缺血预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护
山西医科大学第一医院普外科 山西省太原市 030001
作者简介 陈玺华，男，1962-05-23生 ，内蒙古卓资县人，汉族. 1981年山西大同医学专科学校毕业，1997年山西医科大学硕士研究生毕业，主治医师. 主要从事肝胆系统疾病的研究，发表论文4篇[山西省太原市解放南路13号. 电话(0351)4044111-22539].
(收稿 1997-05-29 修回 1997-08-14)
Ischemic preconditioning protects liver from ischemia-reperfusion injury in rats
CHEN Xi-Hua, LI Zheng-Zhong and BAO Min-Sheng
, http://www.100md.com
Department of Surgery, the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Subject headings reperfusion injury/prevention and control; liver/blood supply; ischemia/therapy; disease models, animal
Abstract
AIM Short periods of ischemia can protect tissues against the effects of subsequent prolonged period of ischemia, which is called ischemic preconditioning(IPC). To investigate the action of IPC protection on hepatic ischemia-reperfusion(I/R) injury and its mechanism in rats.
, 百拇医药
METHODS With in situ hepatic I/R injury model, the rats were intraperitoneally injected with L-arginine (L-Arg) 250mg·kg-1 or NG-nitro-L-arginine (L-NNA) 15mg·kg-1 before operation. Nitric oxide (NO) content, ALT, AST activities in serum, NO and LPO contents and SOD activity in liver tissues, hepatic pathology were observed and assayed.
RESULTS LPO content in hepatic tissues and serum ALT, AST activities were significantly lower than those in the I/R group. These protective effects were completely abolished by administration of NO donor (L-Arg) or NO synthase inhibitor (L-NNA). Serum had hepatic NO contents had no changes in each group.
, http://www.100md.com
CONCLUSION IPC protects liver from I/R injury. The mechanism may be inactivation of the oxygen free radicals, and it is unlikely that NO is involved in hepatic ischemic preconditioning.
主题词 再灌注损伤/预防和控制；肝/血液供给；局部缺血/治疗；疾病模型，动物
中国图书资料分类号 R657.3
摘要
目的 反复短时间缺血可保护组织免受随之而来的长时间缺血性损伤，这种现象称之为缺血预处理(IPC). 现探讨IPC在肝脏缺血再灌注(I/R)损伤中的作用及机制.
, 百拇医药
方法 采用大鼠肝脏原位I/R模型，术前腹腔注射L-精氨酸(L-Arg)250mg·kg-1或L-硝基精氨酸(L-NNA)15mg·kg-1，分别观察血一氧化氮(NO)，ALT，AST；肝组织NO，脂质过氧化物(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)及肝组织病理损伤.
结果 肝组织LPO含量(多少 vs 多少)、血清ALT(多少 vs 多少)、AST(多少 vs 多少)活性明显低于I/R组，IPC显著改善了由I/R引起的肝脏损伤. 这种保护作用完全被NO供体(L-Arg)或NO合酶抑制剂(L-NNA)消除. 同时，各组之间血、肝NO含量无显著差异.
结论 IPC对肝脏I/R损伤呈现出明显的保护作用，其机理是灭活了氧自由基. NO在肝脏IPC中似乎无明显作用.
, http://www.100md.com
缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)，即组织在间断缺血后，不会导致组织损伤的加重，反而会增加组织对缺血的耐受性. 目前，国内外对心肌的IPC研究较多，也有用于脑、小肠和骨骼肌皮瓣的报道. 推测在肝脏中也存在IPC作用，笔者旨在探讨IPC对肝脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤的作用并探索其可能机制.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性Wistar大鼠，体重250g～300g，随机分为8组，每组6只：①Sham组：术中只牵拉分离肝十二指肠韧带；②I/R组：肝脏缺血20min再灌注30min；③IPC1组 ：肝脏缺血1min，再灌注5min，反复3次后再实施I/R；④IPC1 Arg组：术前8h和1h腹腔分别注射L-精氨酸(L-Arg，250mg·kg-1)，以后操作同③；⑤IPC1 NNA组：术前8h和1h腹腔分别注射L-硝基精氨酸(L-NNA，15mg·kg-1)，以后操作同③；⑥IPC5组：肝脏缺血5min，再灌注5min，反复3次后，再实施 I/R；⑦IPC5Arg组：腹腔用药同④，以后操作同⑥；⑧IPC5NNA组：腹腔用药同⑤，以后操作同⑥.
, 百拇医药
1.2 方法 按照卢绮萍等[1]肝脏原位I/R模型，20g/L戊巴比妥(30mg·kg-1)腹腔注射麻醉，上腹正中切口，分离肝十二指肠韧带，用无损伤血管夹夹闭肝动脉、门静脉为缺血，去夹恢复血流为再灌注. 实验结束后，腹主动脉采血测血清NO，ALT和AST. 取肝组织约1mm3，20g/L戊二醛固定，制样电镜观察肝脏细胞超微结构变化. 另取左后叶肝脏40g/L甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察肝组织病理变化. 剩余肝脏用冰生理盐水洗净血液，速置-30℃冰箱保存，待制匀浆测NO，超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化物(LPO).
NO测定 NO在体内的半衰期约3s～5s，很快被氧化成稳定的代谢产物亚硝酸盐和硝酸盐(NO-x)，故NO-x含量可间接反映NO水平. 测定方法为镀铜镉还原法[2].ALT，AST，SOD测定 依照说明书操作，LPO测定用改良八木国夫法.
, http://www.100md.com
统计学处理 结果以x±s表示，所有数据用SASS软件的单因素方差分析在微机上处理.
2 结果
2.1 生物化学 ①I/R组两种转氨酶活性明显高于Sham组(P<0.01)，IPC1组和IPC5组的转氨酶活性明显低于I/R组(P<0.01)，IPC5组AST活性与IPC1组相比无显著变化，而ALT活性明显低于IPC1组(P<0.01). 施加NO的供体L-Arg或NO合酶抑制剂L-NNA的IPC1及IPC54个组的ALT,AST活性与I/R组无统计学差异(表1).血NO、肝脏组织NO,LPO及SOD：各组之间血、肝组织NO含量均无显著差异，说明短时间肝脏缺血再灌注未能引起NO的变化. 肝组织I/R后，LPO含量高于Sham组(P<0.01)，IPC1组及IPC5组则较I/R组显著降低(P<0.01). 注射L-Arg或L-NNA的IPC1及IPC5的4个组与I/R组之间，LPO含量也无统计学差异. 各组之间肝组织SOD活性无差异(表2).
, http://www.100md.com
表1 各组血清NO含量 及ALT、AST活性(n=6,x±s)
, 百拇医药
bP<0.01, vs Sham组；cP<0.05,dP<0.01, vs I/R组；fP<0.01, vs PC1组.
表2 各组肝组织NO、LPO含量及SOD活性(n=6,x±s)
, 百拇医药
bP<0.01, vs I/R组.
2.2 病理学 光镜下，Sham组肝组织形态正常；I/R组肝细胞、内皮细胞水肿，枯否氏细胞轻度激活；IPC1及IPC5组肝细胞及内皮细胞无水肿；施加L-Arg或L-NNA的IPC1及IPC54个组的病理变化基本同I/R组. 电镜下，可见Sham组肝细胞器分布均匀，线粒体正常. I/R后，线粒体肿胀，基质减少，有空泡样变. IPC1及IPC5组线粒体无明显肿胀，嵴排列整齐. 施加L-Arg或L-NNA的IPC1及IPC54个组，可见线粒体肿胀，基质
减少.
3 讨论
, http://www.100md.com
本实验可见I/R后两种转氨酶活性明显升高；光镜下肝细胞及内皮细胞水肿；电镜下肝细胞线粒体肿胀，基质减少. 说明I/R引起了肝脏损伤. 当实施IPC1及IPC5后ALT,AST活性显著降低，肝细胞及内皮细胞无水肿，线粒体无明显肿胀，嵴排列整齐，说明IPC1及IPC5均可降低I/R对肝细胞的损伤，提示IPC对肝脏具有明显的保护作用. IPC5组的ALT活性明显低于IPC1组，提示IPC5方法对肝脏的保护作用可能优于IPC1方法. IPC的作用机制复杂，参与因素较多，与腺苷、ATP敏感性钾通道、Gi蛋白、蛋白激酶C、NO、线粒体ATP酶、糖酵解及自由基等因素有关[3]. 本结果显示，无论是IPC1Arg组，IPC5Arg组，还是IPC1NNA组、IPC5NNA组，其两种转氨酶活性，光镜下肝脏病理形态变化及肝脏细胞超微结构变化均与I/R组无差别，说明施加L-Arg或L-NNA后均消除了肝脏的IPC作用，加之各组NO含量无显著变化，从而提示我们，NO在肝脏的IPC中可能无显著效应，这可能是由于短时间的缺血再灌注，或缺乏内毒素或细胞因子的刺激，未能引起肝脏大量合成NO所致. 另外，本实验还发现I/R后，肝组织LPO含量明显高于Sham组，说明I/R后氧自由基(OFR)产生增多，导致肝细胞膜脂质过氧化(LP)反应，而损伤肝细胞并使LPO产生增加. 而IPC1和IPC5均显著地降低肝组织LPO含量，表明IPC使OFR产生减少，从而减轻了肝脏细胞膜LP反应，达到保护肝细胞的作用.
, http://www.100md.com
在外科临床上，无论是肝脏损伤、肝脏手术、肝脏移植，还是休克，都不同程度地引起肝脏I/R损伤，甚至引起肝脏功能衰竭. 如何提高肝脏的自我保护能力，调动其内源性保护机制，将是肝脏外科的发展方向之一. 本实验的研究结果，为人类肝脏的IPC效应提供了可靠依据. 进一步阐明肝脏的IPC机理，甚至发展药物预处理，将有着广泛的临床应用价值.
4 参考文献
1 卢绮萍，史陈让，王红，等. 大鼠肝缺血再灌注期间脂质过氧化自由基动态变化及病理改变同步观察. 中华实验外科杂志，1992；9(1)：11-13
2 许岳宏，李爱红，汪晓禾，等. 比色法测定血清亚硝酸盐和硝酸盐及初步临床应用. 临床检验杂志，1996；14(1)：28
3 刘秀华，庞永政，常英姿，等. 蛋白激酶C在大鼠小肠缺血预处理中的作用. 北京医科大学学报，1996；28(2)：86-88, 百拇医药(陈玺华 李正中 鲍民生)
作者简介 陈玺华，男，1962-05-23生 ，内蒙古卓资县人，汉族. 1981年山西大同医学专科学校毕业，1997年山西医科大学硕士研究生毕业，主治医师. 主要从事肝胆系统疾病的研究，发表论文4篇[山西省太原市解放南路13号. 电话(0351)4044111-22539].
(收稿 1997-05-29 修回 1997-08-14)
Ischemic preconditioning protects liver from ischemia-reperfusion injury in rats
CHEN Xi-Hua, LI Zheng-Zhong and BAO Min-Sheng
, http://www.100md.com
Department of Surgery, the First Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Subject headings reperfusion injury/prevention and control; liver/blood supply; ischemia/therapy; disease models, animal
Abstract
AIM Short periods of ischemia can protect tissues against the effects of subsequent prolonged period of ischemia, which is called ischemic preconditioning(IPC). To investigate the action of IPC protection on hepatic ischemia-reperfusion(I/R) injury and its mechanism in rats.
, 百拇医药
METHODS With in situ hepatic I/R injury model, the rats were intraperitoneally injected with L-arginine (L-Arg) 250mg·kg-1 or NG-nitro-L-arginine (L-NNA) 15mg·kg-1 before operation. Nitric oxide (NO) content, ALT, AST activities in serum, NO and LPO contents and SOD activity in liver tissues, hepatic pathology were observed and assayed.
RESULTS LPO content in hepatic tissues and serum ALT, AST activities were significantly lower than those in the I/R group. These protective effects were completely abolished by administration of NO donor (L-Arg) or NO synthase inhibitor (L-NNA). Serum had hepatic NO contents had no changes in each group.
, http://www.100md.com
CONCLUSION IPC protects liver from I/R injury. The mechanism may be inactivation of the oxygen free radicals, and it is unlikely that NO is involved in hepatic ischemic preconditioning.
主题词 再灌注损伤/预防和控制；肝/血液供给；局部缺血/治疗；疾病模型，动物
中国图书资料分类号 R657.3
摘要
目的 反复短时间缺血可保护组织免受随之而来的长时间缺血性损伤，这种现象称之为缺血预处理(IPC). 现探讨IPC在肝脏缺血再灌注(I/R)损伤中的作用及机制.
, 百拇医药
方法 采用大鼠肝脏原位I/R模型，术前腹腔注射L-精氨酸(L-Arg)250mg·kg-1或L-硝基精氨酸(L-NNA)15mg·kg-1，分别观察血一氧化氮(NO)，ALT，AST；肝组织NO，脂质过氧化物(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)及肝组织病理损伤.
结果 肝组织LPO含量(多少 vs 多少)、血清ALT(多少 vs 多少)、AST(多少 vs 多少)活性明显低于I/R组，IPC显著改善了由I/R引起的肝脏损伤. 这种保护作用完全被NO供体(L-Arg)或NO合酶抑制剂(L-NNA)消除. 同时，各组之间血、肝NO含量无显著差异.
结论 IPC对肝脏I/R损伤呈现出明显的保护作用，其机理是灭活了氧自由基. NO在肝脏IPC中似乎无明显作用.
, http://www.100md.com
缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)，即组织在间断缺血后，不会导致组织损伤的加重，反而会增加组织对缺血的耐受性. 目前，国内外对心肌的IPC研究较多，也有用于脑、小肠和骨骼肌皮瓣的报道. 推测在肝脏中也存在IPC作用，笔者旨在探讨IPC对肝脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤的作用并探索其可能机制.
1 材料和方法
1.1 材料 雄性Wistar大鼠，体重250g～300g，随机分为8组，每组6只：①Sham组：术中只牵拉分离肝十二指肠韧带；②I/R组：肝脏缺血20min再灌注30min；③IPC1组 ：肝脏缺血1min，再灌注5min，反复3次后再实施I/R；④IPC1 Arg组：术前8h和1h腹腔分别注射L-精氨酸(L-Arg，250mg·kg-1)，以后操作同③；⑤IPC1 NNA组：术前8h和1h腹腔分别注射L-硝基精氨酸(L-NNA，15mg·kg-1)，以后操作同③；⑥IPC5组：肝脏缺血5min，再灌注5min，反复3次后，再实施 I/R；⑦IPC5Arg组：腹腔用药同④，以后操作同⑥；⑧IPC5NNA组：腹腔用药同⑤，以后操作同⑥.
, 百拇医药
1.2 方法 按照卢绮萍等[1]肝脏原位I/R模型，20g/L戊巴比妥(30mg·kg-1)腹腔注射麻醉，上腹正中切口，分离肝十二指肠韧带，用无损伤血管夹夹闭肝动脉、门静脉为缺血，去夹恢复血流为再灌注. 实验结束后，腹主动脉采血测血清NO，ALT和AST. 取肝组织约1mm3，20g/L戊二醛固定，制样电镜观察肝脏细胞超微结构变化. 另取左后叶肝脏40g/L甲醛固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察肝组织病理变化. 剩余肝脏用冰生理盐水洗净血液，速置-30℃冰箱保存，待制匀浆测NO，超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化物(LPO).
NO测定 NO在体内的半衰期约3s～5s，很快被氧化成稳定的代谢产物亚硝酸盐和硝酸盐(NO-x)，故NO-x含量可间接反映NO水平. 测定方法为镀铜镉还原法[2].ALT，AST，SOD测定 依照说明书操作，LPO测定用改良八木国夫法.
, http://www.100md.com
统计学处理 结果以x±s表示，所有数据用SASS软件的单因素方差分析在微机上处理.
2 结果
2.1 生物化学 ①I/R组两种转氨酶活性明显高于Sham组(P<0.01)，IPC1组和IPC5组的转氨酶活性明显低于I/R组(P<0.01)，IPC5组AST活性与IPC1组相比无显著变化，而ALT活性明显低于IPC1组(P<0.01). 施加NO的供体L-Arg或NO合酶抑制剂L-NNA的IPC1及IPC54个组的ALT,AST活性与I/R组无统计学差异(表1).血NO、肝脏组织NO,LPO及SOD：各组之间血、肝组织NO含量均无显著差异，说明短时间肝脏缺血再灌注未能引起NO的变化. 肝组织I/R后，LPO含量高于Sham组(P<0.01)，IPC1组及IPC5组则较I/R组显著降低(P<0.01). 注射L-Arg或L-NNA的IPC1及IPC5的4个组与I/R组之间，LPO含量也无统计学差异. 各组之间肝组织SOD活性无差异(表2).
, http://www.100md.com
表1 各组血清NO含量 及ALT、AST活性(n=6,x±s)
| Group | ALT(U·L-1) | AST(U·L-1) | NO(μmol·L-1) |
| Sham | 34±13 | 60±13 | 25±8 |
| I/R | 156±11b | 167±40b | 32±9 |
| PC1 | 66±11d | 121±12c | 20±7 |
| PC5 | 46±10d,f | 106±23d | 23±7 |
| PC1Arg | 162±28 | 188±37 | 21±5 |
| PC1NNA | 143±34 | 191±50 | 20±3 |
| PC5Arg | 161±46 | 185±61 | 27±6 |
| PC5NNA | 185±45 | 191±64 | 30±8 |
, 百拇医药
bP<0.01, vs Sham组；cP<0.05,dP<0.01, vs I/R组；fP<0.01, vs PC1组.
表2 各组肝组织NO、LPO含量及SOD活性(n=6,x±s)
| Group | NO(μmol/g) | LPO(μmol/g) | SOD(NU/g) |
| Sham | 208±71 | 386±10b | 8430±1840 |
| I/R | 237±58 | 594±125 | 7290±1350 |
| PC1 | 218±32 | 450±70b | 7870±790 |
| PC5 | 196±85 | 483±115b | 7850±1290 |
| PC1Arg | 222±63 | 490±81 | 7260±1640 |
| PC1NNA | 210±62 | 590±160 | 6840±1650 |
| PC5Arg | 213±79 | 549±116 | 7290±1400 |
| PC5NNA | 201±90 | 527±113 | 6710±420 |
, 百拇医药
bP<0.01, vs I/R组.
2.2 病理学 光镜下，Sham组肝组织形态正常；I/R组肝细胞、内皮细胞水肿，枯否氏细胞轻度激活；IPC1及IPC5组肝细胞及内皮细胞无水肿；施加L-Arg或L-NNA的IPC1及IPC54个组的病理变化基本同I/R组. 电镜下，可见Sham组肝细胞器分布均匀，线粒体正常. I/R后，线粒体肿胀，基质减少，有空泡样变. IPC1及IPC5组线粒体无明显肿胀，嵴排列整齐. 施加L-Arg或L-NNA的IPC1及IPC54个组，可见线粒体肿胀，基质
减少.
3 讨论
, http://www.100md.com
本实验可见I/R后两种转氨酶活性明显升高；光镜下肝细胞及内皮细胞水肿；电镜下肝细胞线粒体肿胀，基质减少. 说明I/R引起了肝脏损伤. 当实施IPC1及IPC5后ALT,AST活性显著降低，肝细胞及内皮细胞无水肿，线粒体无明显肿胀，嵴排列整齐，说明IPC1及IPC5均可降低I/R对肝细胞的损伤，提示IPC对肝脏具有明显的保护作用. IPC5组的ALT活性明显低于IPC1组，提示IPC5方法对肝脏的保护作用可能优于IPC1方法. IPC的作用机制复杂，参与因素较多，与腺苷、ATP敏感性钾通道、Gi蛋白、蛋白激酶C、NO、线粒体ATP酶、糖酵解及自由基等因素有关[3]. 本结果显示，无论是IPC1Arg组，IPC5Arg组，还是IPC1NNA组、IPC5NNA组，其两种转氨酶活性，光镜下肝脏病理形态变化及肝脏细胞超微结构变化均与I/R组无差别，说明施加L-Arg或L-NNA后均消除了肝脏的IPC作用，加之各组NO含量无显著变化，从而提示我们，NO在肝脏的IPC中可能无显著效应，这可能是由于短时间的缺血再灌注，或缺乏内毒素或细胞因子的刺激，未能引起肝脏大量合成NO所致. 另外，本实验还发现I/R后，肝组织LPO含量明显高于Sham组，说明I/R后氧自由基(OFR)产生增多，导致肝细胞膜脂质过氧化(LP)反应，而损伤肝细胞并使LPO产生增加. 而IPC1和IPC5均显著地降低肝组织LPO含量，表明IPC使OFR产生减少，从而减轻了肝脏细胞膜LP反应，达到保护肝细胞的作用.
, http://www.100md.com
在外科临床上，无论是肝脏损伤、肝脏手术、肝脏移植，还是休克，都不同程度地引起肝脏I/R损伤，甚至引起肝脏功能衰竭. 如何提高肝脏的自我保护能力，调动其内源性保护机制，将是肝脏外科的发展方向之一. 本实验的研究结果，为人类肝脏的IPC效应提供了可靠依据. 进一步阐明肝脏的IPC机理，甚至发展药物预处理，将有着广泛的临床应用价值.
4 参考文献
1 卢绮萍，史陈让，王红，等. 大鼠肝缺血再灌注期间脂质过氧化自由基动态变化及病理改变同步观察. 中华实验外科杂志，1992；9(1)：11-13
2 许岳宏，李爱红，汪晓禾，等. 比色法测定血清亚硝酸盐和硝酸盐及初步临床应用. 临床检验杂志，1996；14(1)：28
3 刘秀华，庞永政，常英姿，等. 蛋白激酶C在大鼠小肠缺血预处理中的作用. 北京医科大学学报，1996；28(2)：86-88, 百拇医药(陈玺华 李正中 鲍民生)