鼠溃疡性结肠炎模型的观察
湖北医科大学附属第二医院消化内科 湖北省武汉市 430071
作者简介 易季云，女，1942-06-28生，湖南省长沙市人，汉族. 1964年湖南常德医专医疗系毕业.
副教授，消化内科主任. 主要从事胃肠病的诊治研究，发表论文10篇.(收稿 1997-04-02)
Observation of experimental model of ulcerative colitis in rats
YI Ji-Yun, XIA Bing, HUANG Mei-Fang, FU Ning and DENG Chang-Sheng
Department of Gastroenterology, The Second Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430071, Hubei Province, China
, 百拇医药
Subject headings colitis, ulcerative/pathology; disease models, animal; T-lymphocytes, cytotoxic
Abstract
AIM To evaluate the ulcerative colitis model of fetal colon implants in syngenic adult rats.
METHODS Implant the fetal colon into renal capsule of syngenic adult rats and observe the histologic changes of the colon and the cytotoxicity index of cardiac blood lymphocytes or colonic mucosal lymphocytes against autologous colonic epithelial cells in experimental rats by the microcytotoxicity method.
, 百拇医药
RESULTS When the fetal colon was successfully implanted under renal capsule in 27 syngenic adult rats, the immunorejection occurred in the implanted fetal colon after 7 days by mucosal inflammation and ulceration. Autoimmune reaction was also observed in the colon of the recipient rats by the increase of lymphoid follicles and infiltration of inflammatory cells. The cytotoxicity index of cardiac blood lymphocytes or colonic mucosal lymphocytes against autologous colonic epithelial cells was 41.6%±3.8% or 38.4%±2.1% vs 8.2%±1.9% or 7%±1.7% in 27 experimental rats and 15 rats of normal controls (P<0.01, respectively).
, 百拇医药
CONCLUSION Implantation of fetal colon into the renal capsule of syngenic adult rats can reduce colonic inflammation similar to human ulcerative colitis and the cytotoxicity of lymphocytes against autologous colon may play an important role in cellular immune reaction.
主题词 结肠炎，溃疡性/病理学； 疾病模型，动物； T淋巴细胞，细胞毒性
中国图书资料分类号 R574.62
摘要
, 百拇医药
目的 评价胎鼠结肠植入同系成年鼠所致溃疡性结肠炎(UC)模型.
方法 将胎鼠结肠植入同系鼠肾包膜下，观察胎鼠结肠和成年鼠结肠的组织学变化，并且采用微量细胞毒方法检查心脏血淋巴细胞或肠粘膜淋巴细胞对自身结肠上皮细胞的细胞毒指数.
结果 胎鼠结肠成功地植入27只同系成年鼠的肾包膜下，7d后植入的胎鼠结肠出现免疫排斥反应，表现为粘膜炎症和溃疡形成. 还观察到宿主鼠结肠的自身免疫反应，表现为淋巴滤泡增多和炎性细胞浸润. 27只实验鼠的心脏血淋巴细胞或结肠粘膜淋巴细胞对自身结肠上皮细胞的细胞毒指数分别为41.6%±3.8%，38.4%±2.1%，而15只正常对照鼠的相应指数分别为8.2%±1.9%，7.0%±1.7%，两者间的差异有显著性意义
(P<0.01).
, http://www.100md.com
结论 胎鼠结肠植入同系成年鼠能导致类似于UC的变化，其中淋巴细胞对自身结肠的细胞毒作用在细胞免疫反应中可能起重要作用.
溃疡性结肠炎(UC)的病因不明. 为了研究其病因、发病机理、诊断和治疗，有必要建立一个UC的实验动物模型. 在这里我们报告关于胎鼠结肠植入同系成年鼠肾包膜下引起鼠结肠粘膜炎性溃疡变化的研究. 我们还测定了宿主鼠和对照鼠的体外心脏血淋巴细胞(HBL)和结肠粘膜淋巴细胞(CML)对结肠上皮细胞(CEC)的细胞毒活性.
1 材料和方法
1.1 建立鼠UC模型 按照Ceredig等[1]的方法将14d～16d鼠龄的Spraque-Da-Nley鼠的结肠植入同系成年鼠(5月～6月鼠龄，重250g～400g)的右肾包膜下. 27只植入成功的宿主鼠分成3组，分别在7，14和21d处死. 15只鼠在同样的喂养条件下作为正常对照组. 收集5ml～10ml心脏血液，植入的胎鼠结肠以及宿主鼠和对照鼠的结肠. 心脏血用于心脏血淋巴细胞(HBL)的分离. 部分结肠样本脱水、包埋和切成6μm厚的病理切片，HE染色后供光学显微镜观察. 其余的宿主鼠和对照鼠的结肠样本用于CML和CEC分离.
, 百拇医药
1.2 HBL、CML和CEC分离 参照Zhang等[2]用Ficoll-Hypaque梯度分离法分离肝素化的心脏血单个核细胞. 用玻璃粘附法去掉单核细胞和巨噬细胞[3]. 用TcA溶液(Tc199，日本Nissui制药厂，用10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素等制成，将淋巴细胞浓度调整到1×106/ml，成活细胞在95%以上. 参照Kemler等[4]的方法分离CEC，CEC浓度调节到1×105/ml，成活上皮细胞在89%以上.
1.3 细胞毒研究 用Shorter等[5]的方法估计HBL和CML相对于CEC靶细胞的细胞毒活性. 简言之，微测定板加以1×105/ml浓度的CEC，加到150μl/孔，在37℃和5% CO2及95% O2的环境下培养12h. 去掉上清液和粘附在微测定板壁的CEC. 然后加入150μl/孔的HBL和CML，效应细胞对靶细胞的比例为100∶1. 自发去掉的靶细胞(CEC)孔只加TcA培养液. 最大去除的靶细胞(CEC)孔加入双蒸水，将所有的样品做成3份，总培养体积为0.3ml. pH值调到7.2在37℃下继续培养12h. 最后用Hank溶液去掉未粘附在微测定板壁上的CEC，留下粘附在壁上的靶细胞(CEC)在相差显微镜下计数. 按下式计算细胞毒指数：细胞毒指数(%)=实验去掉的靶细胞-自发去掉的靶细胞 / 最大去掉的靶细胞-自发去掉的靶细胞×100%.
, 百拇医药
用t检验比较溃疡性结肠炎组和对照组的细胞毒指数.
2 结果
2.1 病理组织观察 植入7d后有8只鼠的胎结肠有炎症细胞浸润，一些粘膜腺体和上皮细胞脱落，粘膜变薄. 移植物肠腔内有大量的粘液，它压迫组织并导致囊腔形成. 到14d，10只鼠的这些变化更加严重. 所有的粘膜都受到破坏，腺体数量减少，肠腔内有大量的坏死物质，淋巴细胞和单核细胞浸润从粘膜肌层扩展到浆膜层. 到21d，9只鼠的结肠壁变厚，并被透明样物和结缔组织取代，剩下的腺窝萎缩和变性. 某些结肠样本的所有腺体全部消失并被结缔组织、坏死物质和炎性渗出物所取代. 所有的宿主结肠样本都有某种程度的病理变化. 在结肠粘膜上淋巴滤泡占优势. 粘膜和上皮有炎性细胞浸润，并在某个时候脱落，最后出现糜烂和溃疡.
2.2 细胞毒性 宿主鼠和对照鼠的HBL和MCL对CEC靶细胞的细胞毒活性如表1所示. 实验性肠炎的HBL和MCL的细胞毒活性指数明显高于正常对照鼠.
, http://www.100md.com
表1 胎鼠结肠植入鼠和对照鼠的HBL和MCL对CEC的细胞毒活性
bP<0.01， vs 对照组.
3 讨论
本研究表明，植入的胎鼠结肠对成年同系鼠是一种免疫原，引起宿主鼠的一系列免疫反应，我们观察到胎鼠结肠的粘膜肌层和浆膜层被淋巴细胞和单核细胞浸润，粘膜上皮细胞脱落，在肠腔内有大量的粘液素，到21d粘膜腺体萎缩. 植入胎鼠结肠的组织病理特性与Ceredig和Naim等[1，6]的报道相似. 然而我们还观察了宿主鼠的结肠，固有层也有炎性细胞浸润，突出特点是淋巴样滤泡，有时粘膜出现糜烂和溃疡. 这些变化表明，在宿主结肠和植入胎鼠结肠间存在交叉抗原. 对胎鼠结肠抗原的免疫反应激发了宿主鼠抗结肠免疫反应. 在另一篇报告中[7]， 我们发现了在移植7d后所有宿主鼠的血清中存在抗植入胎鼠结肠的阳性抗体. 有趣的是大多数同系宿主鼠同时在血清中也有抗自身结肠的阳性抗体. 我们现在的研究表明，宿主鼠HBL和CML对CEC的细胞毒活性比对照鼠的高得多. 这表明细胞免疫除了体液免疫外，细胞免疫在这个UC模型中起了重要作用. UC患者淋巴细胞增高可能与T细胞毒性或抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)和自发性细胞介导细胞毒(ScMC)有关. 我们用淋巴细胞胰蛋白酶化方法发现在这个动物模型中引起结肠损害的是ADCC[8].
, 百拇医药
本文结果证实了Ceredig等描述的同系成年鼠胎鼠结肠植入UC模型，我们还观察到体外HBL和CML对CEC的高细胞毒性，这些可能有助于了解人类UC的发病机理.
4 参考文献
1 Ceredig R, Henderson DC, Naim RC. Experimental model of ulcerative colitis. Nature, 1977;266(1):74-75
2 上海市医学化验所主编. 临床免疫学检验. 上册. 上海：上海科学技术出版社，1983：16-18，20-23
3 Bartnik W, Remine SG, Chiba M, et al. Isolation and characterization of colonic intraepithelial and lamina proprial
, http://www.100md.com
lymphocytes. Gastroenterology, 1980;18(6):976-984
4 Kemler BJ. Inflammatory lower disease: study of cell mediated cytotoxicity for isolated human colonic epithelial cell.
Gut, 1980;21(2):353-359
5 Shorter RG, McGill DB, Bahn RC. Cytotoxicity of mononuclear cells for autologous colonic epithelial cells in colonic
disease.Gastroenterology, 1984;86(1):13-22
, 百拇医药
6 Naim RC, Savvas R, Hocking G, et al. Animal model: immunoreactive inflammation in retal colon implants in syngeneic adult
rats. Am J Pathol, 1979;96(4):647-650
7 刘知惠，王志洁，代文本，等. 溃疡性结肠炎的大白鼠模型观察. 中华消化杂志，1988；8(5)：291-292
8 黄梅芳，付苓. 溃疡性结肠炎的细胞毒实验研究及临床探讨. 中华消化杂志，1990；10(5)：268-270, 百拇医药(易季云 夏 冰 黄梅芳 傅 苓 邓长生)
作者简介 易季云，女，1942-06-28生，湖南省长沙市人，汉族. 1964年湖南常德医专医疗系毕业.
副教授，消化内科主任. 主要从事胃肠病的诊治研究，发表论文10篇.(收稿 1997-04-02)
Observation of experimental model of ulcerative colitis in rats
YI Ji-Yun, XIA Bing, HUANG Mei-Fang, FU Ning and DENG Chang-Sheng
Department of Gastroenterology, The Second Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430071, Hubei Province, China
, 百拇医药
Subject headings colitis, ulcerative/pathology; disease models, animal; T-lymphocytes, cytotoxic
Abstract
AIM To evaluate the ulcerative colitis model of fetal colon implants in syngenic adult rats.
METHODS Implant the fetal colon into renal capsule of syngenic adult rats and observe the histologic changes of the colon and the cytotoxicity index of cardiac blood lymphocytes or colonic mucosal lymphocytes against autologous colonic epithelial cells in experimental rats by the microcytotoxicity method.
, 百拇医药
RESULTS When the fetal colon was successfully implanted under renal capsule in 27 syngenic adult rats, the immunorejection occurred in the implanted fetal colon after 7 days by mucosal inflammation and ulceration. Autoimmune reaction was also observed in the colon of the recipient rats by the increase of lymphoid follicles and infiltration of inflammatory cells. The cytotoxicity index of cardiac blood lymphocytes or colonic mucosal lymphocytes against autologous colonic epithelial cells was 41.6%±3.8% or 38.4%±2.1% vs 8.2%±1.9% or 7%±1.7% in 27 experimental rats and 15 rats of normal controls (P<0.01, respectively).
, 百拇医药
CONCLUSION Implantation of fetal colon into the renal capsule of syngenic adult rats can reduce colonic inflammation similar to human ulcerative colitis and the cytotoxicity of lymphocytes against autologous colon may play an important role in cellular immune reaction.
主题词 结肠炎，溃疡性/病理学； 疾病模型，动物； T淋巴细胞，细胞毒性
中国图书资料分类号 R574.62
摘要
, 百拇医药
目的 评价胎鼠结肠植入同系成年鼠所致溃疡性结肠炎(UC)模型.
方法 将胎鼠结肠植入同系鼠肾包膜下，观察胎鼠结肠和成年鼠结肠的组织学变化，并且采用微量细胞毒方法检查心脏血淋巴细胞或肠粘膜淋巴细胞对自身结肠上皮细胞的细胞毒指数.
结果 胎鼠结肠成功地植入27只同系成年鼠的肾包膜下，7d后植入的胎鼠结肠出现免疫排斥反应，表现为粘膜炎症和溃疡形成. 还观察到宿主鼠结肠的自身免疫反应，表现为淋巴滤泡增多和炎性细胞浸润. 27只实验鼠的心脏血淋巴细胞或结肠粘膜淋巴细胞对自身结肠上皮细胞的细胞毒指数分别为41.6%±3.8%，38.4%±2.1%，而15只正常对照鼠的相应指数分别为8.2%±1.9%，7.0%±1.7%，两者间的差异有显著性意义
(P<0.01).
, http://www.100md.com
结论 胎鼠结肠植入同系成年鼠能导致类似于UC的变化，其中淋巴细胞对自身结肠的细胞毒作用在细胞免疫反应中可能起重要作用.
溃疡性结肠炎(UC)的病因不明. 为了研究其病因、发病机理、诊断和治疗，有必要建立一个UC的实验动物模型. 在这里我们报告关于胎鼠结肠植入同系成年鼠肾包膜下引起鼠结肠粘膜炎性溃疡变化的研究. 我们还测定了宿主鼠和对照鼠的体外心脏血淋巴细胞(HBL)和结肠粘膜淋巴细胞(CML)对结肠上皮细胞(CEC)的细胞毒活性.
1 材料和方法
1.1 建立鼠UC模型 按照Ceredig等[1]的方法将14d～16d鼠龄的Spraque-Da-Nley鼠的结肠植入同系成年鼠(5月～6月鼠龄，重250g～400g)的右肾包膜下. 27只植入成功的宿主鼠分成3组，分别在7，14和21d处死. 15只鼠在同样的喂养条件下作为正常对照组. 收集5ml～10ml心脏血液，植入的胎鼠结肠以及宿主鼠和对照鼠的结肠. 心脏血用于心脏血淋巴细胞(HBL)的分离. 部分结肠样本脱水、包埋和切成6μm厚的病理切片，HE染色后供光学显微镜观察. 其余的宿主鼠和对照鼠的结肠样本用于CML和CEC分离.
, 百拇医药
1.2 HBL、CML和CEC分离 参照Zhang等[2]用Ficoll-Hypaque梯度分离法分离肝素化的心脏血单个核细胞. 用玻璃粘附法去掉单核细胞和巨噬细胞[3]. 用TcA溶液(Tc199，日本Nissui制药厂，用10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素等制成，将淋巴细胞浓度调整到1×106/ml，成活细胞在95%以上. 参照Kemler等[4]的方法分离CEC，CEC浓度调节到1×105/ml，成活上皮细胞在89%以上.
1.3 细胞毒研究 用Shorter等[5]的方法估计HBL和CML相对于CEC靶细胞的细胞毒活性. 简言之，微测定板加以1×105/ml浓度的CEC，加到150μl/孔，在37℃和5% CO2及95% O2的环境下培养12h. 去掉上清液和粘附在微测定板壁的CEC. 然后加入150μl/孔的HBL和CML，效应细胞对靶细胞的比例为100∶1. 自发去掉的靶细胞(CEC)孔只加TcA培养液. 最大去除的靶细胞(CEC)孔加入双蒸水，将所有的样品做成3份，总培养体积为0.3ml. pH值调到7.2在37℃下继续培养12h. 最后用Hank溶液去掉未粘附在微测定板壁上的CEC，留下粘附在壁上的靶细胞(CEC)在相差显微镜下计数. 按下式计算细胞毒指数：细胞毒指数(%)=实验去掉的靶细胞-自发去掉的靶细胞 / 最大去掉的靶细胞-自发去掉的靶细胞×100%.
, 百拇医药
用t检验比较溃疡性结肠炎组和对照组的细胞毒指数.
2 结果
2.1 病理组织观察 植入7d后有8只鼠的胎结肠有炎症细胞浸润，一些粘膜腺体和上皮细胞脱落，粘膜变薄. 移植物肠腔内有大量的粘液，它压迫组织并导致囊腔形成. 到14d，10只鼠的这些变化更加严重. 所有的粘膜都受到破坏，腺体数量减少，肠腔内有大量的坏死物质，淋巴细胞和单核细胞浸润从粘膜肌层扩展到浆膜层. 到21d，9只鼠的结肠壁变厚，并被透明样物和结缔组织取代，剩下的腺窝萎缩和变性. 某些结肠样本的所有腺体全部消失并被结缔组织、坏死物质和炎性渗出物所取代. 所有的宿主结肠样本都有某种程度的病理变化. 在结肠粘膜上淋巴滤泡占优势. 粘膜和上皮有炎性细胞浸润，并在某个时候脱落，最后出现糜烂和溃疡.
2.2 细胞毒性 宿主鼠和对照鼠的HBL和MCL对CEC靶细胞的细胞毒活性如表1所示. 实验性肠炎的HBL和MCL的细胞毒活性指数明显高于正常对照鼠.
, http://www.100md.com
表1 胎鼠结肠植入鼠和对照鼠的HBL和MCL对CEC的细胞毒活性
| 分组 | n | 细胞毒活性 | |
| HBL | CML | ||
| 胎鼠结肠植入鼠 | 27 | 41.6±3.86 | 38.4±2.1b |
| 对照鼠 | 15 | 8.2±1.9 | 7.0±1.7 |
bP<0.01， vs 对照组.
3 讨论
本研究表明，植入的胎鼠结肠对成年同系鼠是一种免疫原，引起宿主鼠的一系列免疫反应，我们观察到胎鼠结肠的粘膜肌层和浆膜层被淋巴细胞和单核细胞浸润，粘膜上皮细胞脱落，在肠腔内有大量的粘液素，到21d粘膜腺体萎缩. 植入胎鼠结肠的组织病理特性与Ceredig和Naim等[1，6]的报道相似. 然而我们还观察了宿主鼠的结肠，固有层也有炎性细胞浸润，突出特点是淋巴样滤泡，有时粘膜出现糜烂和溃疡. 这些变化表明，在宿主结肠和植入胎鼠结肠间存在交叉抗原. 对胎鼠结肠抗原的免疫反应激发了宿主鼠抗结肠免疫反应. 在另一篇报告中[7]， 我们发现了在移植7d后所有宿主鼠的血清中存在抗植入胎鼠结肠的阳性抗体. 有趣的是大多数同系宿主鼠同时在血清中也有抗自身结肠的阳性抗体. 我们现在的研究表明，宿主鼠HBL和CML对CEC的细胞毒活性比对照鼠的高得多. 这表明细胞免疫除了体液免疫外，细胞免疫在这个UC模型中起了重要作用. UC患者淋巴细胞增高可能与T细胞毒性或抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)和自发性细胞介导细胞毒(ScMC)有关. 我们用淋巴细胞胰蛋白酶化方法发现在这个动物模型中引起结肠损害的是ADCC[8].
, 百拇医药
本文结果证实了Ceredig等描述的同系成年鼠胎鼠结肠植入UC模型，我们还观察到体外HBL和CML对CEC的高细胞毒性，这些可能有助于了解人类UC的发病机理.
4 参考文献
1 Ceredig R, Henderson DC, Naim RC. Experimental model of ulcerative colitis. Nature, 1977;266(1):74-75
2 上海市医学化验所主编. 临床免疫学检验. 上册. 上海：上海科学技术出版社，1983：16-18，20-23
3 Bartnik W, Remine SG, Chiba M, et al. Isolation and characterization of colonic intraepithelial and lamina proprial
, http://www.100md.com
lymphocytes. Gastroenterology, 1980;18(6):976-984
4 Kemler BJ. Inflammatory lower disease: study of cell mediated cytotoxicity for isolated human colonic epithelial cell.
Gut, 1980;21(2):353-359
5 Shorter RG, McGill DB, Bahn RC. Cytotoxicity of mononuclear cells for autologous colonic epithelial cells in colonic
disease.Gastroenterology, 1984;86(1):13-22
, 百拇医药
6 Naim RC, Savvas R, Hocking G, et al. Animal model: immunoreactive inflammation in retal colon implants in syngeneic adult
rats. Am J Pathol, 1979;96(4):647-650
7 刘知惠，王志洁，代文本，等. 溃疡性结肠炎的大白鼠模型观察. 中华消化杂志，1988；8(5)：291-292
8 黄梅芳，付苓. 溃疡性结肠炎的细胞毒实验研究及临床探讨. 中华消化杂志，1990；10(5)：268-270, 百拇医药(易季云 夏 冰 黄梅芳 傅 苓 邓长生)