用Fluo-3-Am荧光探针和流式细胞术检测 活性胰腺泡细胞内游离钙离子 刘仁则 秦仁义
同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
项目负责人 刘仁则同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
收稿日期 1997-12-30 接收日期 1998-03-01
Subject headings pancreatilis; pancreas; calcium/analysis; flow cytometry; rats
主题词 胰腺炎；胰腺；钙/分析；流式细胞术；大鼠
1997年我们在参照文献[1，2]的基础上，首次采用流式细胞术检测大鼠胰腺炎时胰腺泡细胞内游离钙离子浓度，报道如下：
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 Fluo-3-Am购自美国Sigma公司；pH 7.35无钙缓冲液：配制见参考文献[1]. 其他试剂均采用分析纯试剂；所有实验器皿均为一次性塑料产品，处理方法见参考文献[1]. 流式细胞仪，型号：FACsort，美国BD公司.
1.2 方法
1.2.1 胰腺泡细胞悬液的制备 取实验大鼠胰腺组织约3g，剪碎，用无钙缓冲液反复冲洗，1000r/min，离心5min， 弃上清，再用200目分子筛过滤，滤液加入0.3%的盐水2ml，立即上下颠倒混匀，马上加入1.5%的盐水2ml，混匀后经500r/min离心5min，弃上清，反复如此离心3次. 收集胰腺泡细胞悬浮于无钙缓冲液中，调整细胞浓度为5×105个/ml备用. FDA染色胰腺泡细胞，在荧光显微镜下观察细胞存活率.
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1.2.2 单个活性胰腺泡细胞内钙离子浓度的检测 ①荧光探针导入：取胰腺泡细胞悬液2ml，加Fluo-3-Am至10μmol/L，置二氧化碳培养箱中孵育1h，其间轻微振荡3次. ②测定：取出细胞悬液，离心，去掉多余的染料. 再用无钙缓冲液反复洗涤3次，最后用无钙缓冲液稀释至2ml，于流式细胞仪上检测，激发波长488nm，随机测定单个胰腺泡细胞的荧光强度值，取10万个胰腺泡细胞的荧光强度值的平均值为每份标本的测定值.
统计学处理 所有测定数据均用流式细胞仪自身的数据处理系统进行处理.
2 结果
①胰腺泡细胞的状态和活性测定：经用上述方法处理后的胰腺泡细胞分散较好，FDA检测细胞活性在90%左右. ②Fluo-3-Am的标记时间和温度：流式细胞术测定是在活的细胞中进行，标记温度以符合细胞培养条件为宜(5% CO2，37℃)；标记时间在30min～2h之间，对细胞的荧光强度值基本无影响；细胞形态无明显变化. ③活性胰腺泡细胞和失活胰腺泡细胞的荧光本底：活性胰腺泡细胞自身本底荧光相对比较微弱；失活胰腺泡细胞由于细胞膜受损，染料外泄，荧光强度也较低，在测定过程中通过测定区域的选择可以避免其对测定的影响，故对流式细胞术的测定无明显影响. ④几种胰腺炎模型大鼠胰腺泡细胞内游离钙离子荧光强度值表1.
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表1 胰腺泡细胞内Ca2+浓度荧光值
A：胰胆管结扎组SD大鼠胰腺泡细胞内Ca2+浓度荧光值；B：CCK-OP静脉输注组SD大鼠胰腺泡细胞内Ca2+浓度荧光值；C：对照组SD大鼠胰腺泡细胞内Ca2+浓度荧光值.
3 讨论
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Fluo-3-Am为一新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，可以灵敏地反映细胞内游离钙离子浓度的变化，Fluo-3-Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶的Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比[2].
流式细胞术是一种高灵敏度的自动分析细胞的高新技术，快速而大量地检测单个细胞是它的一大特点. 用流式细胞术可以摈弃原子吸收光谱法测定组织钙不能区别细胞内外Ca2+含量之不足，也不似其他方法操作过于繁杂. 由于流式细胞术一次测量细胞数量大，故测定结果较为准确，误差小. 更由于在活的细胞中进行测定，极有助于生命科学中Ca2+的研究. 但在测定过程中应注意以下几点：①实验器皿选用不析Ca2+的塑料制品，所用试剂选用超纯水配制，以减少本底误差. ②严格控制细胞浓度：细胞浓度太大，容易阻塞仪器；细胞浓度太小，浪费试剂. ③本实验除去细胞碎片极为关键. 在低速洗涤细胞时，速度应从严掌握. 流式细胞术所用细胞总量并不大，碎片过多，易造成仪器计数困难，也为划定测量区域造成困难.
4 参考文献
1 卢绮萍，史陈让，吴笑春，蔡逊，孙天恩，周平. 用Fluo-2和显微荧光术定量检测活性肝细胞内游离钙离子. 中国病理生理杂志，1996；12(4)：446-448
2 宋平根，李素文主编. 流式细胞术的原理和应用. 北京：北京师范大学出版社，1992：78-84, http://www.100md.com(用Fluo-3-Am荧光探针和流式细胞术检测 活性胰腺泡细胞内游离钙离子 刘仁则 秦仁义)
项目负责人 刘仁则同济医科大学附属同济医院外科 湖北省武汉市 430030
收稿日期 1997-12-30 接收日期 1998-03-01
Subject headings pancreatilis; pancreas; calcium/analysis; flow cytometry; rats
主题词 胰腺炎；胰腺；钙/分析；流式细胞术；大鼠
1997年我们在参照文献[1，2]的基础上，首次采用流式细胞术检测大鼠胰腺炎时胰腺泡细胞内游离钙离子浓度，报道如下：
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1 材料和方法
1.1 材料 Fluo-3-Am购自美国Sigma公司；pH 7.35无钙缓冲液：配制见参考文献[1]. 其他试剂均采用分析纯试剂；所有实验器皿均为一次性塑料产品，处理方法见参考文献[1]. 流式细胞仪，型号：FACsort，美国BD公司.
1.2 方法
1.2.1 胰腺泡细胞悬液的制备 取实验大鼠胰腺组织约3g，剪碎，用无钙缓冲液反复冲洗，1000r/min，离心5min， 弃上清，再用200目分子筛过滤，滤液加入0.3%的盐水2ml，立即上下颠倒混匀，马上加入1.5%的盐水2ml，混匀后经500r/min离心5min，弃上清，反复如此离心3次. 收集胰腺泡细胞悬浮于无钙缓冲液中，调整细胞浓度为5×105个/ml备用. FDA染色胰腺泡细胞，在荧光显微镜下观察细胞存活率.
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1.2.2 单个活性胰腺泡细胞内钙离子浓度的检测 ①荧光探针导入：取胰腺泡细胞悬液2ml，加Fluo-3-Am至10μmol/L，置二氧化碳培养箱中孵育1h，其间轻微振荡3次. ②测定：取出细胞悬液，离心，去掉多余的染料. 再用无钙缓冲液反复洗涤3次，最后用无钙缓冲液稀释至2ml，于流式细胞仪上检测，激发波长488nm，随机测定单个胰腺泡细胞的荧光强度值，取10万个胰腺泡细胞的荧光强度值的平均值为每份标本的测定值.
统计学处理 所有测定数据均用流式细胞仪自身的数据处理系统进行处理.
2 结果
①胰腺泡细胞的状态和活性测定：经用上述方法处理后的胰腺泡细胞分散较好，FDA检测细胞活性在90%左右. ②Fluo-3-Am的标记时间和温度：流式细胞术测定是在活的细胞中进行，标记温度以符合细胞培养条件为宜(5% CO2，37℃)；标记时间在30min～2h之间，对细胞的荧光强度值基本无影响；细胞形态无明显变化. ③活性胰腺泡细胞和失活胰腺泡细胞的荧光本底：活性胰腺泡细胞自身本底荧光相对比较微弱；失活胰腺泡细胞由于细胞膜受损，染料外泄，荧光强度也较低，在测定过程中通过测定区域的选择可以避免其对测定的影响，故对流式细胞术的测定无明显影响. ④几种胰腺炎模型大鼠胰腺泡细胞内游离钙离子荧光强度值表1.
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表1 胰腺泡细胞内Ca2+浓度荧光值
| 组别 | 胰腺泡细胞内Ca2+浓度荧光值 |
| A | 8.58±1.06 |
| B | 5.67±0.98 |
| C | 3.31±0.76 |
A：胰胆管结扎组SD大鼠胰腺泡细胞内Ca2+浓度荧光值；B：CCK-OP静脉输注组SD大鼠胰腺泡细胞内Ca2+浓度荧光值；C：对照组SD大鼠胰腺泡细胞内Ca2+浓度荧光值.
3 讨论
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Fluo-3-Am为一新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，可以灵敏地反映细胞内游离钙离子浓度的变化，Fluo-3-Am进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶的Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比[2].
流式细胞术是一种高灵敏度的自动分析细胞的高新技术，快速而大量地检测单个细胞是它的一大特点. 用流式细胞术可以摈弃原子吸收光谱法测定组织钙不能区别细胞内外Ca2+含量之不足，也不似其他方法操作过于繁杂. 由于流式细胞术一次测量细胞数量大，故测定结果较为准确，误差小. 更由于在活的细胞中进行测定，极有助于生命科学中Ca2+的研究. 但在测定过程中应注意以下几点：①实验器皿选用不析Ca2+的塑料制品，所用试剂选用超纯水配制，以减少本底误差. ②严格控制细胞浓度：细胞浓度太大，容易阻塞仪器；细胞浓度太小，浪费试剂. ③本实验除去细胞碎片极为关键. 在低速洗涤细胞时，速度应从严掌握. 流式细胞术所用细胞总量并不大，碎片过多，易造成仪器计数困难，也为划定测量区域造成困难.
4 参考文献
1 卢绮萍，史陈让，吴笑春，蔡逊，孙天恩，周平. 用Fluo-2和显微荧光术定量检测活性肝细胞内游离钙离子. 中国病理生理杂志，1996；12(4)：446-448
2 宋平根，李素文主编. 流式细胞术的原理和应用. 北京：北京师范大学出版社，1992：78-84, http://www.100md.com(用Fluo-3-Am荧光探针和流式细胞术检测 活性胰腺泡细胞内游离钙离子 刘仁则 秦仁义)