雷抑素对大鼠肝冷缺血再灌注损伤的保护作用
1解放军81医院肿瘤外科 江苏省南京市 210002
2长海医院肝胆外科研究所 上海市 200433
作者简介 王轩，男，1965-05-12生，江苏省扬州市人，汉族. 1986年上海第二军医大学医疗系毕业，肝胆外科硕士，主治医师，主要从事肝胆及消化道肿瘤的外科治疗和研究[江苏省南京市杨公井34标34号. 电话(025)6648090-533].(收稿 1997-01-16 修回 1997-03-16)
Protective effects of leflunomide on hepatic cold ischemic reperfusion liver injury in rats
, 百拇医药 WANG Xuan1, YANG Ja-Mei2, YIN Guang-Fu1, XU Zhen-Chang1, YAN Yi-Qun2 and WU Meng-Chao2
1Department of Oncological Surgery, Chinese PLA 81 Hospital, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
2Hepatobiliary Research Institute, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China
Subject headings isoxazoles/pharmacology; liver transplantation; reperfusion injury/prevention & control; liver/blood supply
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the effect of leflunomide on hepatic cold ischemic reperfusion injury in rats.
METHODS Male SD rats were randomly divided into donor-treated (group 1, n=34), recipient-treated (group 2, n=34) and untreated groups(group 3, n=34) to establish orthotopic liver transplantation models. In each group, 10 rats were used for observing survival rate and 24 for liver specimen-taking. The donors in each group were stored at 4℃ with Ringers′ solution and transplanted to the recipients. The effects of pretreatment with leflunomide on post-operative one week-survival rate, production of LPO and TNF, and liver histopathologic changes were observed.
, http://www.100md.com
RESULTS After transplantation, one week-survival rates for the 3 groups were 60%, 40% and 0%, respectively. There were little increase in the production of TNF and MDA (361.8mmol/g±15.4mmol/g) and pathological changes in group 1, while there were significant increase in TNF level (5.3kU/L±0.41kU/L) and MDA (484.6mmol/g,±23.6mmol/g), and the severest pathological changes in group 3; and the pathological changes and TNF level (2.3kU/L±0.32kU/L) and MDA (451.3mmol/g±18.9mmol/g) in group 2 were in between 3 hours after transplantation.
, 百拇医药
CONCLUSION Leflunomide pretreatment to recipients has a protecting effect for the liver cold ischemic reperfusion injury in rats.
主题词 异恶唑类/药理学； 肝移植； 再灌注损伤/预防和控制； 肝/血液供给
中国图书资料分类号 R657.3
摘要
目的 探讨雷抑素对大鼠肝冷缺血再灌注损伤的影响.
, 百拇医药
方法 雄性SD大鼠102只，随机分为受体用药、供体用药及不用药组，各34只，其中10只用于观察存活期，24只用于取材. 以SD大鼠为供受体，建立供肝在4℃平衡液中保存6h后再植入受体的大鼠原位肝移植模型，观察受体术前应用雷抑素对大鼠肝移植术后1周存活率、LPO和TNF的产生及对肝脏组织病理变化的影响.
结果 肝移植术后受体用药组、供体用药组及不用药组1周存活率分别为60%，40%及0%. 术后3h，受体用药组血浆TNF几乎测不出，肝组织MDA(361.8mmol/g±15.4mmol/g)无明显改变，肝组织病理变化最轻；不用药组血浆TNF(5.3kU/L±0.41kU/L)及肝MDA(484.6mmol/g±23.6mmol/g)显著升高，肝组织病理变化最重；供体用药组血浆TNF(2.3kU/L±0.32kU/L)，肝MDA(451.3mmol/g±18.9mmol/g)及病理变化均介于两者之间.
, http://www.100md.com
结论 肝移植术前受体应用雷抑素对肝冷缺血再灌注损伤有保护作用.
我们从1995年5月～1996年8月，利用移植肝长时间冷保存后再植入的大鼠原位肝移植模型，探讨移植术前应用雷抑素(leflunomide, Lef)对肝冷缺血性再灌注损伤的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性健康SD大鼠102只，体重180g～200g，随机配对为供受体，并分为供体用药组、受体用药组和不用药组. 各组有大鼠17对，其中5对用于观察存活期，另12对用于取材. 各组供肝取出后，均置于4℃平衡液中保存6h再植入受体. 不用药组受体术前3d连续口服1%羧甲基纤维素1ml/d；受体用药组受体术前3d连续口服Lef 10mg/(kg·d)；供体用药组供体术前3d连续口服Lef 10mg/(kg·d). Lef溶于1%羧甲基纤维素中(Lef由第二军医大学药学院合成). 大鼠原位肝移植模型参照改良Kamada法[1，2]进行.
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1.2 方法 各组用于取材大鼠于术后1h和2h经尾静脉采血0.5ml，同时经阴茎背静脉补入等量平衡液，每只大鼠采血不超过1次. 术后3h,24h各处死7只和5只取材并取血. 另取16只正常大鼠肝行门静脉灌注，分别作为6h冷保存肝及新鲜肝用于测定丙二醛. 血清TNF活性测定采用L929细胞为靶细胞结晶紫法[3]. 肝组织丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[4]. 取再灌注后3h各组肝右叶固定部位肝组织分别以10%中性福尔马林和4%戊二醛固定，行光镜和电镜检查.
统计学处理 所有数据以x±s表示，以t检验进行分析.
2 结果
2.1 大鼠1周存活情况及肝组织MDA水平 表1，2. 血清TNF活性表3. 原位肝移植术后，不用药组血清TNF活性(kU/L,以下同)迅速上升，术后2h达高峰(7.9±0.64)，3h下降(5.3±0.41)，至24h一直维持在低水平. 供体用药组血清TNF在术后3h(2.3±0.23)有轻度升高. 而受体用药组除术后2h(1.1±0.11)外，其余时间几乎测不出，血清TNF活性显著低于不用药组(P<0.01).
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表1 Lef对大鼠肝冷保存后移植存活的影响(n=5)
表2 保存6h肝再灌注后3h肝组织中MDA水平变化(x±s)
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bP<0.01， vs 不用药及供体用药组.
表3 大鼠肝移植术后血清TNF水平变化(x±s, kU/L)
, 百拇医药
cP<0.01， vs 不用药组及供体用药组.
2.2 光镜检查 不用药组：肝小叶结构紊乱，肝细胞浊肿变性，并可见灶性坏死伴大量炎细胞浸润，肝窦内皮细胞肿胀，脱落入肝窦. 供体用药组：部分肝细胞浊肿脂肪变性，小叶汇管区有炎细胞浸润，伴点状坏死，但程度较对照组轻. 受体用药组：肝小叶结构基本正常，肝板规则，炎细胞浸润少，肝窦内皮细胞扁平，完整.
2.3 电镜检查 不用药组：线粒体肿胀，嵴结构不清，内质网扩张成泡状，窦内皮细胞多数缺损或消失. 供体用药组：肝细胞水肿，部分含脂滴，线粒体轻度肿胀，嵴减少. 肝窦内皮细胞缺损或不连续. 受体用药组：线粒体和粗面内质网结构清晰，窦内皮细胞基本完整，狄氏间隙有少量短的肝细胞微绒毛伸入.
3 讨论
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Lef是一种新型免疫抑制剂，除可致同种移植物长期存活外，还具有抗炎、拮抗包括IL-2，IL-6，TNF等多种细胞因子活性的特点[5]. 由于大鼠肝脏在4℃平衡液中安全时限为2h～4h，至今尚无大鼠供肝在平衡液中保存6h后能移植成活的报道[6]. 为探讨Lef对肝冷缺血再灌注损伤是否有保护性作用，我们在实验中采用将供肝于移植术前置4℃平衡液中保存6h再移植入受体的大鼠肝移植模型，观察Lef对大鼠移植术后存活率、脂质过氧化物及TNF产生的影响. 实验表明，Lef确有保护和减轻大鼠肝冷缺血再灌注损伤的作用. 一方面，Lef可显著提高肝冷保存移植术后大鼠1周存活率. 在本组实验中，不用药组大鼠均于术后2d内死于肝功衰竭，1周存活率为0%，而受体用药及供体用药组大鼠术后1周存活率则分别达到了60%和40%. 对再灌注后3h肝组织光镜和电镜检查也显示，肝脏病理变化程度以不用药组最重，供体用药组次之，受体用药组最轻. 另一方面，Lef对直接导致冷缺血再灌注损伤的TNF及脂质过氧化物的产生亦有明显的抑制作用. 与移植术前相比，供体用药组及不用药组术后血清TNF及MDA均有明显升高(P<0.01)，而受体用药组则几乎无变化，这也与大鼠术后存活率的高低及肝组织病理变化相一致. 鉴于肝Kupffer细胞是人体内最大巨噬细胞停留群，又是缺血再灌注损伤过程中产生活性氧和TNF的主要来源. 因此，我们认为Lef抑制TNF和MDA的产生可能是通过抑制肝Kupffer细胞活化这一间接途径实现的. 由于Lef本身可能对肝细胞有一定毒性，在实验中还可观察到，供体用药组肝细胞脂肪变性较明显，从抑制脂质过氧化物产生及肝细胞保存完好性来看，供体用药组效果介于不用药组及受体用药组之间.
, 百拇医药
本实验表明，肝移植术前受体常规应用Lef，对肝冷缺血再灌注损伤有一定的保护性作用. 而抑制肝Kupffer细胞活化，抑制脂质过氧化物和TNF的产生，拮抗包括TNF在内的多种细胞因子活性可能是Lef发挥其保护和减轻肝冷缺血再灌注损伤的重要作用途径.
4 参考文献
1 Kamada N, Calne RY. Orthotopic liver transplantation in the rat: Techniques using cuff for portal vein anastomosis and biliary
drainage. Transplantation, 1979;28(1):47-51
2 严以群，杨甲梅，王轩，等. 大鼠减体积性肝移植模型. 中华器官移植杂志，1996；17(1)：55-58
, 百拇医药
3 Ruff M, Gifford GE. Rabbit tumor necrosis factor: mechanism of action. Infect Immun, 1981;31(3):380-381
4 Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animals tissue by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem,
1979;95(2):351-353
5 王轩. 免疫抑制剂雷抑素研究进展(综述). 国外医学创伤与外科基本问题分册，1996；17(4)：204-207
6 Sumimoto R, Jamieson NV, Wake K, et al. 24-hour rat liver preservation using UW solution and some simplified
variants. Transplantation, 1989;48(1):144-146, 百拇医药(王 轩1 杨甲梅2 殷广福1 许正昌1 严以群2 吴孟超2)
2长海医院肝胆外科研究所 上海市 200433
作者简介 王轩，男，1965-05-12生，江苏省扬州市人，汉族. 1986年上海第二军医大学医疗系毕业，肝胆外科硕士，主治医师，主要从事肝胆及消化道肿瘤的外科治疗和研究[江苏省南京市杨公井34标34号. 电话(025)6648090-533].(收稿 1997-01-16 修回 1997-03-16)
Protective effects of leflunomide on hepatic cold ischemic reperfusion liver injury in rats
, 百拇医药 WANG Xuan1, YANG Ja-Mei2, YIN Guang-Fu1, XU Zhen-Chang1, YAN Yi-Qun2 and WU Meng-Chao2
1Department of Oncological Surgery, Chinese PLA 81 Hospital, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
2Hepatobiliary Research Institute, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China
Subject headings isoxazoles/pharmacology; liver transplantation; reperfusion injury/prevention & control; liver/blood supply
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the effect of leflunomide on hepatic cold ischemic reperfusion injury in rats.
METHODS Male SD rats were randomly divided into donor-treated (group 1, n=34), recipient-treated (group 2, n=34) and untreated groups(group 3, n=34) to establish orthotopic liver transplantation models. In each group, 10 rats were used for observing survival rate and 24 for liver specimen-taking. The donors in each group were stored at 4℃ with Ringers′ solution and transplanted to the recipients. The effects of pretreatment with leflunomide on post-operative one week-survival rate, production of LPO and TNF, and liver histopathologic changes were observed.
, http://www.100md.com
RESULTS After transplantation, one week-survival rates for the 3 groups were 60%, 40% and 0%, respectively. There were little increase in the production of TNF and MDA (361.8mmol/g±15.4mmol/g) and pathological changes in group 1, while there were significant increase in TNF level (5.3kU/L±0.41kU/L) and MDA (484.6mmol/g,±23.6mmol/g), and the severest pathological changes in group 3; and the pathological changes and TNF level (2.3kU/L±0.32kU/L) and MDA (451.3mmol/g±18.9mmol/g) in group 2 were in between 3 hours after transplantation.
, 百拇医药
CONCLUSION Leflunomide pretreatment to recipients has a protecting effect for the liver cold ischemic reperfusion injury in rats.
主题词 异恶唑类/药理学； 肝移植； 再灌注损伤/预防和控制； 肝/血液供给
中国图书资料分类号 R657.3
摘要
目的 探讨雷抑素对大鼠肝冷缺血再灌注损伤的影响.
, 百拇医药
方法 雄性SD大鼠102只，随机分为受体用药、供体用药及不用药组，各34只，其中10只用于观察存活期，24只用于取材. 以SD大鼠为供受体，建立供肝在4℃平衡液中保存6h后再植入受体的大鼠原位肝移植模型，观察受体术前应用雷抑素对大鼠肝移植术后1周存活率、LPO和TNF的产生及对肝脏组织病理变化的影响.
结果 肝移植术后受体用药组、供体用药组及不用药组1周存活率分别为60%，40%及0%. 术后3h，受体用药组血浆TNF几乎测不出，肝组织MDA(361.8mmol/g±15.4mmol/g)无明显改变，肝组织病理变化最轻；不用药组血浆TNF(5.3kU/L±0.41kU/L)及肝MDA(484.6mmol/g±23.6mmol/g)显著升高，肝组织病理变化最重；供体用药组血浆TNF(2.3kU/L±0.32kU/L)，肝MDA(451.3mmol/g±18.9mmol/g)及病理变化均介于两者之间.
, http://www.100md.com
结论 肝移植术前受体应用雷抑素对肝冷缺血再灌注损伤有保护作用.
我们从1995年5月～1996年8月，利用移植肝长时间冷保存后再植入的大鼠原位肝移植模型，探讨移植术前应用雷抑素(leflunomide, Lef)对肝冷缺血性再灌注损伤的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性健康SD大鼠102只，体重180g～200g，随机配对为供受体，并分为供体用药组、受体用药组和不用药组. 各组有大鼠17对，其中5对用于观察存活期，另12对用于取材. 各组供肝取出后，均置于4℃平衡液中保存6h再植入受体. 不用药组受体术前3d连续口服1%羧甲基纤维素1ml/d；受体用药组受体术前3d连续口服Lef 10mg/(kg·d)；供体用药组供体术前3d连续口服Lef 10mg/(kg·d). Lef溶于1%羧甲基纤维素中(Lef由第二军医大学药学院合成). 大鼠原位肝移植模型参照改良Kamada法[1，2]进行.
, http://www.100md.com
1.2 方法 各组用于取材大鼠于术后1h和2h经尾静脉采血0.5ml，同时经阴茎背静脉补入等量平衡液，每只大鼠采血不超过1次. 术后3h,24h各处死7只和5只取材并取血. 另取16只正常大鼠肝行门静脉灌注，分别作为6h冷保存肝及新鲜肝用于测定丙二醛. 血清TNF活性测定采用L929细胞为靶细胞结晶紫法[3]. 肝组织丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[4]. 取再灌注后3h各组肝右叶固定部位肝组织分别以10%中性福尔马林和4%戊二醛固定，行光镜和电镜检查.
统计学处理 所有数据以x±s表示，以t检验进行分析.
2 结果
2.1 大鼠1周存活情况及肝组织MDA水平 表1，2. 血清TNF活性表3. 原位肝移植术后，不用药组血清TNF活性(kU/L,以下同)迅速上升，术后2h达高峰(7.9±0.64)，3h下降(5.3±0.41)，至24h一直维持在低水平. 供体用药组血清TNF在术后3h(2.3±0.23)有轻度升高. 而受体用药组除术后2h(1.1±0.11)外，其余时间几乎测不出，血清TNF活性显著低于不用药组(P<0.01).
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表1 Lef对大鼠肝冷保存后移植存活的影响(n=5)
| 分 组 | 保存时间(h) | 存活天数(d) | 1周存活率% |
| 不用药组 | 6 | 1，2， 2， 2， 1 | 0.0 |
| 供体用药组 | 6 | 2，1， 3，>7，>7 | 40.0 |
| 受体用药组 | 6 | 2，5，>7，>7，>7 | 60.0 |
表2 保存6h肝再灌注后3h肝组织中MDA水平变化(x±s)
| 分组 | n | MDA(mmol/g, wet, wt) |
| 不用药组 | 7 | 484.6±23.6 |
| 受体用药组 | 7 | 361.8±15.4b |
| 供体用药组 | 7 | 451.3±18.9 |
| 6h—保存肝 | 8 | 383.5±17.7 |
| 新鲜肝 | 8 | 354.1±13.4 |
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bP<0.01， vs 不用药及供体用药组.
表3 大鼠肝移植术后血清TNF水平变化(x±s, kU/L)
| 分 组 | n | 肝移植术后时间(h) | |||
| 1 | 2 | 3 | 24 | ||
| 不用药组 | 7 | 5.7±0.62 | 7.9±0.64 | 5.3±0.41 | 5.8±0.72 |
| 受体用药组 | 7 | 1.1±0.14c | 1.8±0.19c | 0.9±0.11c | 0.76±0.08c |
| 供体用药组 | 7 | 1.9±0.37 | 3.6±0.45 | 2.3±0.23 | 2.1±0.31 |
, 百拇医药
cP<0.01， vs 不用药组及供体用药组.
2.2 光镜检查 不用药组：肝小叶结构紊乱，肝细胞浊肿变性，并可见灶性坏死伴大量炎细胞浸润，肝窦内皮细胞肿胀，脱落入肝窦. 供体用药组：部分肝细胞浊肿脂肪变性，小叶汇管区有炎细胞浸润，伴点状坏死，但程度较对照组轻. 受体用药组：肝小叶结构基本正常，肝板规则，炎细胞浸润少，肝窦内皮细胞扁平，完整.
2.3 电镜检查 不用药组：线粒体肿胀，嵴结构不清，内质网扩张成泡状，窦内皮细胞多数缺损或消失. 供体用药组：肝细胞水肿，部分含脂滴，线粒体轻度肿胀，嵴减少. 肝窦内皮细胞缺损或不连续. 受体用药组：线粒体和粗面内质网结构清晰，窦内皮细胞基本完整，狄氏间隙有少量短的肝细胞微绒毛伸入.
3 讨论
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Lef是一种新型免疫抑制剂，除可致同种移植物长期存活外，还具有抗炎、拮抗包括IL-2，IL-6，TNF等多种细胞因子活性的特点[5]. 由于大鼠肝脏在4℃平衡液中安全时限为2h～4h，至今尚无大鼠供肝在平衡液中保存6h后能移植成活的报道[6]. 为探讨Lef对肝冷缺血再灌注损伤是否有保护性作用，我们在实验中采用将供肝于移植术前置4℃平衡液中保存6h再移植入受体的大鼠肝移植模型，观察Lef对大鼠移植术后存活率、脂质过氧化物及TNF产生的影响. 实验表明，Lef确有保护和减轻大鼠肝冷缺血再灌注损伤的作用. 一方面，Lef可显著提高肝冷保存移植术后大鼠1周存活率. 在本组实验中，不用药组大鼠均于术后2d内死于肝功衰竭，1周存活率为0%，而受体用药及供体用药组大鼠术后1周存活率则分别达到了60%和40%. 对再灌注后3h肝组织光镜和电镜检查也显示，肝脏病理变化程度以不用药组最重，供体用药组次之，受体用药组最轻. 另一方面，Lef对直接导致冷缺血再灌注损伤的TNF及脂质过氧化物的产生亦有明显的抑制作用. 与移植术前相比，供体用药组及不用药组术后血清TNF及MDA均有明显升高(P<0.01)，而受体用药组则几乎无变化，这也与大鼠术后存活率的高低及肝组织病理变化相一致. 鉴于肝Kupffer细胞是人体内最大巨噬细胞停留群，又是缺血再灌注损伤过程中产生活性氧和TNF的主要来源. 因此，我们认为Lef抑制TNF和MDA的产生可能是通过抑制肝Kupffer细胞活化这一间接途径实现的. 由于Lef本身可能对肝细胞有一定毒性，在实验中还可观察到，供体用药组肝细胞脂肪变性较明显，从抑制脂质过氧化物产生及肝细胞保存完好性来看，供体用药组效果介于不用药组及受体用药组之间.
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本实验表明，肝移植术前受体常规应用Lef，对肝冷缺血再灌注损伤有一定的保护性作用. 而抑制肝Kupffer细胞活化，抑制脂质过氧化物和TNF的产生，拮抗包括TNF在内的多种细胞因子活性可能是Lef发挥其保护和减轻肝冷缺血再灌注损伤的重要作用途径.
4 参考文献
1 Kamada N, Calne RY. Orthotopic liver transplantation in the rat: Techniques using cuff for portal vein anastomosis and biliary
drainage. Transplantation, 1979;28(1):47-51
2 严以群，杨甲梅，王轩，等. 大鼠减体积性肝移植模型. 中华器官移植杂志，1996；17(1)：55-58
, 百拇医药
3 Ruff M, Gifford GE. Rabbit tumor necrosis factor: mechanism of action. Infect Immun, 1981;31(3):380-381
4 Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animals tissue by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem,
1979;95(2):351-353
5 王轩. 免疫抑制剂雷抑素研究进展(综述). 国外医学创伤与外科基本问题分册，1996；17(4)：204-207
6 Sumimoto R, Jamieson NV, Wake K, et al. 24-hour rat liver preservation using UW solution and some simplified
variants. Transplantation, 1989;48(1):144-146, 百拇医药(王 轩1 杨甲梅2 殷广福1 许正昌1 严以群2 吴孟超2)