雷公藤多甙对大鼠急性肝衰竭的保护作用*
山东医科大学 1传染病学教研室 山东省济南市 250021
2山东医科大学卫生化学教研室 3生物化学教研室 4病理学教研室
5现在山东省立医院职业病科
*本课题为山东省科委自然科学基金资助项目. 本文为作者学位论文，已于1997-06-12通过答辩.
作者简介 张兴国，男，1965-04-29生，山东省蒙阴县人，汉族. 1988年滨州医学院医学系本科毕业，1994年考取山东医科大学传染病学硕士研究生，将于1997年7月毕业. 主要从事病毒性肝炎的防治研究[山东省济南市文化西路44号. 电话(0531)2952424-556].(收稿 1997-07-10)
, 百拇医药
Protective effect of glycoside of Tripterygium wilfordii on acute experimental hepatic failure in rats
ZHANG Xing-Guo1, LU Min-He1, JIANG Hui-Min2, MA Li-Xian1, LU Tao3, JIA Yi-Tao1 and XU Fu-Yu4
Departments of1Infections Diseases, 2Health Chemistry, 3Biochemistry and 4Pathology, Shandong Medical University, Jinan 250012, Shandong Province, China
, 百拇医药
Subject headings liver failure, acute/zhong yi yao liao fa; Tripterygium wilfordii/therapeutic use; saponins/therapeutic use; disease models, animal
Abstract
AIM To evaluate the protective effect of glycoside of Tripterygium wilfordii (GTW) on experimental acute hepatic failure (AHF).
METHODS Twenty-four Wistar rats were randomly assigned to three groups: control group (n=8), AHF group and GTW protection group, GTW of 25mg/(kg·d) was given ig for 5 days to the GTW-protection group, while only normal saline in equal amount was given to the other groups for 5 days. On the 6th day, AHF and GTW groups were respectively administered with D-GalN of 1.6g/kg, ip after 12 hours fasting. Fourty hours later 30g/L natrii pentobarbitalum (40mg/kg) was given ip for anesthesia. Blood was drawn from the hearts to measure serum ALT, TB and T-cell subsets. The hepatic lesions were evaluated by light and electron microscopy.
, http://www.100md.com
RESULTS Serum amylase (IU/L) and TB levels (μmol/L) were much lower, OX8 cells much higher in GTW group than those in AHF group (359±54 vs 783±58， 47±35 vs 126±67， P<0.01; 43%±4% vs 14%±3%, P<0.05). Mitochondria swelled and injured, enchromatin highly aggregated in the former, but those in the latter were almost normal.
CONCLUSION GTW has a protective action on AHF.
主题词 肝功能衰竭，急性/中医药疗法；雷公藤/治疗应用；皂苷类/治疗应用；疾病模型，动物
, 百拇医药
中国图书资料分类号 R575.3
摘要
目的 探讨雷公藤多甙(GTW)对实验性肝衰竭的保护作用.
方法 雄性Wistar大鼠24只，随机分为对照组(n=8)，急性肝衰竭(AHF)组(n=8)和GTW保护组(n=8). GTW组在实验前5d GTW 25mg/(kg·d)经胃管灌胃，其余两组均以等量生理盐水溶液灌胃. 从第6天开始，AHF组和GTW组均在空腹12h后ip D-GalN 1.6g/kg，注射后40h，以30g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)ip麻醉，心脏抽血测定血清ALT，TB和T淋巴细胞亚群. 同时，在光镜和电镜下观察各组肝组织病理变化.
结果 AHF组ALT(IU/L)和TB(μmol/L)分别为782.8±57.62和125.627±67.027；OX8水平为14.0%±3%. GTW组ALT和TB分别为359±54和47±35；OX8为43%±4%. 两组比较有显著统计学差异(P<0.05或0.01). 同时，前者电镜下线粒体和内质网肿胀、破损，核内染色质凝聚，后者细胞器受损明显减轻.
, 百拇医药
结论 雷公藤多甙对实验性急性肝衰竭具有保护作用.
急性肝衰竭(acute hepatic failure, AHF)凶险，预后严重. 目前认为其发病机理与机体免疫亢进有关. 尚无特效药物治疗. 肾上腺糖皮质激素治疗可能有效，但副作用极大. 本实验观察了AHF动物外周血T淋巴细胞亚群的变化，探讨其在AHF中的发病学意义，并通过雷公藤多甙(glycoside of tripterygium wilfordii hook f, GTW)的防治作用，为临床治疗AHF提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性Wistar大鼠24只，体重250g～350g，由山东省防疫站提供. D-半乳糖胺(D-GalN)由重庆医科大学化学教研室提供，实验前用生理盐水配成100g/L的溶液，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.0. GTW由山东鲁南制药厂生产，用前用生理盐水溶解成25g/L. 抗大鼠T淋巴细胞亚群W3/25，OX8抗原mAb来自英国Serotec公司，4℃保存，用前PBS稀释到1∶20.
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1.2 方法 大鼠实验前禁食12h，自由饮水. 以D-GalN 1.6g/kg ip. 将大鼠24只随机分成3组. 第1组为正常对照组(n=8)；第2组为AHF组(n=8)；第3组为GTW保护组(n=8)：在造成AHF前经胃管灌服GTW 25mg/(kg·d)，共5d. 第1，2组均灌以等量生理盐水. 从第6天开始，继续应用GTW的同时ip D-GalN，注射40h后，以30g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)ip麻醉，心脏穿刺抽血处死动物，取全血1ml，肝素抗凝，应用FACScan流式细胞仪测定T细胞亚群. 余血离心(3000r/min，10min分离血清，-30℃保存，测定血清ALT和TB，同时留取肝脏标本，福尔马林固定，石蜡包埋5μm切片，HE染色. 另在AHF组和GTW组中各取1例，切取1mm×1mm×1mm肝组织，用30g/L戊二醛固定，超薄切片，铅-铀双重染色，H800型透射电镜观察细胞器的超微结构.
统计学处理 所有资料数据均在Foxbase中建立数据库，应用SAS软件进行统计分析，包括方差分析和Student-Newman-Keuls(SNK)法(Q检验)作均数间的两两比较. 用Pearson相关分析法进行相关分析，计算出Pearson相关系数. P≤0.05时认为有显著性差异.
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2 结果
2.1 血清ALT和TB 与对照组比较，AHF组ALT、TB水平均显著升高(P<0.01)；GTW组与AHF组比较，ALT、TB水平均显著降低
(P<0.05，表1).
2.2 外周血T淋巴细胞亚群 与对照组比较，AHF组OX8水平显著降低(P<0.05)；GTW与AHF组比较，OX8水平显著升高(P<0.05)，各组
W3/25水平无显著性差异(P>0.05，表1). 而且OX8细胞水平与ALT和TB水平呈显著负相关(r分别为-0.69732，-0.61321，P<0.01).
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表1 各组血ALT、TB和T细胞亚群(n=8,x±s)
, 百拇医药 aP<0.05，bP<0.01， vs AHF组；cP<0.05， vs 对照组.
2.3 肝组织病理 光镜观察：AHF组弥漫性肝细胞坏死，大量炎细胞浸润. GTW组肝组织病变明显减轻. 电镜观察：AHF组线粒体和内质网肿胀、破损、消失，核内染色质凝聚(图1)；GTW组细胞器损伤均明显减轻(图2).
图1 AHF组肝细胞线粒体和内质网肿胀、破损、消失，核内染色质高度凝聚、边集(×6400)
图2 GTW组肝细胞病变减轻，细胞器基本完好(×6400)
, 百拇医药
3 讨论
D-GalN为特异性肝毒物，它可与体内磷酸尿苷大量结合后形成稳定的尿苷衍生物，使UTP耗竭，引起RNA、糖蛋白和糖元合成障碍而造成肝细胞损伤[3]. 当肝细胞受损后，由于肝细胞自身抗原的暴露，引发了机体的自身免疫反应，从而促进肝细胞的死亡.
机体的免疫系统是一个复杂的网络系统，其中各种免疫细胞之间存在着十分复杂的联系. 特别是辅助性T细胞(Th)和抑制性T细胞(Ts)之间的比例平衡在免疫反应中起重要作用[4]. 本研究发现，AHF动物外周血T细胞亚群发生紊乱，OX8细胞(即Ts细胞)水平显著降低，而W3/25细胞(即Th细胞)水平无显著性差异，从而导致Th/Ts细胞比值升高. 当Ts细胞的功能低下时，机体免疫系统对自身抗原易于发生免疫应答[5]，造成肝细胞的进一步损伤. 另外，Ts细胞活性降低后，B细胞则可能脱离其控制，造成B细胞的功能亢进，抗体产生过多，导致肝细胞进一步破坏[5]. 故本组动物肝功能和肝细胞损害严重，从而提示，Th/Ts细胞的细微平衡在AHF的发生和发展中起关键作用.
, http://www.100md.com
本研究还发现，GTW保护组Ts细胞活性显著升高，且肝功能损害和肝细胞病变均明显减轻. 相关分析显示，OX8细胞水平与ALT和TB水平呈显著负相关. 表明GTW有改善Th/Ts细胞比例平衡和改善肝功能的作用. GTW是雷公藤根的提取精制品，系非甾体免疫抑制剂，具有与雷公藤相同的药理作用[6]， 但因仅含微量毒性物质二萜类，故其安全范围大大提高[7]. 据报道，GTW对细胞免疫和体液免疫均有较强的抑制作用[8，9]，对Ts细胞具有明显的激活作用[10]. 本研究有相似发现，由于Ts细胞具有抑制Th细胞活性和B细胞产生抗体的作用，故可减轻肝细胞的免疫损伤. 提示GTW用于重症肝炎的防治具有广阔的前景. 本实验从免疫学机理上证实了GTW对大鼠AHF的确有治疗作用.
, 百拇医药
4 参考文献
1 沈耕荣，余书文. 重症肝炎. 第1版. 天津：天津科学技术出版社，1990：25
2 沈耕荣，余书文. 重症肝炎. 第1版. 天津：天津科学技术出版社，1990：196
3 Decker K, Keppler D. Galactosamine hepatitis: Rey role of the nucleotide deficicency period in the pathogenesis of cell injury and
cell death. Reviews of physiology. Biochemistry and Parmacology, 1974;71(1):77-106
, 百拇医药
4 沈耕荣，余书文. 重症肝炎. 第1版. 天津：天津科学技术出版社，1990：97
5 王宝恩. 肝脏病学新进展——基础与临床. 第1版. 北京：北京出版社，1996：226
6 何礼芳，朱锡华，黄云辉，等. 雷公藤多甙对家兔急性实验性血清病实验性治疗的研究. 免疫学杂志，1991；7(4)：229-233
7 张晓群，来茶云，张肇和. 雷公藤多甙对小儿哮喘患者T淋巴细胞亚群的影响. 第一军医大学学报，1989；9(2)：102-105
8 Li XW, Weir MR. Radix tripterygium wilfordii A (Chinese herbal medicine) with potent immunosuppresive
properties. Transplantation, 1990;50(1):82-86
9 匡彦德，张骅，秦万章. 雷公藤对IL-2的产生和IL-2受体表达的控制作用. 上海免疫学杂志，1988；8(4)：250-253
10 吴俊，梁晓燕，杨奕，等. 雷公藤对Ly-22. 2+细胞(抑制性T淋巴细胞)的激活作用. 中国病理生理杂志，1996；12(1)：30-31, 百拇医药(张兴国1,5 吕敏和1 姜会敏2 马立宪1 吕 涛3 贾一韬1 许复郁4 )
2山东医科大学卫生化学教研室 3生物化学教研室 4病理学教研室
5现在山东省立医院职业病科
*本课题为山东省科委自然科学基金资助项目. 本文为作者学位论文，已于1997-06-12通过答辩.
作者简介 张兴国，男，1965-04-29生，山东省蒙阴县人，汉族. 1988年滨州医学院医学系本科毕业，1994年考取山东医科大学传染病学硕士研究生，将于1997年7月毕业. 主要从事病毒性肝炎的防治研究[山东省济南市文化西路44号. 电话(0531)2952424-556].(收稿 1997-07-10)
, 百拇医药
Protective effect of glycoside of Tripterygium wilfordii on acute experimental hepatic failure in rats
ZHANG Xing-Guo1, LU Min-He1, JIANG Hui-Min2, MA Li-Xian1, LU Tao3, JIA Yi-Tao1 and XU Fu-Yu4
Departments of1Infections Diseases, 2Health Chemistry, 3Biochemistry and 4Pathology, Shandong Medical University, Jinan 250012, Shandong Province, China
, 百拇医药
Subject headings liver failure, acute/zhong yi yao liao fa; Tripterygium wilfordii/therapeutic use; saponins/therapeutic use; disease models, animal
Abstract
AIM To evaluate the protective effect of glycoside of Tripterygium wilfordii (GTW) on experimental acute hepatic failure (AHF).
METHODS Twenty-four Wistar rats were randomly assigned to three groups: control group (n=8), AHF group and GTW protection group, GTW of 25mg/(kg·d) was given ig for 5 days to the GTW-protection group, while only normal saline in equal amount was given to the other groups for 5 days. On the 6th day, AHF and GTW groups were respectively administered with D-GalN of 1.6g/kg, ip after 12 hours fasting. Fourty hours later 30g/L natrii pentobarbitalum (40mg/kg) was given ip for anesthesia. Blood was drawn from the hearts to measure serum ALT, TB and T-cell subsets. The hepatic lesions were evaluated by light and electron microscopy.
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RESULTS Serum amylase (IU/L) and TB levels (μmol/L) were much lower, OX8 cells much higher in GTW group than those in AHF group (359±54 vs 783±58， 47±35 vs 126±67， P<0.01; 43%±4% vs 14%±3%, P<0.05). Mitochondria swelled and injured, enchromatin highly aggregated in the former, but those in the latter were almost normal.
CONCLUSION GTW has a protective action on AHF.
主题词 肝功能衰竭，急性/中医药疗法；雷公藤/治疗应用；皂苷类/治疗应用；疾病模型，动物
, 百拇医药
中国图书资料分类号 R575.3
摘要
目的 探讨雷公藤多甙(GTW)对实验性肝衰竭的保护作用.
方法 雄性Wistar大鼠24只，随机分为对照组(n=8)，急性肝衰竭(AHF)组(n=8)和GTW保护组(n=8). GTW组在实验前5d GTW 25mg/(kg·d)经胃管灌胃，其余两组均以等量生理盐水溶液灌胃. 从第6天开始，AHF组和GTW组均在空腹12h后ip D-GalN 1.6g/kg，注射后40h，以30g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)ip麻醉，心脏抽血测定血清ALT，TB和T淋巴细胞亚群. 同时，在光镜和电镜下观察各组肝组织病理变化.
结果 AHF组ALT(IU/L)和TB(μmol/L)分别为782.8±57.62和125.627±67.027；OX8水平为14.0%±3%. GTW组ALT和TB分别为359±54和47±35；OX8为43%±4%. 两组比较有显著统计学差异(P<0.05或0.01). 同时，前者电镜下线粒体和内质网肿胀、破损，核内染色质凝聚，后者细胞器受损明显减轻.
, 百拇医药
结论 雷公藤多甙对实验性急性肝衰竭具有保护作用.
急性肝衰竭(acute hepatic failure, AHF)凶险，预后严重. 目前认为其发病机理与机体免疫亢进有关. 尚无特效药物治疗. 肾上腺糖皮质激素治疗可能有效，但副作用极大. 本实验观察了AHF动物外周血T淋巴细胞亚群的变化，探讨其在AHF中的发病学意义，并通过雷公藤多甙(glycoside of tripterygium wilfordii hook f, GTW)的防治作用，为临床治疗AHF提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性Wistar大鼠24只，体重250g～350g，由山东省防疫站提供. D-半乳糖胺(D-GalN)由重庆医科大学化学教研室提供，实验前用生理盐水配成100g/L的溶液，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.0. GTW由山东鲁南制药厂生产，用前用生理盐水溶解成25g/L. 抗大鼠T淋巴细胞亚群W3/25，OX8抗原mAb来自英国Serotec公司，4℃保存，用前PBS稀释到1∶20.
, http://www.100md.com
1.2 方法 大鼠实验前禁食12h，自由饮水. 以D-GalN 1.6g/kg ip. 将大鼠24只随机分成3组. 第1组为正常对照组(n=8)；第2组为AHF组(n=8)；第3组为GTW保护组(n=8)：在造成AHF前经胃管灌服GTW 25mg/(kg·d)，共5d. 第1，2组均灌以等量生理盐水. 从第6天开始，继续应用GTW的同时ip D-GalN，注射40h后，以30g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)ip麻醉，心脏穿刺抽血处死动物，取全血1ml，肝素抗凝，应用FACScan流式细胞仪测定T细胞亚群. 余血离心(3000r/min，10min分离血清，-30℃保存，测定血清ALT和TB，同时留取肝脏标本，福尔马林固定，石蜡包埋5μm切片，HE染色. 另在AHF组和GTW组中各取1例，切取1mm×1mm×1mm肝组织，用30g/L戊二醛固定，超薄切片，铅-铀双重染色，H800型透射电镜观察细胞器的超微结构.
统计学处理 所有资料数据均在Foxbase中建立数据库，应用SAS软件进行统计分析，包括方差分析和Student-Newman-Keuls(SNK)法(Q检验)作均数间的两两比较. 用Pearson相关分析法进行相关分析，计算出Pearson相关系数. P≤0.05时认为有显著性差异.
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2 结果
2.1 血清ALT和TB 与对照组比较，AHF组ALT、TB水平均显著升高(P<0.01)；GTW组与AHF组比较，ALT、TB水平均显著降低
(P<0.05，表1).
2.2 外周血T淋巴细胞亚群 与对照组比较，AHF组OX8水平显著降低(P<0.05)；GTW与AHF组比较，OX8水平显著升高(P<0.05)，各组
W3/25水平无显著性差异(P>0.05，表1). 而且OX8细胞水平与ALT和TB水平呈显著负相关(r分别为-0.69732，-0.61321，P<0.01).
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表1 各组血ALT、TB和T细胞亚群(n=8,x±s)
| 组别 | ALT(IU/L) | TB(μmol/L) | OX8(%) | W3/25(%) |
| 正常 | 82±16 | 16±3 | 24±4 | 43±5 |
| AHF | 783±58 | 126±67 | 14±3c | 44±4 |
| GTW | 359±54b | 47±35a | 43±4a | 46±4 |
, 百拇医药 aP<0.05，bP<0.01， vs AHF组；cP<0.05， vs 对照组.
2.3 肝组织病理 光镜观察：AHF组弥漫性肝细胞坏死，大量炎细胞浸润. GTW组肝组织病变明显减轻. 电镜观察：AHF组线粒体和内质网肿胀、破损、消失，核内染色质凝聚(图1)；GTW组细胞器损伤均明显减轻(图2).
图1 AHF组肝细胞线粒体和内质网肿胀、破损、消失，核内染色质高度凝聚、边集(×6400)
图2 GTW组肝细胞病变减轻，细胞器基本完好(×6400)
, 百拇医药
3 讨论
D-GalN为特异性肝毒物，它可与体内磷酸尿苷大量结合后形成稳定的尿苷衍生物，使UTP耗竭，引起RNA、糖蛋白和糖元合成障碍而造成肝细胞损伤[3]. 当肝细胞受损后，由于肝细胞自身抗原的暴露，引发了机体的自身免疫反应，从而促进肝细胞的死亡.
机体的免疫系统是一个复杂的网络系统，其中各种免疫细胞之间存在着十分复杂的联系. 特别是辅助性T细胞(Th)和抑制性T细胞(Ts)之间的比例平衡在免疫反应中起重要作用[4]. 本研究发现，AHF动物外周血T细胞亚群发生紊乱，OX8细胞(即Ts细胞)水平显著降低，而W3/25细胞(即Th细胞)水平无显著性差异，从而导致Th/Ts细胞比值升高. 当Ts细胞的功能低下时，机体免疫系统对自身抗原易于发生免疫应答[5]，造成肝细胞的进一步损伤. 另外，Ts细胞活性降低后，B细胞则可能脱离其控制，造成B细胞的功能亢进，抗体产生过多，导致肝细胞进一步破坏[5]. 故本组动物肝功能和肝细胞损害严重，从而提示，Th/Ts细胞的细微平衡在AHF的发生和发展中起关键作用.
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本研究还发现，GTW保护组Ts细胞活性显著升高，且肝功能损害和肝细胞病变均明显减轻. 相关分析显示，OX8细胞水平与ALT和TB水平呈显著负相关. 表明GTW有改善Th/Ts细胞比例平衡和改善肝功能的作用. GTW是雷公藤根的提取精制品，系非甾体免疫抑制剂，具有与雷公藤相同的药理作用[6]， 但因仅含微量毒性物质二萜类，故其安全范围大大提高[7]. 据报道，GTW对细胞免疫和体液免疫均有较强的抑制作用[8，9]，对Ts细胞具有明显的激活作用[10]. 本研究有相似发现，由于Ts细胞具有抑制Th细胞活性和B细胞产生抗体的作用，故可减轻肝细胞的免疫损伤. 提示GTW用于重症肝炎的防治具有广阔的前景. 本实验从免疫学机理上证实了GTW对大鼠AHF的确有治疗作用.
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4 参考文献
1 沈耕荣，余书文. 重症肝炎. 第1版. 天津：天津科学技术出版社，1990：25
2 沈耕荣，余书文. 重症肝炎. 第1版. 天津：天津科学技术出版社，1990：196
3 Decker K, Keppler D. Galactosamine hepatitis: Rey role of the nucleotide deficicency period in the pathogenesis of cell injury and
cell death. Reviews of physiology. Biochemistry and Parmacology, 1974;71(1):77-106
, 百拇医药
4 沈耕荣，余书文. 重症肝炎. 第1版. 天津：天津科学技术出版社，1990：97
5 王宝恩. 肝脏病学新进展——基础与临床. 第1版. 北京：北京出版社，1996：226
6 何礼芳，朱锡华，黄云辉，等. 雷公藤多甙对家兔急性实验性血清病实验性治疗的研究. 免疫学杂志，1991；7(4)：229-233
7 张晓群，来茶云，张肇和. 雷公藤多甙对小儿哮喘患者T淋巴细胞亚群的影响. 第一军医大学学报，1989；9(2)：102-105
8 Li XW, Weir MR. Radix tripterygium wilfordii A (Chinese herbal medicine) with potent immunosuppresive
properties. Transplantation, 1990;50(1):82-86
9 匡彦德，张骅，秦万章. 雷公藤对IL-2的产生和IL-2受体表达的控制作用. 上海免疫学杂志，1988；8(4)：250-253
10 吴俊，梁晓燕，杨奕，等. 雷公藤对Ly-22. 2+细胞(抑制性T淋巴细胞)的激活作用. 中国病理生理杂志，1996；12(1)：30-31, 百拇医药(张兴国1,5 吕敏和1 姜会敏2 马立宪1 吕 涛3 贾一韬1 许复郁4 )