PCR诊断幽门螺杆菌感染与多种检测方法的对比
首都医科大学附属北京天坛医院消化科 北京市 100050
项目负责人 朱玉群,首都医科大学附属北京天坛医院消化科 北京市 100050 收稿日期 1997-08-01 接收日期 1997-09-06
Subject headings helicobacter pylori; helicobacter infections/diagnosis; peptic ulcer/microbiology; polymerase chain reaction
主题词 螺杆菌，幽门；螺杆菌感染/诊断；消化性溃疡/微生物学；聚合酶链反应
, 百拇医药
朱玉群, 杨昭徐, 李欣欣. PCR诊断幽门螺杆菌感染与多种检测方法的对比. 华人消化杂志, 1998;6(1):91-92
本文应用多聚酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction, PCR)检测幽门螺杆菌(Hp)，并同步与细菌培养、组织染色及应用ELISA法检测血清抗幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体(抗Hp-U)三种方法对比，探讨在诊断Hp感染中的临床应用.
1 对象和方法
1.1 对象 随机选择1996-05/1996-10间因上消化道不适等症状行内镜检查的患者419例，其中男216例(51.55%)，女203例(48.45%)，男∶女=1.06∶1，年龄15岁～83岁，平均年龄46.8岁±14.6岁.
, 百拇医药
1.2 方法 ①标本采集：每例于内镜检查时均取距幽门5cm区域内胃窦粘膜组织，取材采用一人使用一根活检钳钳取标本的方式，标本分别送PCR、组织学检查和Hp培养，并同期抽取静脉血2ml，自然凝固后分离血清，置于-20℃冰箱保存备用. ②PCR：引物及试剂：引物由北京市新技术应用研究所生化室合成，序列为：5′GAC-CTC-TCT-GAT-TCG-GGA-GG 3′及5′TAA-TGA-CTG-CGA-CTA-ACA-CG 3′，染色体DNA扩增产物大小为109bp. 经预试验灵敏度为0.1pg DNA量，特异性达100%，对其他杆菌及无Hp感染的胃粘膜呈阴性反应. PCR试剂主要选用Promega及华美生物工程公司的产品. DNA模板制备：将胃粘膜组织置于0.5ml的离心管中，加入组织裂解液0.1ml及蛋白酶K 1.0μl，于55℃水浴1.5h，煮沸5min；以15 000r/min，离心5min；取上清液于另一0.5ml的新管中备用. PCR扩增：在20μl的反应体系中加入浓度为0.1μmol/L的引物，Taq DNA聚合酶0.8U，Buffer 15μl(4个dTND浓度各为0.2mmol/L, KCl 50mmol/L, MgCl 1.5mmol/L, Tris HCl 1.5mmol/L, pH 8.3)，及DNA模板5μl，以无菌石蜡油30μl封口. 循环程序为：94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸50s，循环35次，最后一个循环延伸时间为5min. 扩增产物的鉴定：取扩增产物10μl加样于2%琼脂糖凝胶上电泳分离，紫外灯下观察结果. 于约109bp处出现明显的染色体DNA条带，边缘整齐，亮度较强者为阳性，反之为阴性. ③细菌培养：将胃粘膜组织置于小牛血清布氏肉汤运送培养基中送检. 以布氏琼脂培养基为基础，加入脱纤维羊血及联合抗生素，3d后观察结果，并作生化鉴定. ④组织学检查：胃粘膜标本用10%的福尔马林液固定，连续切片，改良Giemsa染色辨认Hp，HE染色做病理学诊断. ⑤酶联免疫吸附试验(ELISA)：Hp尿素酶抗体诊断试剂盒由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所提供. 酶标反应板经Hp尿素酶抗原包被，按说明书要求以一定比例加入稀释的待检血清、标准血清及 阳性和阴性对照血清各0.1ml，所有标本均做双孔；于37℃作用60min，洗板完全后加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A 0.1ml，于37℃反应40min,洗板，各孔加入底物液A及B各 0.1ml，避光显色15min后，每孔加入0.1ml的2m硫酸进行终止. 用酶标仪测定各孔光密度值(OD值). 将待检血清的双孔平均OD值与标准血清的双孔平均OD值比较，≥标准血清者为阳性，反之为阴性.
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统计学处理 χ2检验.
2 结果
2.1 Hp检出率 经PCR扩增、细菌培养及Giemsa染色检出Hp，以其中一项或一项以上阳性者定为Hp感染，Hp的总检出率为67.30%(282/419). 其中十二指肠溃疡(DU)的Hp检出率为95.38%(62/65)，高于其他疾病组(P<0.01)，其他依次为胃溃疡(GU)68.42%(13/19)，慢性胃炎61.92%(200/323)和胃癌58.33%(7/12).
2.2 四种方法检出Hp情况比较 419例患者经PCR扩增检出Hp阳性257例，检出率为61.34%，高于经Giemsa染色的49.88%和Hp培养的29.83%，具显著性差异(P<0.01)，其中组织染色的检出率又高于培养(P<0.01). 应用ELISA检测血清抗Hp-U，其阳性率也高于上述后两项检查(P<0.025～0.01)，但与PCR法比较无差异. 若以细菌培养及组织染色作为参照方法，评价PCR方法，二者之一阳性定为Hp感染，可见在参照法Hp阳性组，PCR阳性率为96.80%，而在参照法Hp阴性组，有45人(22.5%)经PCR扩增诊断为Hp感染.
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2.3 抗Hp-U测定 用ELISA法测定血清抗Hp-U，结果显示血清抗Hp-U的总阳性率为58.47%(245/419)，其中在Hp感染组(PCR、培养及染色三者之一阳性)，抗体检出率为77.66%，明显高于非感染组的18.98%，具统计学意义(P<0.01).
3 讨论
研究表明，Hp感染与消化性溃疡(PU)，特别是DU的发病密切相关，并且与慢性胃炎和胃癌等疾病的发生也有一定的关系[1-3]，最近WHO已将其列为一级致癌菌. 本文结果显示了在有消化不良症状的患者中，Hp的检出率为67.30%，其中DU的Hp检出率高达95.38%，与文献结果一致，进一步支持上述观点.
诊断Hp感染的方法很多. 近年来，国内外学者将PCR技术用于检测Hp，具有灵敏度高、特异性强、方便快速等特点，可检出相当于1～100个菌的DNA量[4-6]. 国内杨海涛 et al[7]应用巢式PCR技术检测牙斑Hp，灵敏性达0.1fg，我们选用互补于Hp 16SrRNA基因片断的种特异性引物进行PCR扩增，经预试验敏感性达0.1pg(相当于10个Hp菌)，特异性为100%. 经临床对419例有上消化道症状的患者检查，显示其对Hp的检出率明显高于培养和组织染色. 后两种方法已被普遍认为是诊断Hp感染的金标准. 但细菌培养受到培养条件和技术、细菌本身以及服药等因素的影响. Hp在不利的环境下，可发生细胞壁缺陷而变形，使之处于静止和不繁殖状态可能是造成培养检出率低的原因之一. 改良Giemsa染色也受到取材部位，菌量多少和菌体变形等因素的影响. 我们以培养和染色作为参照，对219例Hp阳性的病例，经PCR扩增检出212例阳性，检出率为96.80%；对200例Hp阴性的患者，有45人(22.5%)经PCR检查诊断为Hp感染. 说明PCR法比组织染色及细菌培养更能灵敏地反应体内Hp感染.
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应用PCR技术应注意防止在取材、标本处理和扩增过程造成的污染. 取材时，我们采用一人使用一根活检钳钳取标本，术后用“84消毒液”浸泡刷洗活检钳，然后紫外线下照射30min以上以破坏残留DNA. 实验中严格执行标本处理区与扩增区分开，应用一次性实验用具及严格细致的操作等手段，这些措施可有效地防止污染的发生. 此外，我们在检测中对整块未经研磨的标本直接进行粗提，仍可得到足量DNA模板，获得清晰的特异性扩增带. 不仅使实验步骤简化，也进一步减少了污染的发生.
采用ELISA法同步测定患者血清抗Hp-U水平，显示在Hp非感染组仅有18.98%的患者抗体阳性，明显低于感染组的77.66%；有22.34%的Hp感染患者抗Hp-U阴性. 提示血清学抗体检查可部分地反应体内是否有Hp感染. 由于血清抗体水平的消长需要一定的时间，Hp感染的初期，抗体尚未升高，Hp被根除之后，仍可在体内持续一定的时间. 所以血清抗体检查不能反应Hp的现症感染，由于它具有无创性和可多次重复，适于Hp感染的普查和流行病学调查，或用于不宜内镜的老人、儿童和重症患者的Hp感染的诊断，评价结果时应结合临床. 动态观察抗体水平的递减情况，也可作为抗菌疗效的参考指标.
, 百拇医药
以往报道多将PCR技术用于对Hp的传播途径和致病机制等各种研究. 我们认为，用PCR法诊断Hp感染不仅适于科研，由于它具有比其他方法更高的灵敏性和特异性，并且经济、快速简便，临床上可独立作为诊断Hp感染和观察抗菌药物疗效的常规检测手段，若与细菌培养、组织染色和血清学检查联合应用，可相互印证和提高对Hp感染诊断的正确率. 从卫生经济学角度出发，PCR技术可能比同位素标记的尿素呼吸试验更适合我国国情.
4 参考文献
1 Cover TL,Blaser MJ. Helicobacter pylori and gastrodudenal disease.Annu Rev Med,1992;43(1):135-145
2 Graham DY. Helicobacter pylori: its epidemiology and its role in duodenal ulcer disease. J Gastroenterol Hepatol, 1991;6(1):97-105
, 百拇医药
3 Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogeiman JH, Orentreich N et al. Helicobacter pylori infection and the
risk of gastric carcinoma. N Engl J Med, 1991;325(16):1127-1131
4 Valentine JL, Arthur RR, Harry LT, James DD. Detection of Helicobacter pylori by using the polymerase chain reaction.
J Clin Microbiol,1991;29(4):689-695
5 Clayton CL, Kleanthous H, Coates PJ, Morgan DD, Tabaqchali S. Sensitive detection of Helicobacter pylori by using polymerase
, http://www.100md.com
chain reaction. J Clin Microbiol, 1992;30(1):192-200
6 Ho SA, Hoyle JA, Lewis FA. Direct polymerase chain reaction test for detection of Helicobacter pylori in humans and animals.
J Clin Microbiol,1 991;29(6):2543-2549
7 杨海涛，周殿元，张玉珍. 用巢式聚合酶链反应在牙斑中检出幽门螺杆菌. 中华医学杂志，1993；72(12)：750-752, 百拇医药(朱玉群 杨昭徐 李欣欣)
项目负责人 朱玉群,首都医科大学附属北京天坛医院消化科 北京市 100050 收稿日期 1997-08-01 接收日期 1997-09-06
Subject headings helicobacter pylori; helicobacter infections/diagnosis; peptic ulcer/microbiology; polymerase chain reaction
主题词 螺杆菌，幽门；螺杆菌感染/诊断；消化性溃疡/微生物学；聚合酶链反应
, 百拇医药
朱玉群, 杨昭徐, 李欣欣. PCR诊断幽门螺杆菌感染与多种检测方法的对比. 华人消化杂志, 1998;6(1):91-92
本文应用多聚酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction, PCR)检测幽门螺杆菌(Hp)，并同步与细菌培养、组织染色及应用ELISA法检测血清抗幽门螺杆菌尿素酶IgG抗体(抗Hp-U)三种方法对比，探讨在诊断Hp感染中的临床应用.
1 对象和方法
1.1 对象 随机选择1996-05/1996-10间因上消化道不适等症状行内镜检查的患者419例，其中男216例(51.55%)，女203例(48.45%)，男∶女=1.06∶1，年龄15岁～83岁，平均年龄46.8岁±14.6岁.
, 百拇医药
1.2 方法 ①标本采集：每例于内镜检查时均取距幽门5cm区域内胃窦粘膜组织，取材采用一人使用一根活检钳钳取标本的方式，标本分别送PCR、组织学检查和Hp培养，并同期抽取静脉血2ml，自然凝固后分离血清，置于-20℃冰箱保存备用. ②PCR：引物及试剂：引物由北京市新技术应用研究所生化室合成，序列为：5′GAC-CTC-TCT-GAT-TCG-GGA-GG 3′及5′TAA-TGA-CTG-CGA-CTA-ACA-CG 3′，染色体DNA扩增产物大小为109bp. 经预试验灵敏度为0.1pg DNA量，特异性达100%，对其他杆菌及无Hp感染的胃粘膜呈阴性反应. PCR试剂主要选用Promega及华美生物工程公司的产品. DNA模板制备：将胃粘膜组织置于0.5ml的离心管中，加入组织裂解液0.1ml及蛋白酶K 1.0μl，于55℃水浴1.5h，煮沸5min；以15 000r/min，离心5min；取上清液于另一0.5ml的新管中备用. PCR扩增：在20μl的反应体系中加入浓度为0.1μmol/L的引物，Taq DNA聚合酶0.8U，Buffer 15μl(4个dTND浓度各为0.2mmol/L, KCl 50mmol/L, MgCl 1.5mmol/L, Tris HCl 1.5mmol/L, pH 8.3)，及DNA模板5μl，以无菌石蜡油30μl封口. 循环程序为：94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸50s，循环35次，最后一个循环延伸时间为5min. 扩增产物的鉴定：取扩增产物10μl加样于2%琼脂糖凝胶上电泳分离，紫外灯下观察结果. 于约109bp处出现明显的染色体DNA条带，边缘整齐，亮度较强者为阳性，反之为阴性. ③细菌培养：将胃粘膜组织置于小牛血清布氏肉汤运送培养基中送检. 以布氏琼脂培养基为基础，加入脱纤维羊血及联合抗生素，3d后观察结果，并作生化鉴定. ④组织学检查：胃粘膜标本用10%的福尔马林液固定，连续切片，改良Giemsa染色辨认Hp，HE染色做病理学诊断. ⑤酶联免疫吸附试验(ELISA)：Hp尿素酶抗体诊断试剂盒由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所提供. 酶标反应板经Hp尿素酶抗原包被，按说明书要求以一定比例加入稀释的待检血清、标准血清及 阳性和阴性对照血清各0.1ml，所有标本均做双孔；于37℃作用60min，洗板完全后加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A 0.1ml，于37℃反应40min,洗板，各孔加入底物液A及B各 0.1ml，避光显色15min后，每孔加入0.1ml的2m硫酸进行终止. 用酶标仪测定各孔光密度值(OD值). 将待检血清的双孔平均OD值与标准血清的双孔平均OD值比较，≥标准血清者为阳性，反之为阴性.
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统计学处理 χ2检验.
2 结果
2.1 Hp检出率 经PCR扩增、细菌培养及Giemsa染色检出Hp，以其中一项或一项以上阳性者定为Hp感染，Hp的总检出率为67.30%(282/419). 其中十二指肠溃疡(DU)的Hp检出率为95.38%(62/65)，高于其他疾病组(P<0.01)，其他依次为胃溃疡(GU)68.42%(13/19)，慢性胃炎61.92%(200/323)和胃癌58.33%(7/12).
2.2 四种方法检出Hp情况比较 419例患者经PCR扩增检出Hp阳性257例，检出率为61.34%，高于经Giemsa染色的49.88%和Hp培养的29.83%，具显著性差异(P<0.01)，其中组织染色的检出率又高于培养(P<0.01). 应用ELISA检测血清抗Hp-U，其阳性率也高于上述后两项检查(P<0.025～0.01)，但与PCR法比较无差异. 若以细菌培养及组织染色作为参照方法，评价PCR方法，二者之一阳性定为Hp感染，可见在参照法Hp阳性组，PCR阳性率为96.80%，而在参照法Hp阴性组，有45人(22.5%)经PCR扩增诊断为Hp感染.
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2.3 抗Hp-U测定 用ELISA法测定血清抗Hp-U，结果显示血清抗Hp-U的总阳性率为58.47%(245/419)，其中在Hp感染组(PCR、培养及染色三者之一阳性)，抗体检出率为77.66%，明显高于非感染组的18.98%，具统计学意义(P<0.01).
3 讨论
研究表明，Hp感染与消化性溃疡(PU)，特别是DU的发病密切相关，并且与慢性胃炎和胃癌等疾病的发生也有一定的关系[1-3]，最近WHO已将其列为一级致癌菌. 本文结果显示了在有消化不良症状的患者中，Hp的检出率为67.30%，其中DU的Hp检出率高达95.38%，与文献结果一致，进一步支持上述观点.
诊断Hp感染的方法很多. 近年来，国内外学者将PCR技术用于检测Hp，具有灵敏度高、特异性强、方便快速等特点，可检出相当于1～100个菌的DNA量[4-6]. 国内杨海涛 et al[7]应用巢式PCR技术检测牙斑Hp，灵敏性达0.1fg，我们选用互补于Hp 16SrRNA基因片断的种特异性引物进行PCR扩增，经预试验敏感性达0.1pg(相当于10个Hp菌)，特异性为100%. 经临床对419例有上消化道症状的患者检查，显示其对Hp的检出率明显高于培养和组织染色. 后两种方法已被普遍认为是诊断Hp感染的金标准. 但细菌培养受到培养条件和技术、细菌本身以及服药等因素的影响. Hp在不利的环境下，可发生细胞壁缺陷而变形，使之处于静止和不繁殖状态可能是造成培养检出率低的原因之一. 改良Giemsa染色也受到取材部位，菌量多少和菌体变形等因素的影响. 我们以培养和染色作为参照，对219例Hp阳性的病例，经PCR扩增检出212例阳性，检出率为96.80%；对200例Hp阴性的患者，有45人(22.5%)经PCR检查诊断为Hp感染. 说明PCR法比组织染色及细菌培养更能灵敏地反应体内Hp感染.
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应用PCR技术应注意防止在取材、标本处理和扩增过程造成的污染. 取材时，我们采用一人使用一根活检钳钳取标本，术后用“84消毒液”浸泡刷洗活检钳，然后紫外线下照射30min以上以破坏残留DNA. 实验中严格执行标本处理区与扩增区分开，应用一次性实验用具及严格细致的操作等手段，这些措施可有效地防止污染的发生. 此外，我们在检测中对整块未经研磨的标本直接进行粗提，仍可得到足量DNA模板，获得清晰的特异性扩增带. 不仅使实验步骤简化，也进一步减少了污染的发生.
采用ELISA法同步测定患者血清抗Hp-U水平，显示在Hp非感染组仅有18.98%的患者抗体阳性，明显低于感染组的77.66%；有22.34%的Hp感染患者抗Hp-U阴性. 提示血清学抗体检查可部分地反应体内是否有Hp感染. 由于血清抗体水平的消长需要一定的时间，Hp感染的初期，抗体尚未升高，Hp被根除之后，仍可在体内持续一定的时间. 所以血清抗体检查不能反应Hp的现症感染，由于它具有无创性和可多次重复，适于Hp感染的普查和流行病学调查，或用于不宜内镜的老人、儿童和重症患者的Hp感染的诊断，评价结果时应结合临床. 动态观察抗体水平的递减情况，也可作为抗菌疗效的参考指标.
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以往报道多将PCR技术用于对Hp的传播途径和致病机制等各种研究. 我们认为，用PCR法诊断Hp感染不仅适于科研，由于它具有比其他方法更高的灵敏性和特异性，并且经济、快速简便，临床上可独立作为诊断Hp感染和观察抗菌药物疗效的常规检测手段，若与细菌培养、组织染色和血清学检查联合应用，可相互印证和提高对Hp感染诊断的正确率. 从卫生经济学角度出发，PCR技术可能比同位素标记的尿素呼吸试验更适合我国国情.
4 参考文献
1 Cover TL,Blaser MJ. Helicobacter pylori and gastrodudenal disease.Annu Rev Med,1992;43(1):135-145
2 Graham DY. Helicobacter pylori: its epidemiology and its role in duodenal ulcer disease. J Gastroenterol Hepatol, 1991;6(1):97-105
, 百拇医药
3 Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogeiman JH, Orentreich N et al. Helicobacter pylori infection and the
risk of gastric carcinoma. N Engl J Med, 1991;325(16):1127-1131
4 Valentine JL, Arthur RR, Harry LT, James DD. Detection of Helicobacter pylori by using the polymerase chain reaction.
J Clin Microbiol,1991;29(4):689-695
5 Clayton CL, Kleanthous H, Coates PJ, Morgan DD, Tabaqchali S. Sensitive detection of Helicobacter pylori by using polymerase
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chain reaction. J Clin Microbiol, 1992;30(1):192-200
6 Ho SA, Hoyle JA, Lewis FA. Direct polymerase chain reaction test for detection of Helicobacter pylori in humans and animals.
J Clin Microbiol,1 991;29(6):2543-2549
7 杨海涛，周殿元，张玉珍. 用巢式聚合酶链反应在牙斑中检出幽门螺杆菌. 中华医学杂志，1993；72(12)：750-752, 百拇医药(朱玉群 杨昭徐 李欣欣)