA的表达及其与分化. 中华肿瘤杂志，1993；15(2)：97-99
3 Tamura G, Maesawa C, Suzuki Y, et al. Primary gastric carcinoma cell frequently loss heterozygosity at APC and MCC genetic
loci. Jpn Cancer Res, 1993;84(8):1015-1018
, 百拇医药
4 Cohen JB, Lerinson AD. Point mutation in the last intron responsible for in creased expression and transforming activity of the
C-H-ras oncogen. Nature, 1988;334(6178):119-124
5 Manam S, Storer RD, Prahalada S, Leander KR, Kraynak AR, Ledwith BJ, et al. Activation of the H-ras, Ki-, and N-ras genes
on chemically induced liver tumor from CD-1 mice. Cancer Res, 1992;52(12):3347-3352
, 百拇医药
6 Challen C, Guo K, Collier JD, et al. Infrequent point mutation in codon 12 and 61 of ras oncogenes in human
hepatocellular carcinomas. J Hepatol, 1992;14(2～3):342-346
7 Paterlini P, Poussin K. Kew M, et al. Selective accumulation of the X transcript of hepatitis B virus in patients negative for
hepatitis B surface antigen with hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1995;21(2):313-321, http://www.100md.com(杜清书 房殿春 罗元辉 鲁 荣 刘为纹)
作者简介 杜清书，男，1964-09-17生，重庆市人，汉族. 1986年第三军医大学医学系本科毕业，主治医师，讲师，主要从事消化病诊治研究，发表论文3篇[重庆市高滩岩路1号. 电话(023)65318301-73094].(收稿 1997-02-28 修回 1997-05-29)
N-ras gene point mutation in primary hepatocellular cancer
DU Qing-Shu, FANG Dian-Chun, LUO Yuan-Hui, LU Rong and LIU Wei-Wen
Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 630038, China
, http://www.100md.com
Subject headings liver neoplasms/genetics; genes, ras; point mutation
Abstract
AIM To study the role of oncogene N-ras mutation in the progression of primary hepatocellular cancer (HCC).
METHODS Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphims (PCR-RFLP) analysis were performed in 30 surgically resected HCC specimens to determine the point mutations at codon 12 of N-ras gene.
, 百拇医药
RESULTS Point mutation was detected in 5 of 30 (16.7%) of HCC specimens. No significant correlation was found between the positivity of N-ras mutation and the status of background lesions, tumor size, differentiation, metastasis and hepatitis B virus (P>0.05).
CONCLUSION The point mutation at codon 12 of N-ras gene is involved in the development of HCC.
主题词 肝肿瘤/遗传学； 基因，ras； 点突变
, 百拇医药
中国图书资料分类号 R735.7
摘要
目的 研究N-ras基因第12位密码子突变与原发性肝癌(HCC)发生发展的关系.
方法 采用聚合酶链延伸反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)对30例HCC手术切除标本N-ras第12密码子点突变进行检测.
结果 在30例HCC中，发现N-ras第12密码子点突变5例，突变率为16.7%. 点突变与肿瘤大小、分化程度、有无转移及HBV感染无显著相关
(P<0.05).
, 百拇医药 结论 N-ras基因第12位密码子突变参与了部分HCC的发生与发展.
原发肝癌的发生也是由多因素参与和经历多阶段的演变过程，在其发生发展过程中可能涉及到多种癌基因的激活和抑癌基因的失活. 顾健人等[1]报告原发肝癌N-ras mRNA的表达水平明显增高. 林月珍等[2]亦发现，在二乙基亚硝胺诱发大鼠实验性肝癌的早期，N-ras mRNA的表达水平即明显升高. 关于N-ras基因突变研究国内鲜见报道，作者采用PCR-RFLP技术对原发肝癌的点突变进行研究.
1 材料和方法
1.1 材料 原发性肝癌30例为我院1993年6月～1995年10月手术切除标本. 手术切下肿瘤后立即收集癌组织，剔除出血、坏死部分后-80℃冻存. 按文献方法提取基因组DNA[3]. 冰冻切片染色证实所检测癌组织肿瘤细胞数均在70%以上.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增 N-ras和HBV-S基因扩增的引物由中科院上海细胞生物所合成，引物序列表1. 取1μg组织DNA加入20μl PCR反应液中(含10mmol/L Tris HCl, 50mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl2， 20pmol上游及下游引物，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各200μmol/L， Taq DNA聚合酶(2～4μmol/L)，在PCR扩增仪(Perkin Elmer Cetus)上操作，反应条件：95℃变性40s，56℃复性40s， 72℃延伸60s，循环35次. 最后一个循环后，置72℃继续反应10min.
1.2.2 RFLP分析 取扩增N-ras基因产物10μl，应用限制内切酶(表1)酶解12h，消化后的DNA在8%聚丙酰胺凝胶中进行电泳分离，溴乙锭染色，紫外光下观察并照像. HBV-S基因扩增产物不用酶切，直接行3%琼脂糖凝胶电泳.N-ras基因第12编码区点突变分析：N-ras基因第12编码区周围无限制性内切酶识别位点，根据引物3′端有误配碱基不影响PCR扩增的原理[4]，本文将正链引物3′端第11密码子的G改为C，这样形成CCAGG-BstN1识别位点. 扩增片段长98bp,野生型被切为19+79bp，两个片段，突变型则不能被酶切，故仍为98bp.
, 百拇医药
1.2.3 HBV-S基因扩增产物分析 HBV-S基因经PCR扩增，扩增片段长413bp，以去离子水和正常血清作对照均为阴性，电泳位置符合预计值.
表1 使用引物序列
| 检测基因 | 扩增产物 | 酶 | 酶切片段 | 引物序列 |
| N-ras第12 | 98 | BstN1 | 79/19 | 5′-AACTGGTGGTGGTTGGACCA-3′ |
| 密码子 | 5′-CTCTATGGTGGGATCATATTC-3′ | |||
| HBV-S基因 | 413 | 5′-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′ | ||
| 5′-TTAGGGTTTAAATCTATAGGG-3′ |
, 百拇医药
2 结果
原发肝癌组织30例中检出N-ras第12密码子突变5例，突变率为16.7%(图1)， HBV-S基因阳性25例，阳性率83.3%(图2). 将30例原发肝癌按血清AFP水平、有无肝硬变、肿瘤大小、分化程度及有无转移的不同进行分组，N-ras突变与临床病理参数的关系表2. 经统计学处理，各组间N-ras基因突变率均无显著差别(P>0.05). HBV-S基因阳性与阴性组间N-ras基因突变率均无显著差别(P>0.05，表3).
表2 肝癌N-ras突变与临床病理参数的关系
| 临床参数 | n | N-ras突变(%) |
| 血清AFP | ||
| ≤30μg/L | 12 | 2(16.7) |
| >30μg/L | 8 | 3(37.5) |
| 肝硬变 | ||
| 无 | 9 | 1(11.1) |
| 有 | 21 | 4(19.0) |
| 肿瘤大小 | ||
| ≤5cm | 6 | 1(16.7) |
| >5cm | 24 | 4(16.7) |
| 肿瘤分化 | ||
| 高 | 14 | 3(21.4) |
| 中 | 7 | 1(14.3) |
| 低 | 9 | 1(11.1) |
| 转移 | ||
| 无 | 8 | 1(12.5) |
| 有 | 22 | 4(18.2) |
, 百拇医药
表3 肝癌N-ras突变与HBV感染的关系
| 组别 | n | N-ras突变(%) |
| HBV-S阴性 | 5 | 1(20.0) |
| HBV-S阳性 | 25 | 4(16.0) |
图1 原发肝癌N-ras基因第12密码子点突变分析 M：PBR 322/Hae Ⅲ； P：扩增产物未酶切；N：正常组织；T：肿瘤组织.
图2 HBV-S基因PCR扩增产物.
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3 讨论
ras基因家族包括3个功能基因，即H-ras,K-ras和N-ras. 点突变是ras基因活化的重要方式，突变热点集中在第12，13和61位密码子. 近年不少作者通过动物实验观察不同致癌剂对鼠肝癌致突变作用，均发现化学诱发肝癌中存在H-ras第61密码子点突变. Manam等[5]采用动物实验证明，化学致癌剂可致鼠肝癌N-ras第12位和13位密码子的G-T突变首次证明N-ras突变在鼠肝癌的发生中起重要作用. 国内顾健人等[1]从mRNA水平对原发肝癌N-ras的表达进行研究. 21例肝癌中发现有17例有N-ras mRNA的过量表达. 作者采用PCR-RFLP技术对原发肝癌N-ras第12位密码子点突变进行检测，结果发现30例肝癌中有5例发生第12位密码子突变，突变率为16.7%，提示N-ras第12密码子突变参与了部分肝癌的发生和发展.
, http://www.100md.com
Challen等[6]对19例原发肝癌N-ras基因第61位密码子进行检测发现突变3例，突变均发生于伴有肝硬变肝癌患者. 从本文病例来看，伴有肝硬变肝癌突变率为19.0%，而无肝硬变突变率为11.1%，两者无显著差别，提示原发肝癌N-ras基因突变与基础病变似无密切关系. 此外，本文亦未发现原发肝癌N-ras第12密码子突变与血清APF水平，肿瘤大小，分化程度和有无转移有明确关系.
流行病学和临床资料证明HBV慢性感染与原发肝癌的发生有相关性. 近年的研究发现，原发性肝癌中存在HBV的整合[7]. HBV可“俘获”细胞癌基因，以突变的形式使整合的基因组转化为具有致癌活性的癌基因[7]. 作者采用PCR方法，对原发性肝癌组织HBV进行检测，30例中有25例检出HBV，阳性率高达83.3%. 但通过分析HBV存在状态与N-ras突变的关系，未发现HBV感染与N-ras第12编码区的突变有显著的关系，说明N-ras基因异常与HBV整合可能无密切关系.
, 百拇医药
4 参考文献
1 顾健人，陈渊卿，蒋惠秋，等. 人原发肝癌的癌基因谱. 肿瘤，1988；8(6)：289-291
2 林月珍，丁濂，陈晋彦. 癌前变异肝细胞C-myc, N-ras mRNA的表达及其与分化. 中华肿瘤杂志，1993；15(2)：97-99
3 Tamura G, Maesawa C, Suzuki Y, et al. Primary gastric carcinoma cell frequently loss heterozygosity at APC and MCC genetic
loci. Jpn Cancer Res, 1993;84(8):1015-1018
, 百拇医药
4 Cohen JB, Lerinson AD. Point mutation in the last intron responsible for in creased expression and transforming activity of the
C-H-ras oncogen. Nature, 1988;334(6178):119-124
5 Manam S, Storer RD, Prahalada S, Leander KR, Kraynak AR, Ledwith BJ, et al. Activation of the H-ras, Ki-, and N-ras genes
on chemically induced liver tumor from CD-1 mice. Cancer Res, 1992;52(12):3347-3352
, 百拇医药
6 Challen C, Guo K, Collier JD, et al. Infrequent point mutation in codon 12 and 61 of ras oncogenes in human
hepatocellular carcinomas. J Hepatol, 1992;14(2～3):342-346
7 Paterlini P, Poussin K. Kew M, et al. Selective accumulation of the X transcript of hepatitis B virus in patients negative for
hepatitis B surface antigen with hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1995;21(2):313-321, http://www.100md.com(杜清书 房殿春 罗元辉 鲁 荣 刘为纹)